Artículo de método

Mejora de la absorción del virus adeno-asociado recombinante intestinal mediante una fórmula de medicina tradicional china

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DOI:

10.3791/70413

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24 de abril de 2026

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1Faculty of Traditional Chinese Medicine, Naval Medical University, 2Oncology Department of Traditional Chinese Medicine, Changhai Hospital, Naval Medical University, 3State Key Laboratory of Genetics and Development of Complex Phenotypes, School of Life Sciences, Zhongshan Hospital, Fudan University, 4Shanghai Key Laboratory of Gene Editing and Cell Therapy for Rare Diseases, Engineering Research Center of Gene Technology (Ministry of Education), Fudan University, 5Institutes of Integrative Medicine, Fudan University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para establecer un modelo de saco intestinal evertido para evaluar las interacciones entre la Medicina Tradicional China (MTC) y el virus adenoasociado recombinante (rAAV) durante la absorción intestinal, proporcionando una plataforma ex vivo para optimizar las estrategias de administración de genes orales.

Resumen

La administración oral del virus adenoasociado recombinante (rAAV) tiene un potencial terapéutico significativo, pero está limitada por una absorción intestinal ineficiente. La Medicina Tradicional China (MTC), ampliamente utilizada en formulaciones orales, representa una fuente prometedora de potenciadores de absorción. Sin embargo, sus posibles efectos sobre la captación y transducción del rAAV siguen siendo en gran medida inexplorados. El modelo del saco intestinal evertido proporciona una plataforma cuantitativa ex vivo para investigar estas interacciones. Aquí se presenta un protocolo detallado que utiliza el modelo del saco intestinal evertido para evaluar cuantitativamente la translocación del virus adenoasociado (rAAV) a través del epitelio intestinal y la posterior transducción génica dentro del tejido intestinal bajo condiciones experimentales controladas. Los pasos clave incluyen la extracción de segmentos del intestino delgado de roedores de laboratorio, la transformación de los segmentos para formar sacos y el relleno de cada saco con amortiguador oxigenado. Los sacos evertidos se sumergen en un tampón oxigenado que contiene partículas de rAAV e incuban a 37 °C para permitir la exposición luminal y el transporte del vector. Los análisis finales consisten en muestrear el fluido interno (serosal) para medir partículas de rAAV que han cruzado el epitelio, así como analizar el tejido del saco para expresión de transgenes y determinar la eficiencia de la transducción. Al probar múltiples regiones intestinales, el protocolo proporciona información sobre diferencias específicas de segmento en la captación de rAAV. Además, la inclusión de GZNG, una fórmula clásica de la MTC, durante la incubación permite evaluar su impacto en la captación y transducción de vectores. El enfoque de saco intestinal evertido proporciona una plataforma valiosa para el cribado de serotipos rAAV, potenciadores de entrega e interacciones entre vectores rAAV y componentes de la MTC. Su diseño simple y paralelizable también permite un cribado de alto rendimiento en estudios preclínicos.

Introducción

El virus adenoasociado recombinante (rAAV) representa una plataforma prometedora para la terapia génica sistémica, con tres vías principales de administración actualmente exploradas:inyección intravenosa 1, inyección intraperitoneal2 y administraciónoral 3. Aunque las vías de inyección intravenosa e intraperitoneal han sido ampliamente estudiadas, la administración oral, un enfoque no invasivo, sigue siendo comparativamente poco explorada. La viabilidad de la administración oral de rAAV fue demostrada por primera vez por Xin et al.4, quienes informaron de una transducción exitosa de la mucosa intestinal e inducción de una respuesta inmune anti-VIH tras la administración oral de rAAV2. De manera similar, Hara et al.3,5 demostraron que rAAV/Aβ oral puede transducir la mucosa gastrointestinal y reducir la deposición de amiloides cerebral, mientras que Steel et al.6 encontraron que la vacunación oral demostró supervivencia y inmunidad antitumoral superiores en comparación con la inyección intramuscular. El mismo estudio informó que rAAV6 mostró tropismo intestinal más fuerte que rAAV5. Más allá de aplicaciones vacunales, se ha logrado potencial terapéutico en otros modelos de enfermedad. Ma et al.7 y Hao et al.8 demostraron que el rAAV oral conducía a la supresión tumoral y a la terapia antifibrótica en el hígado y el estómago, respectivamente, tras la transducción gastrointestinal. Huang et al.9 identificaron el serotipo modificado Rec2 como la transducción selectiva del tejido adiposo marrón tras la administración oral, en contraste con el tropismo hepático predominante observado en la administraciónintravenosa 10. A pesar de estos hallazgos pioneros, la investigación sobre la administración oral de rAAV sigue siendo limitada, en parte debido a la falta de sistemas de cribado in vitro para la evaluación a gran escala.

El modelo del saco intestinal evertido, desarrollado por Wilson y Wiseman en1954-11, sigue siendo una valiosa plataforma in vitro para investigar los mecanismos de absorción intestinal de fármacos. A diferencia de otros aparatos simuladores de absorción, este sistema explica de forma única múltiples procesos fisiológicos más allá de la simple difusiónpasiva 12. Esta característica lo hace especialmente ventajoso para el estudio de laMTC 13. Utilizando este sistema, está documentado que los compuestos de la MTC a menudo presentan patrones de absorción intestinal dependientes de segmentos en todo el tracto gastrointestinal. Por ejemplo, un estudio demostró que múltiples alcaloides de Wuwei Qingzhuo San son absorbidos selectivamente en diferentes segmentos intestinales, siendo el yeyuno y el íleon los que muestran la captación másactiva 14. Además, la coadministración de componentes de la MTC puede modular la absorción intestinal. Liao et al.15 informaron que la coadministración con extracto de Radix Angelicae dahuricae mejoró significativamente la absorción intestinal de puerarina, destacando la influencia de las interacciones de la MTC en la absorción segmentaria. Por lo tanto, el modelo del saco intestinal evertido sirve como una herramienta ideal para dilucidar los complejos comportamientos de absorción y las interacciones sinérgicas inherentes a las formulaciones de la MTC y otros fármacos.

Seleccionar un modelo adecuado para la investigación sobre absorción de rAAV requiere una comprensión matizada de los compromisos entre precisión fisiológica, complejidad técnica y capacidad de rendimiento. La siguiente tabla resume los principales modelos experimentales utilizados para estudiar la absorción intestinal.

Este estudio proporciona una prueba de concepto de que el modelo del saco intestinal evertido puede utilizarse para investigar la absorción intestinal de vectores del virus adenoasociado recombinante (rAAV). Ofrece valiosas perspectivas sobre cómo la coadministración de la MTC influye en la absorción intestinal de vectores rAAV, subrayando la necesidad de una mayor caracterización de sus interacciones mecanicistas bajo condiciones fisiológicamente relevantes. Optimizar las estrategias de administración oral mejoradas con la MTC mediante este enfoque puede facilitar el desarrollo de terapias rAAV no invasivas, mejorando así la adherencia y la accesibilidad al tratamiento en el paciente.

Los investigadores deben evaluar el modelo de saco intestinal evertido basándose en los siguientes criterios para asegurarse de que se alinea con sus objetivos experimentales. Las aplicaciones adecuadas incluyen cribado rápido de serotipos, evaluación de adyuvantes/potenciadores y cinética regional, mientras que las aplicaciones y limitaciones inapropiadas incluyen estudios de expresión a largo plazo (>48 h) y farmacología sistémica.

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Protocolo

Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo en estricta conformidad con las directrices aprobadas por el Comité de Ética Animal de la Universidad Médica Naval (aprobación CHEC (A.E)-2025011).

1. Preparación de la solución de Tyrode y soluciones virales

  1. Precondicionamiento de soluciones de Tyrode:
    1. Prepara dos alícuotas de 500 mL de solución de tirodo (pH 7,4) (véase la tabla de materiales).
    2. Enfría una alícuota a 4 °C y calienta la otra a 37 °C.
    3. Haz burbujas a cada alicuota con 95% O₂/5% CO₂.
  2. Preparación de la solución viral:
    1. Añadir AAV9-CMV-EGFP recombinante a la solución de tirodo de 37 °C para lograr una concentración final de 1 x 1011 vg/mL (condición de control).
    2. Para la condición experimental, se complementa la preparación AAV9-CMV-EGFP con una fórmula TCM GZNG (Tabla 2) disuelta en el vehículo hasta una concentración final de 200 mg/mL.
    3. Para el control solo GZNG, añadir GZNG (200 mg/mL) a la solución de Tyrode sin AAV9 CMV-EGFP.
      NOTA: Preparar diluciones virales inmediatamente antes de usarlas para preservar la infectividad. El pH de la solución GZNG es aproximadamente 5,0–6,0.

2. Preparación animal y extracción de tejido intestinal

  1. Ayuno: Ayuna a las ratas Sprague–Dawley de 8 semanas durante 24 horas antes de la cirugía. Asegúrate de tener acceso libre al agua durante este periodo para mantener la hidratación.
    NOTA: El ayuno ayuda a minimizar el contenido intestinal y garantiza una medición precisa de la absorción intestinal durante los experimentos ex vivo .
  2. Revisa la salud de los animales antes del ayuno y asegúrate de que están en buen estado. Excluye del estudio a los animales con signos de angustia o enfermedad.
  3. Administrar pentobarbital sódico (200 mg/kg, intraperitoneal) para inducir anestesia profunda. Verificar que el animal esté completamente anestesiado comprobando la falta de reflejos y respiración constante.
    PRECAUCIÓN: El pentobarbital es una sustancia controlada peligrosa; manipular con guantes y EPI en una campana extractora para evitar el contacto o inhalación de la piel y seguir las directrices institucionales para su eliminación segura y respuesta a emergencias.
  4. Realizar la eutanasia mediante dislocación cervical una vez confirmada la anestesia profunda.
  5. Toma muestras de etanol al 75% en las zonas abdominales y torácicas para desinfectar la piel y reducir la contaminación microbiana durante la cirugía.
  6. Realiza una incisión mediana a lo largo de la zona abdominal con tijeras quirúrgicas estériles para exponer la cavidad peritoneal.
  7. Separa suavemente y expone el estómago y los intestinos. Utiliza una cortina estéril para proteger los tejidos y órganos circundantes durante el procedimiento.
  8. Transecta cuidadosamente el esfínter pilórico para separar el estómago del duodeno proximal. Asegúrate de que el duodeno permanezca intacto para los procedimientos posteriores.
  9. Disecciona el colon distal en la unión recto-anal evitando cualquier daño a los tejidos circundantes.
  10. Libera suavemente las fijaciones mesentéricas del intestino delgado usando pinzas finas o tijeras. Ten cuidado de no estirar ni desgarrar el mesenterio.
  11. Transfiera inmediatamente el intestino delgado intacto a una solución helada de tampón Krebs-Ringer oxigenado (solución de Tyrode, 4 °C).

3. Preparación del saco intestinal evirtido ex vivo

  1. Selecciona los segmentos intestinales de la siguiente manera: un segmento de 8 cm situado a 10 cm distal del pilor fue designado como segmento duodenal.
  2. Recoger un segmento jeyual de 8 cm que comienza 16 cm distal hasta el segmento duodenal.
  3. Obtener un segmento ileal de 8 cm comenzando otros 16 cm distal al segmento jeyunal.
  4. Para el colon, recoge un segmento de 8 cm situado a 5 cm proximal al extremo ciego cecal.
    NOTA: Asegúrese de que el tejido sea elástico e intacto, adecuado para la inversión durante la preparación.
  5. Enjuaga la luz intestinal con una jeringuilla de 2 mL llena de solución de Tyrode helada y oxigenada.
  6. Eliminar el efluente siguiendo los protocolos institucionales de residuos biológicos para mantener la esterilidad y prevenir la contaminación.
    PRECAUCIÓN: Manipular los residuos biológicos utilizando guantes y el equipo de protección adecuado para evitar la exposición a material potencialmente infeccioso. Eliminar todos los residuos biológicos y efluentes siguiendo las directrices institucionales de seguridad contra riesgos biológicos para prevenir la contaminación ambiental.
  7. Inserta el extremo proximal del segmento intestinal sobre una varilla de vidrio pulida de 4 mm. Asegúrate de que la superficie del bastón sea lisa para evitar desgarros mucosos.
  8. Ata el extremo distal del segmento con una sutura de seda 2-0 para asegurar el tejido en la varilla. Confirma que el tejido permanece estable durante la inversión.
  9. Everte suavemente el segmento intestinal deslizando el tejido a lo largo de la varilla hasta que la mucosa quede completamente expuesta. Evita estiramientos o torsiones excesivas para mantener la integridad del tejido.
  10. Inyecte 2 mL de solución de Tirode helada en la luz para comprobar si hay fugas. La fuga aceptable debe ser del <5% en 1 minuto. Si se detecta fuga, ajusta las suturas y verifica la inversión completa de la superficie mucosa.
    NOTA: Realizar la eversión en un ambiente frío para minimizar la degradación enzimática y preservar la viabilidad del tejido.
  11. Inserta un capilar de vidrio de 3 mm de 5 cm de longitud en el extremo abierto del segmento evertido para que sirva como entrada para la perfusión. Avanza suavemente la cánula para evitar desgarros mucosos.
  12. Asegura la cánula con suturas de seda 2-0. Asegúrate de que la cánula permanezca fija en su posición sin colapsar ni obstruir el flujo de fluidos.
  13. Aplica una tensión suave en las suturas para mantener la forma adecuada del saco intestinal. Evita que se doblecen o se torcen, ya que pueden interrumpir la perfusión y alterar los resultados de absorción.
  14. Evita un apretón excesivo, ya que esto podría dañar el tejido o deformar el saco. Mantén una tensión uniforme durante todo el experimento. Examina regularmente el saco evirtado en busca de fugas o daños estructurales. Si la fuga supera el 5%, repara o reemplaza el segmento antes de continuar.

4. Transducción e incubación de los AAV

  1. Colocar cada saco evertido en un tubo cónico de 7 mL que contiene 4 mL de solución oxigenada de tirodo a 37 °C.
  2. Añadir solución viral de la siguiente manera: Control: AAV9-CMV-EGFP solo; Experimental: AAV9-CMV-EGFP + GZNG.
  3. Incubar estáticamente a 37 °C durante 2 horas, durante las cuales una mezcla gaseosa de 95%O 2/5%CO2 fue continuamente burbujeada en la solución.

5. Muestreo, procesamiento de endpoints y análisis

  1. Muestreo temporal
    1. Extrae 50 μL de fluido seroso de cada saco intestinal a 0, 30, 60, 90 y 120 minutos usando una microjeringa calibrada. Asegura un muestreo preciso sin introducir burbujas de aire.
    2. Sustituir inmediatamente el fluido retirado por 50 μL de solución de tirodo precalentada (37 °C) para mantener el equilibrio osmótico y el volumen interno. Minimizar el tiempo entre la retirada y la sustitución para mantener condiciones experimentales consistentes.
      NOTA: Al usar una microjeringa (por ejemplo, la jeringuilla Hamilton), mantenga la esterilidad y maneje con cuidado para evitar daños en la membrana del saco intestinal.
    3. Realiza muestreos puntualmente en cada momento para minimizar la perturbación del entorno de incubación.
  2. Determinación del título del virus
    1. Extrae el ADN total del fluido seroso utilizando un kit de extracción de ADN genómico animal disponible comercialmente según las instrucciones del fabricante.
    2. Realizar la cuantificación absoluta del número de copias del genoma del vector rAAV mediante qPCR. Utilizar un SYBR Green Kit con cebadores ITR. Realizar la amplificación qPCR en una placa estándar de 96 pozos usando un ciclador térmico con las siguientes condiciones de ciclo: Desnaturalización inicial: 95°C durante 10 minutos; Desnaturalización: 95°C durante 15 s; Recocido y extensión: 60°C durante 1 minuto; 40 ciclos en total
    3. Para cuantificar el número de copias del genoma, genera una curva estándar usando diluciones seriadas de plásmidos rAAV-CMVp-gfp (1 ng, 0,1 ng y 0,01 ng). Utilice estas diluciones para calcular el número de copias del genoma viral basándose en sus respectivos valores del umbral de ciclo (Ct).
    4. Determinar el número de copias del genoma del vector en el líquido seosal recogido utilizando la curva estándar. Los resultados se informaron como copias del genoma por cada 100 ng de ADN extraído.
      NOTA: Asegúrese de que todos los reactivos y equipos sean estériles para evitar la contaminación durante la extracción de ADN y el análisis qPCR. Utilice controles apropiados para verificar la precisión de la qPCR, incluyendo controles sin plantilla (NTC) y estándares de plásmidos.
    5. Realizar qPCR en triplicado para cada muestra para asegurar la reproducibilidad y fiabilidad de los resultados.
  3. Procesamiento de tejido terminal
    1. Aspira todo el líquido luminal residual de cada saco intestinal usando una pipeta estéril. Manipula suavemente para evitar la ruptura del tejido.
    2. Enjuaga cada saco tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenga 1% de penicilina–estreptomicina (P/S) para eliminar el medio residual, bacterias e impurezas. Asegura un lavado exhaustivo para mantener la esterilidad para aplicaciones posteriores.
    3. Corta el tejido intestinal en fragmentos de 2mm 3 (2 mm * 2 mm * 0,5 mm) con tijeras quirúrgicas estériles o cuchillas. Mantén los fragmentos de tamaño uniforme para una incubación constante.
    4. Incubar los fragmentos de tejido en 10 mL de DMEM suplementados con 10% FBS y 1% (v/v) P/S a 37 °C durante 48 horas en una incubadora humidificada con 5% de CO₂. El medio de cultivo debe renovarse cada 12 horas durante la incubación.
      NOTA: Este paso mantiene la viabilidad tisular y permite la recuperación celular tras el experimento. Asegúrese de que la mucosa permanezca intacta durante el corte y el lavado. Realice tres lavados completos de PBS para eliminar residuos y contaminantes microbianos. Mantenga una temperatura constante (37 °C) y una alta humedad para apoyar la actividad metabólica y la salud tisular.
      PRECAUCIÓN: Manipula fragmentos de tejido con herramientas estériles y evita el estrés mecánico para preservar la integridad epitelial.
  4. Análisis posteriores a la incubación
    1. Alicuota A (análisis histológico):
      1. Fijar las muestras de tejido en paraformaldehído (PFA) al 4% durante 24 horas a 4 °C para preservar la arquitectura celular.
      2. Tras la fijación, incrustar los tejidos en el compuesto OCT y realizar tinciones de hematoxilina y eosina (H&E) para evaluar la integridad y morfología del tejido.
        PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es un fijador peligroso; manipularlo dentro de una campana extractora utilizando el equipo de protección personal adecuado
    2. Alicuota B (Análisis de fluorescencia y cuantificación del genoma):
      1. Congelar rápidamente el tejido restante en nitrógeno líquido y almacenarlo a -80 °C hasta el procesamiento adicional.
      2. Utiliza las muestras congeladas para microscopía de fluorescencia para detectar la expresión de EGFP, evaluando la eficiencia de la transfección o la captación viral.
      3. Realizar la extracción de ADN seguida de qPCR para determinar el número de copias del genoma viral o la expresión del transgénico.

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Resultados

Este protocolo se utilizó para evaluar la eficiencia de la administración génica mediada por AAV9 en diferentes segmentos del intestino delgado, así como el impacto del tratamiento GZNG en la mejora de la transferencia y expresión génica. Se observaron varios resultados clave, que demostraron tanto la aplicación exitosa del protocolo como cierta variabilidad que puede surgir bajo ciertas condiciones.

La evaluación de la expresión de EGFP mediada por AAV9 media...

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Discusión

En este estudio, se estableció un enfoque novedoso in vitro para evaluar la absorción intestinal de rAAV adaptando el modelo clásico de saco intestinal evertido. Este método permite un análisis segmento específico de la eficiencia de la transducción de AAV a través del intestino delgado bajo condiciones controladas y la evaluación de los efectos sinérgicos entre la MTC y el rAAV. Aquí se discuten los pasos críticos, la resolución de problemas y modificaciones, las limitaciones y...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de interés que declarar.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a todos los colegas y colaboradores que proporcionaron valiosas discusiones y asistencia técnica a lo largo de este estudio. También agradecemos el apoyo institucional que hizo posible este trabajo. Este trabajo fue financiado por la subvención #82474349 de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (a CL).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
DMEMWISENT319-005-CLLíquido, con 4,5 g/L de D-glucosa, con L-glutamina, fenol rojo y piruvato sódico
Cebadores qPCR de la región CDS de EGFPTSINGKEF: 5'-ACTTCTTCAAGTCCGCCATG-3'; R: 5'-TGTCGGCCATGATATAGACG-3'
Suero fetal bovinoWISENT086-550Calidad superior, grado de cultivo celular primario
Penicilina-Estreptomicina (P/S)WISENT450-201-ELEsta solución contiene 10.000 unidades/mL de penicilina y 10.000 micro; g/mL de estreptomicina.
PrimeScript RT Master Mix (Tiempo Real Perfecto)TaKaRaRR036A
Kit universal de extracción de ARN TaKaRa MiniBESTTaKaRa9767
TSINGKE TSE401 ArtiCanCEO SYBR qPCR MixTSINGKETSE401Este producto es adecuado para experimentos cuantitativos de fluorescencia utilizando el método de tinte verde SYBR y es compatible con varios instrumentos de PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real.
TSINGKE TSP202-200 Trelief  Kit de ADN Genómico Animal Hi-PureTSINGKETSP202-200
La solución de TyrodeYuan YeR20268-500mlConsiste principalmente en cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de magnesio, fosfatos, cloruro de calcio, glucosa y HEPES.

Referencias

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