Un protocolo simplificado y robusto para el aislamiento y expansión a largo plazo de células epiteliales endometriales humanas primarias

Summary

El cultivo primario de células epiteliales endometriales humanas (HEECs) es técnicamente complicado. Este protocolo combina la digestión con enzimas mixtas con inhibidor de ROCK (Y-27632) para mejorar la supervivencia y expansión celular manteniendo la identidad epitelial, proporcionando una plataforma sólida para la investigación endometrial y aplicaciones regenerativas.

Abstract

La investigación sobre trastornos endometriales, incluida la hiperplasia endometrial asociada al tamoxifeno, ha estado limitada por la falta de modelos epiteliales in vitro robustos. Los métodos convencionales para aislar células epiteliales endometriales humanas (HEECs) suelen ser ineficientes, técnicamente exigentes y poco escalables. Aquí se describe un protocolo simplificado sin alimentadores que integra la digestión con enzimas mixtas, la lisis de eritrocios y el tratamiento sostenido con inhibidor de ROCK (Y-27632) para permitir un aislamiento y expansión eficientes de los HEECs primarios. La inclusión de Y-27632 es fundamental para mitigar la apoptosis inducida por disociación y mejorar la adhesión celular en etapas tempranas. Este enfoque soporta el paso serial manteniendo la identidad epitelial durante al menos 3 pasajes, con la morfología preservada más allá de 10 pasajes. La caracterización mediante Western blot e inmunofluorescencia confirma una alta expresión de citoqueratina 18 y E-cadherina, con una reducción progresiva de los contaminantes estromales positivos a vimentina bajo condiciones de cultivo selectivo. Al abordar las principales limitaciones técnicas, este método proporciona una fuente fiable y escalable de células epiteliales para estudios mecanicistas, modelización de enfermedades, cribado de fármacos y aplicaciones regenerativas en la investigación endometrial. El flujo de trabajo estandarizado ofrece una alternativa a los complejos sistemas de cocultivo, facilitando un acceso más amplio a modelos celulares primarios de alta calidad.

Introduction

Modelos in vitro fiables son esenciales para avanzar en el estudio de los trastornos endometriales, especialmente aquellos asociados con el tamoxifeno (TAM⁾¹. Aunque la TAM se utiliza ampliamente como terapia endocrina para el cáncer de mama, su actividad parcial de agonistas de estrógenos en el endometrio aumenta notablemente la incidencia de hiperplasia endometrial, pólipos y, en algunos casos, transformación^{maligna 2}. El manejo clínico actual de la patología endometrial asociada al tamoxifeno se basa principalmente en la terapia con progesterona o en la intervención quirúrgica, ambas con limitaciones significativas. El tratamiento con progesterona suele asociarse a efectos adversos como sangrado intermenstrual y aumento de peso, mientras que los enfoques quirúrgicos pueden causar lesiones endometriales irreversibles y comprometer la^{fertilidad 3}. Estas limitaciones subrayan la necesidad de modelos epiteliales robustos que puedan apoyar estudios mecanicistas y ayudar en el desarrollo de estrategias terapéuticas mejoradas. Sin embargo, el progreso en esta área se ha visto principalmente limitado por desafíos técnicos en la obtención de células epiteliales endometriales humanas (HEECs) de alta pureza y expansibles.

Arnold et al. (2001) reportaron trabajos fundamentales en este campo, quienes aislaron poblaciones celulares estromales y epiteliales mediante digestión de colagénasa y filtración secuencial en tamiz, alcanzando una pureza superior al 98% según lo verificado mediante^{inmunotinción 4}. A pesar de su éxito, el método dependía de la digestión con una sola enzima, requería un procesamiento prolongado y se apoyaba en filtración escalonada para eliminar contaminantes estromales y eritrocitarios, lo que hacía que el flujo de trabajo fuera laborioso y difícil de^{estandarizar 4}. Posteriormente, Yokomizo et al. (2002) establecieron un sistema primario de cultivo HEEC a partir de muestras de histerectomía utilizando un cocultivo tridimensional con células estromales^{alimentadoras 5}. Aunque el microambiente basado en alimentadores soportaba parcialmente el crecimiento epitelial, el sistema permitía solo un paso limitado, típicamente no más de cinco pasajes, lo que restringía su utilidad para aplicaciones que requerían una expansión epitelial estable^{y a gran escala 5}.

Para superar estas limitaciones, se desarrolló un protocolo simplificado y altamente reproducible para el aislamiento de HEEC y el cultivo a largo plazo. Guiados por trabajos previos que demostraron que el inhibidor de ROCK Y-27632 mejora notablemente la eficiencia del cultivo primario para queratinocitos humanos, células epiteliales gingivales y células epiteliales mamarias, el mismo principio se aplicó al tejido^{endometrial 6,7,8}. Este enfoque incorpora tres características clave: digestión con enzimas mixtas para promover una disociación eficiente del tejido, un paso esencial de lisis de eritrocitos para reducir la contaminación temprana y facilitar la inserción epitelial, y suplementación continua con Y-27632 para suprimir la apoptosis, apoyar la adhesión y aumentar la capacidad proliferativa. Usando esta estrategia, los HEECs pueden expandirse a lo largo de múltiples conductos manteniendo la morfología epitelial y una alta expresión de CK18 y E-cadherina ^9,10. Cabe destacar que el paso serial durante al menos 3 generaciones no resultó en una deriva fenotípica detectable, demostrando la estabilidad y escalabilidad del sistema de cultivo.

Este método aborda directamente desafíos técnicos de larga duración en el cultivo HEEC primario, incluyendo altos requisitos de entrada tisular, flujos de trabajo complejos, baja reproducibilidad y potencial de expansión limitado. Al preservar la identidad epitelial y las características funcionales durante el paso, el protocolo proporciona una plataforma fiable para la investigación sobre regeneración endometrial, fisiopatología, cribado de fármacos de alto rendimiento e interacciones célula–biomaterial. Al integrar el procesamiento de tejidos con la expansión en serie, este flujo de trabajo estandarizado aborda un cuello de botella de larga data en la biología reproductiva y apoya futuras aplicaciones en ingeniería de tejidos, medicina regenerativa y terapia personalizada.

Este protocolo requiere muestras de tejido frescos, preferiblemente procesadas en un plazo de 24 horas desde la recogida. El rendimiento celular y las características de crecimiento pueden variar según la fuente del tejido, como los pólipos endometriales frente al endometrio normal. Las fuentes comunes de fallo incluyen digestión incompleta de tejidos, contaminación excesiva por eritrocitos o suplementación insuficiente con Y-27632. Aunque el sistema soporta la expansión a través de múltiples conductos, puede ser necesaria una optimización adicional para mantener la estabilidad fenotípica durante el cultivo prolongado.

Protocol

Se obtuvieron muestras frescas de tejido endometrial a partir de muestras de pólipos uterinos resecados quirúrgicamente de pacientes en el Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica China de Zhejiang. Todos los procedimientos se llevaron a cabo conforme a las directrices aprobadas por el Comité de Ética Médica del Primer Hospital Adscrito de la Universidad Médica China de Zhejiang (Protocolo nº 2025-KLS-569-01; aprobado el 14 de septiembre de 2025). La manipulación de las muestras humanas primarias se realizó en un armario de seguridad biológica de Clase II utilizando el equipo de protección personal adecuado, incluyendo batas de laboratorio, guantes y protección ocular. Todos los reactivos enzimáticos se manejaron conforme a las normativas de seguridad institucionales y a las directrices de las Hojas de Datos de Seguridad de Materiales (MSDS).

1. Adquisición de tejido

1. Recoger tejido endometrial fresco de muestras quirúrgicas obtenidas de mujeres adultas. Transfiere el tejido a tubos estériles que contienen 10 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) suplementada con 3% de penicilina/estreptomicina (P/S).
   NOTA: Todo el tejido debe procesarse en un plazo de 24 horas desde la recogida quirúrgica.

2. Pretratamiento de tejidos

1. Agita el tejido en la solución de lavado (Tabla 1) durante dos lavados consecutivos de 2 minutos cada uno para eliminar moco y coágulos sanguíneos.
2. Enjuaga brevemente el tejido con 5 mL de etanol al 75% durante 5 segundos para desinfectar la superficie.
3. Transfiere inmediatamente el tejido a 20 mL de solución de lavado y lava durante dos lavados, cada 5 minutos cada uno, para eliminar el etanol residual.
   NOTA: Como el etanol es inflamable, realiza este paso alejándose de las llamas abiertas y elimina los residuos que contienen etanol según las directrices de seguridad química institucional.

3. Digestión de tejidos y extracción celular

1. Molido de tejidos
   1. Pica el tejido endometrial con dos láminas estériles hasta que se puedan aspirar fragmentos (~2 mm³) a través de una punta de pipeta de 1 mL (unos 10 minutos).
   2. Transfiere el tejido picado a un tubo centrífugo de 50 mL.
2. Digestión enzimática
   1. Añade 10 mL de solución digestiva (Tabla 1) al tubo que contiene los fragmentos de tejido.
   2. Incuba el tubo en un baño maria a 37 °C durante 30 minutos. Sacude suavemente el tubo cada 15 minutos para facilitar la digestión.
   3. Continúa la incubación hasta que los fragmentos de tejido estén visiblemente disociados y la solución parezca turbia debido a las células liberadas.
3. Terminación de la digestión
   1. Añade 10 mL de solución neutralizante para terminar la digestión enzimática.
   2. Mezcla bien pipeteando arriba y abajo aproximadamente 15 veces usando una pipeta P1000 ajustada a 800 μL.
4. Filtración y centrifugación
   1. Filtra la suspensión digerida a través de un filtro de malla de 100 μm.
   2. Centrifugar a 156 × g durante 5 minutos a 25 °C.
5. Lisis de glóbulos rojos (glóbulos rojos)
   1. Aspira cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el pellet.
   2. Resuspende el pellet celular en 2 mL de tampón de lisis de glóbulos rojos preenfriado.
   3. Incubar sobre hielo (aproximadamente 4 °C) durante 3–5 minutos con una agitación suave.
6. Terminación de la lisis
   1. Añade ≥10 mL de PBS o medio completo para detener la reacción de lisis.
   2. Centrifugar a 156 × g durante 5 minutos a 25 °C.

4. Inicio de la cultura primaria

1. Lavado y centrifugación
   1. Aspira cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el pellet.
   2. Resuspende el pellet en 20 mL de solución neutralizante.
   3. Mezcla pipeteando aproximadamente 15 veces.
   4. Centrifugar a 156 × g durante 5 minutos a 25 °C.
2. Resuspensión y siembra
   1. Aspira el sobrenadante.
   2. Resuspende suavemente la pelota celular en 10 mL de medio de cultivo inicial que contenga 10 μM Y-27632, pipeteando lentamente arriba y abajo 8–10 veces con una pipeta de 1 mL.
   3. Placar la suspensión de la celda en una placa de cultivo de 100 mm.
      NOTA: Para una densidad inicial óptima de siembra, seleccione el vaso de cultivo según el rendimiento estimado de la celda. Si el rendimiento esperado es >1 × 10⁶ celdas, se utiliza un plato de 100 mm, y para rendimientos menores, se utiliza un plato de 60 mm. Ajusta el volumen medio en consecuencia (por ejemplo, 10 mL para una antena de 100 mm; 4 mL para una de 60 mm).
3. Condiciones culturales
   1. Incubar el plato a 37 °C en una atmósfera humidificada con un 5% de CO₂.
   2. Sustituye el medio por medio nuevo para cultivo epitelial sin Y-27632 cada 3 días.
      NOTA: Monitorizar la unión y morfología celular; Actualiza el medio cada 2 días una vez que las células empiecen a proliferar.

5. Paso celular

1. Preparación para la tripsinización
   1. Cuando los cultivos alcancen una confluencia del 80%–90%, retira el plato de 100 mm de la incubadora.
   2. Descarta el medio gastado.
   3. Enjuaga las células dos veces con 2 mL de PBS.
   4. Aspira cuidadosamente y elimina cualquier PBS restante.
2. Tripsinización
   1. Añade 2 mL de tripsina al 0,05% al plato.
   2. Haz girar suavemente para asegurar una cobertura uniforme de la capa celular.
   3. Incuba a 37 °C durante 7 minutos.
   4. Examina las células bajo un microscopio (objetivo 40x) para confirmar el desprendimiento.
3. Neutralización y recogida
   1. Añade 8 mL de solución neutralizante para detener la digestión de la tripsina.
   2. Transfiere la suspensión de la celda a un tubo centrífugo de 15 mL.
   3. Pipete aproximadamente 15 veces para obtener una suspensión de celda única.
   4. Centrifugar a 156 × g durante 5 minutos a 25 °C.
4. Resuspensión y resiembra
   1. Aspira el sobrenadante sin alterar el pellet.
   2. Resuspende suavemente el pellet celular en 10 mL de medio epitelial pipeteando aproximadamente 10 veces con una pipeta de 1 mL.
   3. Semilla 1 × 10⁶ células en 10 mL de medio celular epitelial en una nueva placa de 100 mm.
   4. Ajustar la densidad de siembra para promover células individuales aisladas y bien distribuidas o pequeños racimos al día siguiente, evitando el hacinamiento.
5. Mantenimiento posterior al paso
   1. Incubar bajo condiciones estándar de cultivo (37 °C, 5% CO₂).
   2. Observa el cultivo regularmente y reemplaza el medio celular epitelial cada 2 días.
      NOTA: Las células suelen estar listas para aplicaciones aguas abajo tras el primer o segundo paso, una vez que se obtiene una monocapa sana y adherente con confluencia del ≥80%.
      PRECAUCIÓN: Todos los materiales que entraron en contacto con células humanas primarias fueron tratados como posibles riesgos biológicos. Antes de su eliminación o procesamiento adicional, estos materiales se desinfectaron utilizando lejía al 10% en cumplimiento de las directrices de bioseguridad institucional.

Results

El establecimiento exitoso del sistema primario de cultivo HEEC fue confirmado mediante evaluaciones morfológicas, proliferativas y moleculares, como se detalla en la Figura 1. Al combinar digestión con enzimas mixtas, lisis de eritrocitos y un inhibidor de ROCK, este protocolo permitió un aislamiento eficiente y una expansión estable de células epiteliales a partir del tejido endometrial humano.

Las observaciones morfológicas dem...

Discussion

Establecer un modelo in vitro fiable de las células epiteliales endometriales humanas (HEECs) es esencial para investigar la biología y patología^{endometrial 11}. Aunque se han desarrollado varios métodos para el aislamiento HEEC, la mayoría siguen limitados por la complejidad técnica, baja eficiencia y limitado potencial de expansión ^4,5. Muchos protocolos también dependen de capas alimentadoras, q...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dispase	Solarbio	CAS: 42613-33-2	Para el aislamiento de HEECs
Colagenasa Tipo I	Merck	SKU:SCR103	Para el aislamiento de HEECs
100 & micro; Filtro de malla m	Solarbio	431752	Para filtración HEEC
conejo anti CK18	ABCAM	ab133263	Para la tinción por inmunofluorescencia para comprobar el marcador de diferenciación de HEECs
conejo anti CDH1	ABCAM	ab40772	Para la tinción por inmunofluorescencia para comprobar el marcador de diferenciación de HEECs
conejo anti VIM	ABCAM	ab16700	Para la tinción por inmunofluorescencia para comprobar el marcador de diferenciación de HEECs
4% de paraformaldehído	solarbio	P0099	Para la tinción por inmunofluorescencia para comprobar el marcador de diferenciación de HEECs
Incubadora de CO2	Termo Científica	42820906	Para incubación celular
Centrifugadora	Eppendorf	5404HN133048	Centrífuga de celda
Plato de cultivo celular de 100 mm	Corning	430167	Para el cultivo celular
Tubo centrífuga de 50 ml	Corning	430829	Para centrifugación de celdas
Tubos microcentrífugas de 1,5 ml	NIDO	081722CK01	Para la digestión celular
Colador celular	Solarbio	431752	Filtración celular
Solución tamponada con fosfato	Tecono	20201033	Solución de lavado
DMEM	Gibco	8122622	Componente del medio de neutralización
Penicilina/Estreptomicina	Termo Científica	15140-122	Antibióticos
Suero fetal bovino	Gibco	2556132P	Componente del medio de neutralización
0,05% tripsina	Medios basales	K431010	Para HEECs y nbsp; Disociación
Y-27632	Solarbio	IY0040	Inhibidor de ROCK
Buffer de Lisis de Glóbulos Rojos	Solarbio	R1010	Lisis de glóbulos rojos
1% Triton X-100	Termo Científica	HFH10	Permeabilización de membrana
IgG anti-Conejo de Burro	Termo Científica	A32790TR	Anticuerpo secundario
DAPI	Termo Científica	62248	Tinción por ADN
1 x PBST	Solarbio	P1031	Amortiguador de lavado
Medio dedicado para HEECs de primaria	iCell	iCell-f004-002h	Para la cultura de HEEC
Microscopio Confocal Invertido	Zeiss	LSM880	Utilizado para adquirir imágenes de inmunofluorescencia; equipado con 40x
Línea celular MRC-5	iCell	iCell-h146	línea celular de adenocarcinoma endometrial humano; Perfil de STR.
Línea celular de Ishikawa	iCell	iCell-h113	línea celular de adenocarcinoma endometrial humano; Perfil de STR.