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Un método quirúrgico para establecer un modelo murino de osteoartritis de rodilla mediante un procedimiento de hulth modificado

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DOI:

10.3791/70379

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15 de mayo de 2026

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1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Spine Institute, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of theory and therapy of muscles and bones, Ministry of Education (Shanghai University of Traditional Chinese Medicine), 4School of Traditional Chinese Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe los pasos quirúrgicos refinados del modelo Hulth modificado, proporcionando un método estandarizado y reproducible para inducir la osteoartritis experimental.

Resumen

La osteoartritis de rodilla (KOA) es una enfermedad degenerativa crónica de las articulaciones caracterizada por degeneración del cartílago articular, remodelación ósea subcondral, formación de osteófitos y sinovitis, que es el tipo más común de osteoartritis.

Este protocolo presenta un método quirúrgico para establecer un modelo murino de osteoartritis de rodilla mediante un procedimiento Hulth modificado. En comparación con modelos quirúrgicos inducidos por inyección o convencionales, como la desestabilización del menisco medial (DMM) y la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT), el modelo Hulth modificado induce un inicio temprano de la enfermedad y una inflamación articular más grave. Al seccionar el ligamento colateral medial, el menisco medial y el ligamento cruzado anterior, este método altera la alineación mecánica de la articulación de la rodilla, promoviendo así la progresión de la OA. Este modelo es especialmente adecuado para estudiar la patología aguda de la artrosis y evaluar posibles intervenciones terapéuticas. Para evaluar la gravedad de la artritis, utilizamos ultrasonidos de animales pequeños combinados con reconstrucción tridimensional (3D) de la cavidad articular para cuantificar su volumen y evaluar la acumulación de líquido sinovial. Además, se realizó tinción con safranina-O/verde rápido de secciones histológicas para la puntuación de la Osteoarthritis Research Society International (OARSI) para evaluar la destrucción del cartílago.

Introducción

La osteoartritis de rodilla (OA) es una enfermedad articular crónica y degenerativa común, caracterizada clínicamente por dolor, rigidez, rango de movimiento limitado y debilidad muscular alrededor de la rodilla. Su prevalencia es mayor en mujeres que en hombres. Si no se controla adecuadamente, la artrosis puede provocar una pérdida progresiva de capacidad física, alteraciones del sueño, fatiga crónica y, eventualmente, discapacidad. A medida que la población mundial envejece, la incidencia de la artrosis de rodilla sigue aumentando, lo que supone un desafío considerable para los sistemas sanitarios y las economías de todo elmundo.

Fisiopatología, la pérdida de cartílago representa la característica central de la artrosis, acompañada de un deterioro estructural y funcional de toda la articulación y los tejidos periarticulares. Para dilucidar los mecanismos de la enfermedad y evaluar intervenciones terapéuticas, se han desarrollado diversos modelos animales que recapitulan aspectos clave de la artrosi humana. Entre estos, los modelos inducidos quirúrgicamente son los más frecuentes. Como la desestabilización del menisco medial (DMM)3 y la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT)4, alteran la estructura normal de la articulación, lo que provoca degeneración del cartílago y cambios similares a la OA. Alternativamente, los modelos químicos se basan en la inyección intraarticular de agentes que degradan la matriz extracelular (por ejemplo, colagénasa o iodoacetato monosódico), lo que conduce a una rápida muerte de condrocitos y erosión del cartílago 5,6. Mientras que los modelos de inyección suelen lograr la patología final en cuestión de semanas, los modelos quirúrgicos suelen requerir un periodo más largo.

Entre las técnicas quirúrgicas disponibles, seleccionamos y perfeccionamos aún más el modelo Hulth debido a su aparición acelerada deOA 7. Al combinar la transección de los ligamentos cruzado anterior y posterior con la resección del ligamento colateral medial y la meniscectomía total medial, este modelo induce de forma fiable daño cartílago severo y progresivo y alteraciones óseas subcondrales. El corto plazo hasta la falla articular estructural hace que el modelo Hulth modificado sea especialmente adecuado para estudios de artrosis aguda o subaguda, y proponemos que nuestro protocolo optimizado ofrezca una plataforma práctica y reproducible para futuras investigaciones preclínicas.

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Protocolo

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Medicina Tradicional China de Shanghái. Se adquirieron machos C57BL/6 ratones de 6 a 8 semanas y con un peso aproximado de 20 g a proveedores comerciales (véase Tabla de Materiales) (número de aprobación ética: PZSHUTCM2312210005).

1. Cuidados preoperatorios

  1. Permite que los ratones se aclimaten al menos una semana antes de la cirugía.
  2. Esteriliza todos los instrumentos quirúrgicos antes de la cirugía y desinfecta el espacio de trabajo quirúrgico.
  3. Enciende la máquina de anestesia por gases y coloca al ratón en una cámara de inducción durante 5 minutos usando isoflurano al 2-3% para iniciar la anestesia general.
    NOTA: Asegúrese de que el caudal de oxígeno se mantenga entre 0,5 NL/min y 1 NL/min.
  4. Una vez anestesiado, transfiere al ratón a la plataforma quirúrgica y mantenga la anestesia usando isoflurano al 1-1,5% mediante una mascarilla hasta la finalización de la cirugía (isoflurano al 1-1,5%).
  5. Coloca al ratón en posición supina con las articulaciones de las rodillas hacia arriba, asegurando estabilidad y acceso adecuado al lugar quirúrgico.
  6. Confirma la profundidad de la anestesia comprobando la ausencia de reflejos y luego aplica crema depilatoria para eliminar completamente el vello alrededor de la articulación de la rodilla.
  7. Retira cuidadosamente la crema residual usando gasas o hisopos de algodón, luego desinfecta primero la piel expuesta con etanol al 75%, seguido de la tintura de yodo para asegurar condiciones asépticas.

2. Procedimiento quirúrgico (Figura 1)

  1. Extiende la extremidad trasera del ratón y aplica tracción para tensar la piel. Realizar una incisión longitudinal de 0,5-1 cm a lo largo de la parte medial de la articulación de la rodilla derecha utilizando una hoja quirúrgica estéril.
    NOTA: Todos los procedimientos quirúrgicos descritos a continuación se realizaron bajo un microscopio quirúrgico.
  2. Retrae la piel y realiza una disección roma de la fascia subyacente para exponer completamente la cápsula articular y visualiza el ligamento rotuliano.
  3. Examinar e incisar la fascia que cubre el ligamento colateral medial (LCM), utilizando una aguja fina de inyección.
  4. Transecta el LCM usando microtijeras bajo aumento.
  5. Desplaces el ligamento rotuliano con una aguja para exponer el espacio intraarticular e identificar el menisco medial.
  6. Secciona el ligamento meniscotibial medial (MMTL) con microtijeras después del corte, y examina suavemente el tejido con una aguja para confirmar el desprendimiento completo y la movilidad del menisco.
  7. Identificar y seccionar el ligamento cruzado anterior (LCA), procurando evitar daños en el ligamento cruzado posterior (LCP) o en el menisco lateral. Esto suele resultar en un signo positivo en el cajón anterior tras la operación, confirmando la inestabilidad articular.
    NOTA: Prueba de cajón: Antes del cierre de la herida, el fémur se estabilizaba con una mano mientras que el tobillo se sujetaba con la otra, manteniendo la tibia y el fémur en orientación perpendicular. El desplazamiento anteroposterior relativo entre la tibia y el fémur se aplicó manualmente; El movimiento traslacional observable indicó un signo de dibujón positivo, confirmando la ruptura del ligamento cruzado.
  8. Para inducir una osteoartritis más grave, alternativamente, se realiza una transección simultánea tanto del ligamento cruzado anterior (LCA) como del ligamento cruzado posterior (LCP) combinada con meniscectomía medial (TMM) (como en el modelo clásico de Hulth).
    NOTA: Este paso es opcional y puede realizarse según se requiera; si se selecciona, esto constituye el enfoque de modelado del modelo clásico Hulth.

3. Cuidados postoperatorios

  1. Cierra la incisión con suturas de nylon 4-0 y desinfecta el lugar quirúrgico con tintura de yodo.
  2. Coloca al ratón sobre una almohadilla térmica controlada hasta que recupere la conciencia y muestre una respiración y actividad motora normales. Una vez completamente recuperado y sin signos de malestar, devuélvelo a su jaula de origen.
  3. Monitoriza la integridad de las suturas de forma continua durante 3-5 días después de la cirugía. Si observa rotura de sutura, vuelve a anestesiar al ratón y realiza una nueva sutura
  4. Administrar antibióticos intramusculares hasta 3 días tras la cirugía para prevenir infecciones postoperatorias.
    NOTA: Se emplea la administración de antibióticos para la profilaxis contra infecciones postoperatorias. La analgesia postoperatoria se determina por objetivos experimentales; En la investigación sobre la osteoartritis, los analgésicos suelen no reservarse durante la fase aguda para evitar una evaluación terapéutica confusa.
  5. Vigila diariamente el lugar quirúrgico en busca de signos de hinchazón, secreción o inflamación local.
  6. Eutanasia al ratón en el punto final del estudio, siguiendo protocolos aprobados, y disecciona la articulación de la rodilla para análisis histológico o de imagen.
    NOTA: En este paso, adoptamos el protocolo de eutanasia de los animales de experimentación mediante sobredosis de anestesia. Esto se logró mediante la inyección intraperitoneal de solución de sodio pentobarbital a una dosis de >100 mg/kg en ratones.

4. Evaluación del desarrollo de la OA

  1. Antes de la eutanasia, evalúa la inflamación articular y realiza una ecografía para evaluar los cambios estructurales en la articulación de la rodilla. Evalúa el rendimiento motor en el ratón realizando la prueba rotatoria.
    NOTA: Se requiere anestesia con isoflurano para la ecografía en ratones.
  2. Tras la eutanasia, disecciona la articulación de la rodilla y retira cuidadosamente el músculo y la fascia circundantes, preservando la tibia, el peroné y el fémur.
    Fijar las articulaciones y descalcificarlas en una solución de ácido etilendediaminetetraacético (EDTA) al 10% durante al menos 30 días, reemplazando la solución dos veces por semana para asegurar una descalcificación completa.
  3. Incrustar las articulaciones descalcificadas de la rodilla en parafina y preparar secciones sagitales con un grosor de 4μm 8.
  4. Comienza a recoger secciones una vez que el menisco sea claramente visible. Teñe las secciones con safranina O y verde rápido para visualizar la morfología del cartílago y el hueso subcondral. Evalúa la degradación del cartílago utilizando el sistema de puntuaciónOARSI 9 .
  5. Procedimiento de tinción Safranin O-Fast Green (Kit comercial utilizado, véase Tabla de Materiales)
    1. Deparafinización y rehidratación
      1. Desparafiniza secciones en xileno durante 3 minutos, repite 3 veces.
      2. Rehidrata a través de una serie de etanol graduado (100%, 90%, 80%) para eliminar xileno residual, 2 minutos cada uno.
        NOTA: La serie de etanol debe usarse en orden descendente de concentración.
      3. Enjuaga con agua destilada durante 1 minuto y escurre brevemente.
    2. Tinción de hematoxilina de hierro de Weigert
      1. Aplica la solución de trabajo de Weigert en las secciones, tiñe durante 5 minutos.
      2. Enjuaga con agua destilada durante 1 minuto y escurre brevemente.
    3. Diferenciación ácida
      1. Aplica la solución diferenciadora de ácido en secciones durante 15 segundos.
      2. Lávate con agua durante 10 minutos y drena el exceso de agua.
        NOTA: El tiempo de diferenciación es crítico: una diferenciación prolongada evita una mancha verde rápida, mientras que una diferenciación insuficiente resulta en una mancha verde intensa y rápida con mala absorción de safranina
    4. Tinción verde rápida
      1. Aplica solución verde rápida en las secciones durante 5 minutos, drena brevemente.
      2. Aplica una solución ácida débil para eliminar la mancha verde rápida residual durante 15 segundos y drena brevemente.
    5. Tinción de Safranin O
      1. Aplica solución de safranina O en las secciones durante 4,5 minutos.
      2. Transfiere rápidamente secciones al 90% de etanol para eliminar el exceso de safranina O, 2-3 s.
        NOTA: Este paso puede extenderse adecuadamente dependiendo de la intensidad de la tinción de safranina.
    6. Deshidratación y limpieza
      1. Deshidrata las secciones con etanol 100% durante 1 minuto.
      2. Limpia las secciones con xileno para deshidratación completa, 2 minutos, repite 3 veces.
        NOTA: El xileno utilizado en este paso no debe mezclarse con el empleado en la Sección 4.5.1; La contaminación cruzada puede comprometer la calidad de la sección.
    7. Montaje con bálsamo neutro
      1. Coloca secciones en una campana extractora para permitir que el exceso de xileno se evapore.
      2. Retira las secciones, aplica la cantidad adecuada de bálsamo neutro al ejemplar y cubre cuidadosamente con una capa de cobertura.
      3. Examina las secciones bajo un microscopio óptico en busca de burbujas de aire y elimina cuidadosamente cualquier cantidad presente.
      4. Guarda las secciones en una caja deslizante y colócalas en un horno a 60 °C durante 24 horas para asegurar un curado completo del bálsamo neutro.

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Resultados

Se realizaron escaneos longitudinales de la articulación de la rodilla utilizando un sistema de micro-ultrasonido8 con un paso de escaneo de 4 mm y una resolución axial de 0,04 mm. En el día 7 postoperatorio, la reconstrucción 3D reveló un aumento notable en el volumen de cavidades articulares en el grupo modelo en comparación con el grupo simulado (Figura 2A,B). Las pruebas de fatigarotatoria ...

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Discusión

En comparación con otros métodos de modelización quirúrgica, como la desestabilización del menisco medial (DMM) y la transección del ligamento cruzado anterior (ACLT), el modelo de Hulth modificado induce osteoartritis mediante lesión combinada ligamentosa y meniscal. La alteración estructural específica determina las alteraciones en la biomecánica articular a lo largo de diferentes planos. ElACLT 4 compromete la estabilidad rotacional (rotación interna y externa)...

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Divulgaciones

Los autores no declaran intereses en competencia.

Agradecimientos

Este estudio fue financiado por el Plan de Acción para la Innovación en Ciencia y Tecnología en Shanghái (23YF1447900 a CJM), el Programa Chenguang de la Fundación para el Desarrollo Educativo de Shanghái y la Comisión Municipal de Educación de Shanghái (23CGA53 a CJM), y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (U24A6013 a XH).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Jeringuilla de inyección de 1 mL//Especificaciones: 30 G y tiempos; 0,13 mm
Sistema de Imagen de Ultrasonido 3D Vevo 3100ÓpticaVevo 2100Un sistema de imágenes por ultrasonido de alta frecuencia integrado con el software Vevo LAB para análisis de datos.
Sutura de nylon 4-0//
75% etanolShanghai Titan Scientific Co., Ltd.G73537O
C57BL/6J ratones macho (6-8 semanas)Shanghai Jiesijie Laboratory Animal Co., Ltd./
Crema depilatoriaVeetLote: C021123001
Tintura de yodo//
IsofluranoRWD R650-IE
MicropinzasRWD F12013-10
MicrotijerasRWD S11035-08
Kit modificado de Safranin O y Fast Green StainSolarbioG1371
PortaagujasRWD F21001-12
Láminas quirúrgicas (10#)RWD S31010-01
Microscopio quirúrgicoOlimpoSZ61

Referencias

  1. Sharma, L. Osteoarthritis of the Knee. N Engl J Med. 384 (1), 51-59 (2021).
  2. Chen, D., et al. Osteoarthritis: toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Res. 5, 16044(2017).
  3. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  4. Zhou, X., et al. Antioxidant taurine inhibits chondrocyte ferroptosis through upregulation of OGT/Gpx4 signaling in osteoarthritis induced by anterior cruciate ligament transection. J Adv Res. 77, 551-567 (2025).
  5. Jal Janusz, M., et al. Moderation of iodoacetate-induced experimental osteoarthritis in rats by matrix metalloproteinase inhibitors. Osteoarthritis Cartilage. 9 (8), 751-760 (2001).
  6. Meng, X., et al. An impaired healing model of osteochondral defect in papain-induced arthritis. J Orthop Translat. 26, 101-110 (2021).
  7. Rogart, J. N., Barrach, H. J., Chichester, C. O. Articular collagen degradation in the Hulth-Telhag model of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 7 (6), 539-547 (1999).
  8. Xu, H., et al. Utilization of longitudinal ultrasound to quantify joint soft-tissue changes in a mouse model of posttraumatic osteoarthritis. Bone Res. 5, 17012(2017).
  9. Glasson, S. S., Chambers, M. G., Van Den Berg, W. B., Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis Cartilage. 18 (Suppl 3), S17-S23 (2010).
  10. Lubrich, C., Giesler, P., Kipp, M. Motor behavioral deficits in the Cuprizone model: Validity of the rotarod test paradigm. Int J Mol Sci. 23 (19), 11342(2022).
  11. Piel, M. J., Kroin, J. S., van Wijnen, A. J., Kc, R., Im, H. J. Pain assessment in animal models of osteoarthritis. Gene. 537 (2), 184-188 (2014).
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