Artículo de método

Evaluación de la actividad metabólica de ventrículos de pez cebra regenerador ex vivo mediante un ensayo de flujo extracelular

538 vistas

⸱

DOI:

10.3791/70459

⸱

17 de abril de 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Anatomy and Genetics, University of Oxford, 2Institute of Developmental and Regenerative Medicine, University of Oxford, 3King Faisal Specialist Hospital & Research Centre, 4Department of Chemistry, University of Oxford

En este artículo

Resumen

En este artículo, describimos un protocolo detallado para cuantificar la tasa de consumo de oxígeno y la tasa de acidificación extracelular de los ventrículos de pez cebra adultos ex vivo, con el fin de caracterizar su capacidad metabólica oxidativa y glicolítica.

Resumen

La capacidad del pez cebra para regenerar su corazón durante la adultez se debe en parte a adaptaciones metabólicas. Aunque se ha planteado la hipótesis de que el corazón de pez depende significativamente de la glucólisis, estudios recientes han descubierto un perfil metabólico más complejo en el que el metabolismo oxidativo surge como un componente esencial de la rediferenciación de los cardiomiocitos y la regeneración cardíaca exitosa en etapas avanzadas. En 2025, adoptamos un método de alto rendimiento para evaluar el perfil metabólico de ventrículos enteros de pez cebra ex vivo, utilizando el ensayo Seahorse (ensayo de flujo extracelular). Este método permite una evaluación rápida y en tiempo real de la tasa basal y máxima de consumo de oxígeno (OCR) y de la tasa de acidificación extracelular (ECAR) utilizando la prueba de esfuerzo XF Mito en el analizador Seahorse XFe24. En este artículo, describimos un protocolo detallado para realizar análisis de flujo extracelular en ventrículos enteros de pez cebra. La capacidad de cuantificar la OCR y la ECAR en corazones enteros vivos ex vivo proporcionará la oportunidad de dilucidar el metabolismo cardíaco en momentos críticos durante el desarrollo, la progresión de la enfermedad y la regeneración.

Introducción

A diferencia de los humanos, los peces cebra (Danio rerio) mantienen la capacidad de regenerar tejido cardíaco perdido durante toda su vidaadulta 1. En caso de lesión cardíaca, los cardiomiocitos en la zona de borde de la herida se desdiferencian y reingresan en el ciclocelular 2,3 para restaurar el número de miococos4 y repoblar la herida. Recientemente, se ha reconocido la importancia de la rediferenciación cardiomiocytaria en el procesoregenerativo 5. Ambos procesos están estrechamente regulados por cambios metabólicos en el corazón del pez cebra, con la glucólisis impulsando laproliferación 6,7 y la fosforilación oxidativa (OXPHOS) promoviendola rediferenciación 8. Aunque los métodos farmacológicos y genéticos para manipular el metabolismo están muy extendidos en el campo de la regeneración 6,7, la validación de los efectos metabólicos de esas perturbaciones sigue siendo un reto debido al pequeño tamaño del corazón del pez cebra, que requiere una configuración compleja y personalizada para la canulación 9,10,11 o la agrupación de múltiples corazones para espectrometríade masas 12 o espectroscopía RMN 8, 13.

Para evitar estas limitaciones, recientemente describimos el uso del analizador Seahorse XFe24 para el perfil metabólico de alto rendimiento de ventrículos enteros de pez cebra exvivo 8. El ensayo de flujo extracelular está diseñado para medir la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y la tasa de acidificación extracelular (ECAR) de células, islotes pancreáticos y esferoides. Esto se logra mediante sensores de estado sólido que detectan cambios en la concentración de oxígeno y protones (pH) en el medio que resultan de la utilización de la cadena de transporte de electrones respiratorios en la producción de oxígeno y lactato dependiente de la glucólisis, respectivamente (Figura 1A)14.

El análisis de flujo extracelular puede realizarse en una configuración de placas de 96 pozos (XFe96 y XF Pro), miniplacas de 8 pozos o varias versiones de placas de 24 pozos (XFe24). Aunque las placas de 96 pozos proporcionan un mayor rendimiento, la distancia de trabajo entre el sensor y el fondo del pozo no es adecuada para alojar un ventrículo entero de pez cebra. Además, en el formato de placa de 96 pozos, no hay ninguna disposición para asegurar el ventrículo en el fondo del pozo para evitar que flote en el medio e interfiera con los sensores. Por otro lado, la microplaca de captura de islotes XFe24 fue diseñada originalmente para la caracterización metabólica de islotes pancreáticos primarios y, como resultado, permite la deposición del tejido en el fondo del pozo, que luego se asegura mediante una malla (cuadrícula). Debido al pequeño tamaño del corazón del pez cebra, pudimos adaptar la microplaca de captura de islotes para usarla en los ventrículos del pez cebra, que permanecen asegurados bajo la rejilla durante toda la duración del ensayo.

Para evaluar la capacidad respiratoria mitocondrial, utilizamos la prueba de esfuerzo de Mito, en la que se emplearon cuatro inhibidores de la cadena de transporte de electrones y la sintasa de trifosfato de adenosina (ATP) (Figura 1A). En primer lugar, se adquieren mediciones de referencia del OCR (Figura 1B, magenta). Luego se inyecta oligomicina, un inhibidor complejo del V. La oligomicina inhibe la actividad de la ATP sintasa y, por tanto, conduce a una reducción de la OCR, que se atribuye a la producción de ATP (Figura 1B, verde). El consumo restante de oxígeno es resultado de la respiración no acoplada y del consumo de oxígeno no mitocondrial (Figura 1B, naranja y gris, respectivamente)15. Tras la oligomicina, se inyecta FCCP, que disipa el gradiente de protones a través de la membrana mitocondrial (Figura 1A). En un intento de restaurar el gradiente de protones, las mitocondrias aumentan su consumo de oxígeno hasta su máxima capacidad (Figura 1B, azul). Finalmente, se utiliza una mezcla de rotenona y antimicina A que inhibe los complejos I y III, respectivamente (Figura 1A). Esta combinación de fármacos conduce al apagado total de la actividad de la cadena de transporte de electrones respiratorios mitocondrial debido a la falta de flujo de electrones desde los complejos I y III hacia el complejo IV15. Esto permite medir el consumo de oxígeno no mitocondrial (Figura 1B, gris).

En general, utilizando la microplaca de captura de islotes con la prueba de esfuerzo de Mito, pudimos evaluar rápida y reproducidamente la capacidad metabólica oxidativa y glicolítica de los ventrículos enteros del pez cebra ex vivo. A continuación describimos el protocolo detallado de este procedimiento. Finalmente, mostramos la supervivencia de ventrículos aislados de tipo salvaje ex vivo no lesionados en el analizador de flujo extracelular, y validamos la prueba de esfuerzo de Mito a los 14 días posteriores a la criolesión (dpci) de ventrículos transgénicosde pez cebra 8.

Protocolo

Todos los procedimientos descritos a continuación que involucran animales se llevaron a cabo en cumplimiento con la Ley revisada de Procedimientos Científicos de Animales de 1986 en el Reino Unido y la Directiva 2010/63/UE en Europa, y fueron aprobados por el Comité Central de Cuidado Animal y Revisión Ética de la Universidad de Oxford.

NOTA: Este protocolo se realizó utilizando un analizador Seahorse XFe24 y el medio DMEM Seahorse sin fenol rojo ni bicarbonato.

1. Criolesión cardíaca de pez cebra (opcional)

  1. Obtén la aprobación ética adecuada de la institución local y de las autoridades nacionales antes de iniciar el experimento.
  2. Realizar criolesiones en los corazones de pez cebra como se describióanteriormente 16,17,18.

2. Hidratar el cartucho sensor

  1. Abre el kit de ensayo de flujo extracelular y carga la placa de utilidad de 24 pozos (Figura 2A) pipeteando 500 μL de la solución calibrante por pozo.
  2. Cierra la placa de servicios usando el cartucho sensor y el hidroimpulsor (Figura 2A).
  3. Incubar el cartucho y la placa de utilidad en una incubadora humidificada a 37 °C durante la noche (18–72 h). Mantén la tapa en el cartucho sensor durante toda la incubación.

3. Preparación de las soluciones y medios de medicamentos

  1. Elaborar soluciones estándar de los fármacos: disuelve la oligomicina en dimetilsulfóxido (DMSO) a una concentración de 10 mM, el cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona (FCCP) en DMSO a una concentración de 5 mM, la rotenona en DMSO a una concentración de 10 mM y la antimicina A en etanol a una concentración de 10 mM y almacena en -20 °C si no se usa inmediatamente.
    NOTA: Se recomienda preparar soluciones frescas de oligomicina, rotenona y antimicina cada 2–3 meses, y una solución FCCP cada vez antes de realizar el ensayo.
  2. Prepara la concentración de trabajo de los fármacos (500 μM oligomicina, 300 μM FCCP, 450 μM cada mezcla rotenona/antimicina A) diluyendo la solución original en medios DMEM. Asegúrese de que el volumen final para las concentraciones de trabajo sea de 1,5 mL para oligomicina, 1,65 mL para FCCP y 1,8 mL para rotenona/antimicina A, permitiendo cargar 30 puertos (24 puertos por inhibidor en el cartucho más 6 puertos extra por fármaco para corregir errores de pipeteo).
    NOTA: Aparecerá algo de precipitación en la rotenona/antimicina A, pero tras una buena mezcla, esto se minimizará. Ten en cuenta que las concentraciones mencionadas en 3.2 son 10 veces la concentración final de los fármacos cuando se inyectarán en los pozos.
  3. Preparar el medio DMEM (pH 7,4) para contener 10 mM de glucosa, 1 mM de piruvato y 2 mM de glutamina, y almacenarlo a -20 °C hasta su uso.

4. Encendiendo el analizador de flujo extracelular

  1. Enciende el analizador desde el botón lateral durante la noche antes del ensayo para permitir el equilibrio de temperatura con el entorno.
  2. Enciende el ordenador y abre el software Wave.
  3. Selecciona la prueba de estrés Mito en el software.
  4. Apaga el calentador en la esquina inferior izquierda del software para que la temperatura del analizador baje de 37 °C y alcance los 28–29 °C para acercarse a la temperatura estándar de la críacebra 19.
  5. Establece la estrategia de inyección en la página de definiciones de grupo (en la pestaña de estrategias de inyección ) añadiendo los compuestos que se depositarán en cada puerto desde el catálogo de compuestos. Para la prueba de esfuerzo de Mito, añade oligomicina en el puerto A, FCCP en el puerto B y rotenona/antimicina en el puerto C. Existe la posibilidad de añadir un fármaco más en el puerto D, que no se utiliza en este protocolo.
  6. Elimina todas las demás estrategias prediseñadas que existan en la pestaña de estrategias de inyección una vez definida la estrategia experimental. Especifica los grupos experimentales (por ejemplo, wild-type y mutante) en el lado de Grupos de la página, y especifique la estrategia de inyección que recibirán (la definida en el paso 4.5). Asegúrate de que las estrategias de inyección coincidan entre los grupos y coincidan con la estrategia diseñada.
  7. En la página del mapa de placas , especifica la posición de cada muestra en la placa de 24 pozos haciendo clic en cada grupo y luego en los pozos que contendrán las muestras.
    1. Ten en cuenta que cuatro de los pozos no son adecuados para la deposición de muestras (Figura 2B) y sirven como espacios en blanco que se usarán para la corrección de fondo. Asegúrate de que las muestras de cada grupo estén distribuidas uniformemente a lo largo de la placa para equilibrar posibles sesgos posicionales en mediciones o condiciones ambientales.
  8. En la página del protocolo , elimina la pestaña Control o Experimental si no se utiliza ningún inhibidor adicional distinto a los mencionados anteriormente, y asegúrate de que los puertos de software coincidan con la posición de los fármacos en el cartucho.
  9. El software establece automáticamente 3 ciclos de mezcla, espera y medición por condición. Modificar el número de ciclos a 10 mediciones basales (sin tratar), 3 de oligomicina, 7 de FCCP y 9 de rotenona/antimicina A para permitir trazas estables y que los inhibidores actúen sobre el tejido 3D. Asegúrate de que cada ciclo conste de 3 minutos de mezcla, 2 minutos de espera y 3 minutos de medición.

5. Calibración del analizador

  1. Retira el cartucho y la placa de utilidad de la incubadora humidificada (véanse los pasos 2.1–2.3).
  2. Retira el hidroamplificador y la tapa (Figura 2A) del cartucho y coloca el cartucho sensor sobre la placa de utilidad que contiene el calibrante.
  3. Pipetee suavemente los inhibidores en sus respectivos puertos mientras se toca la pared lateral del puerto con la punta de la pipeta, asegurando un flujo suave del líquido: 50 μL de oligomicina en el puerto A, 55 μL de FCCP en el puerto B y 60 μL de rotenona/antimicina A en el puerto C (Figura 2C).
    1. Ten en cuenta que el líquido solo se mantiene en su lugar por la tensión superficial en el orificio del puerto, así que evita pipetear o pegar el cartucho abruptamente a partir de este paso. Asegúrate de que ningún líquido entre por el puerto del sensor (Figura 2C), ya que esto dañaría el analizador.
  4. Haz clic en iniciar ejecutar en el software, nombra la ejecución y guárdala en el ordenador. En ese punto, la bandeja del analizador se abrirá para colocar el cartucho y la placa de utilidad.
  5. Coloca el cartucho cargado con los fármacos y la placa de utilidad que contiene el calibrante en la bandeja del analizador según el mapa de placas en la bandeja (pozo A1 arriba a la izquierda) y asegúrate de que encaje correctamente. Quita el amplificador de la boca de incendios y la tapa (Figura 2A) de la placa antes de cargarla en la bandeja. No hacerlo dañará el analizador.
  6. Cuando esté listo, indica al software que inicie el ensayo pulsando ejecutar ensayo. En ese momento, el analizador recoge la bandeja cargada e inicia la calibración.
  7. Comienza el aislamiento del corazón (véase los pasos 6.1–6.12). La calibración durará aproximadamente 40 minutos, pero la placa puede mantenerse en el analizador el tiempo que sea necesario para aislar los corazones y colocarlos en la microplaca de captura del islote (Figura 2B,D).

6. Aislar los corazones de pescado y cargarlos en la placa de islote de 24 pozos

  1. Abrir la microplaca de captura del islote y cargar la placa de 24 pozos con 500 μL de DMEM (10 mM de glucosa, 1 mM de piruvato, 2 mM de glutamina) a temperatura ambiente.
  2. Coloca todas las rejillas en una placa de Petri de 35 mm que contiene medios DMEM a temperatura ambiente, asegurando que estén completamente inmersas y libres de grandes burbujas.
  3. Prepara una placa de Petri adicional de 35 mm que contenga DMEM (10 mM de glucosa, 1 mM de piruvato, 2 mM de glutamina) a temperatura ambiente. Esto servirá para enjuagar los corazones al recoger y diseccionar el ventrículo de las aurículas y el bulbo arterioso.
  4. Elimina un pez en un MS-222 de 5 g/L y comprueba la ausencia de reflejos.
  5. Coloca el pez sobre una esponja fijada en una placa de Petri de 92 mm, abre su cavidad cardíaca y disecciona el corazón como se ha descritoanteriormente 16,20.
  6. Enjuaga los corazones en la placa de Petri de 35 mm que contiene DMEM (10 mM de glucosa, 1 mM de piruvanato, 2 mM de glutamina) a temperatura ambiente.
  7. Retira la aurícula y el bulbo arterioso usando las pinzas de la placa de Petri de 35 mm.
  8. Sacude y exprime suavemente el ventrículo para que la sangre se drene de su lumen. No dañes la pared ventricular al lavar el corazón.
  9. Transfiere el corazón a su pozo designado en la microplaca de captura del islote y permite que se hunda hasta el centro del pozo correspondiente según el mapa de placas. Mantén la placa a temperatura ambiente. Incluye todos los ventrículos en el ensayo, incluso si dejan de latir visiblemente.
  10. Repite el proceso con todos los peces disponibles. Si comparamos la actividad metabólica de diferentes grupos experimentales, sugerimos aislar un corazón por grupo en lugar de todos los corazones de un grupo antes de pasar al siguiente. Aunque los corazones pueden sobrevivir al menos 180 minutos en el analizador (Figura 3A), proponemos que el aislamiento ocurra un corazón por grupo a la vez como mejor práctica para asegurar la distribución igual del tiempo en el medio entre grupos.
  11. Una vez que todos los corazones han sido aislados (aproximadamente 60 minutos para una placa de 20 corazones), colócalos en el fondo de los pozos de microplacas de captura de islotes (Figura 2B) y colócalos en el centro del pozo usando pinzas finas (Figura 2D, E).
  12. Usa una pinza para cubrirlos con la rejilla (aproximadamente 20 minutos) (Figura 2D). Asegúrate de que la cuadrícula esté en la orientación correcta (malla orientada hacia abajo hacia el corazón) y que no contenga burbujas grandes, ya que esto podría interferir con las mediciones (Figura 2E).
    1. Una vez que la rejilla esté en posición, usa las pinzas para empujarla desde los bordes hasta que se oiga un leve clic. Asegúrate de no estrellar el corazón con las pinzas a través de la rejilla.

7. Cargar las muestras en el analizador y adquirir mediciones

  1. Una vez que los corazones están encerrados en la microplaca de captura del islote, comprueba en el software que todos los pozos han sido calibrados correctamente, como señalan las marcas verdes en la pantalla del ordenador. Ahora expulsa la placa de utilidad pulsando la bandeja abierta.
    NOTA: El cartucho no será expulsado en este momento, y solo aparecerá la placa de utilidad que contiene el calibrante.
  2. Cambia la placa de utilidad por la microplaca del islote que contiene las muestras en la bandeja del analizador. Asegúrese de que la microplaca del islote esté correctamente posicionada (A1 en la esquina superior izquierda) y que la tapa haya sido retirada. No quitar la tapa dañará el analizador.
  3. Una vez posicionada la placa del islote, instruye al software para que inicie el experimento presionando la placa de celda de carga. Durante aproximadamente los primeros 10 minutos, los sensores realizarán un paso de equilibrio y luego comenzarán las mediciones.
  4. Una vez completado el experimento (aproximadamente 4 horas), se presiona cartucho de expulsión para que la bandeja se abra y se expulse la microplaca y el cartucho del islote.
  5. Quita la microplaca del islote y el cartucho, y presiona hasta que la bandeja se cierre. En este punto, pulsa ver resultados para ver los datos recogidos.
  6. Guarda las mediciones, expórtalas desde el ordenador analizador y súbelas a la interfaz de análisis para análisis y procesamiento adicionales. Esto provocará la excisión de la placa del islote y el cartucho del analizador.
  7. Retira la placa del islote y el cartucho del analizador y cierra el cartucho usando la tapa.
  8. Congela la placa del islote sobre hielo seco o retira los corazones de los pozos (véase el paso 8.2) y almacena a -20 °C si el aislamiento proteico para la normalización (paso 8) no se realiza de inmediato.
  9. Una vez guardados los datos, apaga el software, el analizador y el ordenador.
  10. Sube los datos a la interfaz de analítica y visualízalos seleccionando el gráfico OCR desde la opción de vistas estándar . En la interfaz, visualiza los datos como nivel o tasa OCR y CAR, corrige el fondo en función de los pozos vacíos y selecciona pozos para visualizar haciendo clic en el mapa de placas para que aparezcan o desaparezcan.

8. Aislamiento y cuantificación de proteínas para la normalización

  1. Preparar un ensayo de radioinmunoprecipitación que contiene inhibidor de proteasas (RIPA) disolviendo una pastilla inhibidora de proteasa en 10 mL de tampón RIPA y mezclando bien.
  2. Si no se ha hecho aún (paso 7.8), usando la herramienta de inserción de pantalla de captura de islotes (Figura 2F), retira las rejillas de la placa del islote para liberar los corazones. Quita los corazones con cuidado, ya que podrían quedar atrapados en la cuadrícula. Si es así, usa las pinzas para liberarlas. Si la rejilla no puede retirarse usando la herramienta de inserción de pantalla, mueve la placa bajo el estereoscopio y, usando tijeras de microdisección, corta cuidadosamente la rejilla para liberar el corazón.
  3. Colocar cada ventrículo en un tubo de 1,5 mL que contiene 200 μL de tampón RIPA enriquecido con inhibidor de proteasa sobre hielo.
  4. Homogeneiza el corazón usando un homogeneizador con morteros desechables sobre hielo.
  5. Preparar los estándares diluyendo la albúmina sérica bovina (BSA) proporcionada en el tampón RIPA en las siguientes concentraciones: 2000 μg/mL, 1500 μg/mL, 1000 μg/mL, 750 μg/mL, 500 μg/mL, 250 μg/mL, 125 μg/mL, 25 μg/mL, 0 μg/mL.
  6. Prepara la solución de trabajo Pierce BCA (50:1, reactivo A: reactivo B, según las instrucciones del fabricante). Calcula el volumen de reactivo en funcionamiento necesario usando la siguiente fórmula:
    (número de palas + número de muestras) × 2 × 200 μL
    NOTA: Este volumen permite el uso de 200 μL de solución de trabajo por muestra y estándar, y permite adquirir mediciones duplicadas por muestra y estándar.
  7. En una placa de 96 pozos, añadir 25 μL de cada estándar y de cada muestra por pozo en duplicados.
  8. Añade 200 μL de la solución de trabajo por pozo.
  9. Incuba la placa a 37 °C durante 30 minutos.
  10. Deja que la placa se enfríe a temperatura ambiente durante 10 minutos y sella con un sellador de placas. Asegúrate de que no haya burbujas en los pozos, ya que podrían obstruir el lector de placas. Si se forman un número limitado de burbujas, usa una punta o las pinzas finas para romperlas.
  11. Mide la absorbancia a 562 nm usando un lector de placas.
  12. Genera una curva estándar basada en la absorbancia de los estándares y calcula la concentración de proteínas de las muestras.
  13. Registra la concentración de proteínas en la pestaña de normalización (Figura 2G) de la interfaz analítica para cada pozo.

9. Análisis de datos

  1. Tras normalizar con el contenido de proteínas, exporta los datos desde la interfaz de analítica como archivos Excel o Prism para un análisis adicional usando el botón de la nube en la esquina superior derecha del gráfico.
  2. Utilizando los datos normalizados, calcula el OCR y el ECAR de referencia como la media de las mediciones de base, excluyendo las tres primeras adquisiciones, ya que la señal podría ser inestable en las primeras mediciones.
  3. Utilizando los datos normalizados, para especificar el OCR y ECAR máximos, calcula las mediciones medias de las tres principales adquisiciones del tratamiento FCCP.

Resultados

Este protocolo permite cuantificar el OCR y el ECAR de ventrículos enteros de pez cebra. Validamos la supervivencia de los ventrículos en un entorno ex vivo incubando ventrículos de tipo KCL salvaje no lesionados en el analizador en ausencia de tratamiento farmacológico (Figura 3A). Los datos indican que los ventrículos tienen un OCR y ECAR estables, que están significativamente elevados respecto a las mediciones iniciales de los pozos vacíos durante al menos 180 minutos (Figura 3A). Estos datos sugieren que los ventrículos muestran una función respiratoria normal y supervivencia en este entorno ex vivo .

Realizamos varias mediciones de OCR utilizando diversas concentraciones de fármacos y formulaciones de medios para identificar la dosis óptima para los ventrículos (Figura 3B). Observamos un leve aumento en el cambio de pliegues de OCR (FCCP/basal) al utilizar las combinaciones [oligomicina] 10 μM, [FCCP] 8 μM y [rotenona/antimicina] 25 μM, y un aumento ligeramente mayor en [oligomicina] 50 μM, [FCCP] 30 μM y [rotenona/antimicina] 45 μM (Figura 3B). Como resultado, procedimos con estas últimas concentraciones para nuestros experimentos. Como el ventrículo es una estructura 3D, es posible que los fármacos actúen fuertemente sobre las células externas del tejido sin llegar a las células del lado luminal del ventrículo. Para abordar esto, realizamos un paso de permeabilización en el que tratamos los corazones con saponina al 0,5% durante 30 minutos antes de la incubación en DMEM (10 mM de galactosa, 1 mM de piruvato, 4 mM de glutamina). Esto resultó en una reducción sostenida del TOC y ausencia del aumento esperado de OCR tras la inyección de FCCP (Figura 3C), lo que sugiere que los corazones estaban fallando metabólicamente. En consecuencia, no permeabilizamos los ventrículos para nuestros experimentos.

Además, presentamos aquí las trazas normalizadas de nuestro experimentooriginal 8. Aprovechando la variación natural en el potencial regenerativo de siete cepas de pez cebra silvestres, identificamos que mdh1ab, la deshidrogenasa malato citosólica 1Ab, tiene un efecto beneficioso en la regeneración mediante la rediferenciación de cardiomiocitos. Para validar este hallazgo, producimos pez cebra transgénico que sobreexpresa mdh1ab de manera específica para cardiomiocitos (mdh1ab cOE) y peces control que sobreexpresan proteína fluorescente verde (GFP c OE). Criolesionamos sus ventrículos, los recogimos a 14 dpci e investigamos su metabolismo usando la prueba de esfuerzo de Mito (Figura 3D). El tratamiento con oligomicina no alteró significativamente la OCR, aunque se observó un leve aumento en la REC. La inyección de FCCP en el medio resultó en el aumento esperado de OCR y ECAR, manteniendo las muestras de mdh1ab c OE la mayor capacidad respiratoria máxima (Figura 3D). Finalmente, la rotenonona/antimicina provocó el apagón total del metabolismo en ambos grupos. En general, este método nos permitió identificar diferencias significativas en la capacidad metabólica de los ventrúlios que sobreexpresan mdh1ab y entre siete diferentes cepas de pez cebrasalvaje 8.

figure-results-1
Figura 1: Metabolismo de la glucosa durante una prueba de esfuerzo de Mito. (A) Representación esquemática del metabolismo de la glucosa. La glucosa entra en la célula a través de los transportadores GLUT y se convierte en piruvato mediante glucólisis. La lactato deshidrogenasa (LDH) convierte piruvato en lactato y los protones resultantes se secretan de la célula. El piruvato se convierte en acetil-CoA y entra en el ciclo de mitocondrias y TCA para alimentar la cadena respiratoria de transporte de electrones en la membrana mitocondrial interna. Los inhibidores de los complejos I, III y V, así como el desacoplador FCCP, están señalados en rojo. Los electrones que se transfieren a través de la cadena respiratoria de transporte de electrones se denotan con flechas azules, que finalmente conducen a la conversión de oxígeno y protones en agua. (B) Esquema de resultados de la prueba de estrés de Mito. La respiración basal se observa en magenta. Al inyectarse oligomicina, el OCR disminuye, permitiendo calcular la respiración ligada al ATP (verde) así como la fuga de protones (naranja). La FCCP aumenta el OCR hasta la capacidad respiratoria máxima de las células (azul). La inyección de rotenona y antimicina A provoca el apagón de la respiración mitocondrial y solo permite que se produzca la respiración no mitocondrial (gris). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Disposición de microplacas de captura de cartuchos sensores e islotes. (A) Imagen del complejo cartucho sensor de tapa-hidrorefuerzo y placa de utilidad (arriba) y el cartucho sensor invertido (abajo). Barra de escala: 1 cm. (B) Imagen de una microplaca de captura de islotes cargada con ventrículos de pez cebra. Los círculos rojos indican los pozos en blanco que no contienen ventrículos y servirán como corrección de fondo durante el análisis. Barra de escala: 1cm. (C) Representación esquemática de la disposición del puerto en el cartucho sensor XFe24. El puerto A contiene oligomicina, B contiene FCCP y C contiene la mezcla de rotenona/antimicina. El puerto D puede quedar vacío o añadir un medicamento extra. S indica el puerto del sensor, que no debe contener ningún líquido para no dañar el analizador. (D) Imagen representativa de un ventrículo de pez cebra en el fondo del pozo, rodeado por la cuadrícula (izquierda) y sin cuadrícula (derecha). Barra de escala: 5mm. (E) Sección transversal esquemática de la microplaca de captura del islote que contiene un ventrículo, la rejilla (amarilla) y el cartucho sensor (verde). P denota los puertos y S el sensor. La línea ondulada representa el medio. (F) La herramienta de inserción de pantalla de captura de islotes. Barra de escala: 1 cm. (G) Icono de pestaña de normalización en la interfaz de analítica. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

figure-results-3
Figura 3: Mediciones representativas de OCR y ECAR de ventrículos de pez cebra. (A) Trazas representativas de OCR y ECAR de ventrículos salvajes de pez cebra no lesionados (cepa KCL) que no han sido tratados con los inhibidores utilizados en el ensayo (n = 2, línea roja). Las trazas resultantes de pozos vacíos que no contienen material biológico se presentan en gris (n = 4); OCR, medidas repetidas bidireccionales ANOVA, factor de tiempo P = 0,0200, interacción tiempo × pozo P = 0,0196, factor de pozo P < 0,0001, factor de grupo P < 0,0001; ECAR medidas repetidas bidireccionales ANOVA, factor de tiempo P = 0,1323, tiempo × interacción de pozo P = 0,0216, factor de pozo P = 0,0009, factor de grupo P<0,0001; los datos presentados como media ± SEM. (B) Cambio en el plegamiento del OCR según diversas concentraciones de fármacos y medios utilizados. ANOVA unidireccional (P = 0,0032) con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. [O] 5 μM, [F] 4 μM, [RA] 2 μM, n = 6; [O] 10 μM, [F] 8 μM, [RA] 25 μM, n = 8; [O] 25 μM, [F] 16 μM, [RA] 45 μM, n = 8; [O] 50 μM, [F] 30 μM, [RA] 45 μM, n = 8; [O] 100 μM, [F] 60 μM, [RA] 90 μM, n = 8. O, oligomicina; F, FCCP; AR, rotenona/antimicina. (C) Traza de ventrículos permeabilizados por saponina (rojo, n = 4) en comparación con ventrículos no tratados (gris, n = 4); medidas repetidas bidireccionales ANOVA, factor de tiempo P < 0,0001, tiempo × interacción muestral P < 0,0001, factor de tratamiento P < 0,0001, factor muestral P = 0,824; los datos presentados como media ± SEM.TOC máximo de ventrículas tratados con saponina en comparación con ventrículos no tratados; prueba t de estudiante no emparejada (P = 0,0850). (D) Trazas representativas de OCR y ECAR de mdh1ab cOE (rojo, n = 8) y GFP cOE (gris, n = 8) de ventrículos 14dpci. OCR, medidas repetidas bidireccionales ANOVA, factor de tiempo P < 0,0001, tiempo × interacción de la muestra P < 0,0001, factor genotipo P < 0,0001, factor de muestra P = 0,1098; ECAR, medidas repetidas bidireccionales ANOVA factor de tiempo P < 0,0001, tiempo × interacción de la muestra P = 0,7507, factor muestral P = 0,2154, factor genotípico P < 0,0001. Datos adaptados de Lekkos et al., 20258 y presentados como media ± SEM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Discusión

Aquí describimos en detalle el protocolo para analizar el OCR y el ECAR de ventrículos de pez cebra ex vivo utilizando el analizador Seahorse XFe24 y la prueba de esfuerzo de Mito. El metabolismo de los cardiomiocitos desempeña un papel esencial en la regeneración cardíaca 21,22,23,24. Sin embargo, la validación del fenotipo metabólico del corazón de pez cebra en regeneración ha sido un reto y a menudo falta en las publicaciones 6,7. Debido al pequeño tamaño del corazón del pez cebra, técnicas como la espectroscopía de RMN o la espectrometría de masas requieren la agrupación de varios ventrículos para adquirir una señaladecuada 8,12,13. En cambio, el método que describimos aquí permite la adquisición de mediciones de OCR y ECAR de múltiples ventrículos individuales, aumentando así el poder estadístico.

Los métodos clásicos de perfilado metabólico, como la metabolómica, proporcionan una instantánea del perfil metabólico del tejido en el momento en que fue recogido. Gracias a la prueba de esfuerzo de Mito pudimos recopilar datos en tiempo real y en tiempo real sobre cómo se están adaptando los ventrículos a diversos desafíos metabólicos, incluyendo su capacidad respiratoria máxima, lo cual no es evidente al usar otras metodologías. Para lograr la fenotipización viva de los ventrólicos del pez cebra, se ha intentado la perfusión del corazón del pezcebra 9,10,11. Esto requiere equipos personalizados complejos y técnicos altamente cualificados para lograr la canulación sin perder el tiempo. El analizador ofrece una alternativa más sencilla utilizando un equipo comercialmente disponible para fenotipado de ventrículos de alto rendimiento (20 ventrículos a la vez). Hasta donde sabemos, no se ha comparado directamente el método descrito en este artículo con otras técnicas de oximetría viva, como un electrodo tipo Clark.

Es importante destacar que el método que describimos es adaptable según la pregunta de investigación. El ensayo se ha utilizado anteriormente para caracterizar embriones enteros de pezcebra 25,26. Además de la prueba de esfuerzo Mito descrita aquí, la prueba Mito Fuel Flex ha sido optimizada para evaluar la utilización metabólica de combustible en cortes cardíacoshumanos 27. Además, la prueba del fenotipo de energía celular se ha adaptado para caracterizar la capacidad glucolítica de los corazones regeneradores de Astyanax mexicanus 28. Prevemos que este protocolo se utilizará para otras estructuras 3D como organoides cardíacos, y será útil para validar la perturbación genética de las vías metabólicas en corazones de pez cebra no lesionados.

Reconocemos que esta técnica tiene ciertas limitaciones. En cuanto a los desafíos técnicos, tras aislarlo, los corazones se manipularon en un medio DMEM a temperatura ambiente y no se mantuvo a 28 °C, que es la temperatura óptima para el pezcebra 19. Reducir la temperatura del agua a 18 °C puede tener efectos significativos en la función del corazón in situ del pez cebra 29,30. Sin embargo, no se espera que la exposición a corto plazo a temperatura ambiente tenga un efecto significativo en la fisiología de los ventrículos aislados, ya que estos vuelven rápidamente al analizador de 28 °C. En nuestras manos, la mayoría de los ventrículos dejaron de latir visiblemente al disecar la aurícula, lo que señala la falta de estímulo del marcapasos como una etiología de la no contracción. Además, durante el periodo de aislamiento, el medio no fue oxigenado, lo que podría provocar una hipoxia leve, que se recupera a niveles normales de oxígeno tras mezclarse en el analizador antes de la primera medición.

Otra consideración práctica adicional respecto a la temperatura de los corazones también se relaciona con el calentador apagado en el analizador, lo que lleva a una reducción de temperatura de 37 °C a 28–29 °C. El analizador no permite reducir la potencia del calentador a la temperatura deseada. Sin embargo, cuando el analizador está en funcionamiento, la temperatura dentro de la bandeja es 6–7 °C más alta que la temperatura ambiente. Este rango de temperatura coincide con la temperatura óptima para el manejo de pecescebra, 19.

Este ensayo se realiza en ventrículos de pez cebra a granel. En consecuencia, es imposible distinguir las contribuciones de los tipos celulares individuales a los cambios observados en el OCR y el ECAR. Esto podría resultar de gran importancia al investigar las tasas metabólicas de los primeros momentos de regeneración, cuando la alta afluencia de célulasinmunitarias podría enmascarar los cambios en la OCR de los cardiomiocitos. Además, la sangre residual que queda en la luz ventricular podría influir en las lecturas metabólicas. Permitir que los corazones sangran en presencia deheparina 7 podría reducir aún más la influencia de la coagulación de las células sanguíneas en el corazón. Además, para mejorar la difusión de los inhibidores utilizados hacia las células internas del ventrículo, intentamos un paso de permeabilización usando saponina. La permeabilización de la saponina provocó una caída sostenida de la OCR durante todo el ensayo, lo que llevó a insuficiencia respiratoria de los ventrículos. Estas limitaciones podrían evitarse mediante el aislamiento, cultivo y análisis de cardiomiocitos aislados, aunque este enfoque requiere el cultivo prolongado de células32 , lo cual podría no ser óptimo para un entorno regenerativo.

El tejido lesionado podría influir en el método de normalización utilizado. En este estudio, normalizamos el OCR mediante μg de proteína/mL utilizando el ensayo BCA. Aunque el ensayo de BCA no reacciona fuertemente con las proteínas de colágeno debido a su composición rica en hidroxiprolina y prolina, que se detecta poco con coper, la presencia de otros componentes de la herida carentes de células podría influir en la normalización. Estudios futuros podrían considerar el uso delADN total 33 como un reflejo preciso de las células vivas en el ventrículo.

Además, no pudimos reproducir la reducción anticipada de la OCR causada por la inhibición dependiente de oligomicina del complejoV 15. Aunque ciertos estudios muestran una reducción en la OCR mediante el tratamiento con oligomicina de cardiomiocitosaislados 32,34,35, los datos aquí se asemejan a la falta de respuesta reportada en un estudio reciente sobre cardiomiocitos de ratón adulto aislados 36. Dado que la concentración de oligomicina que utilizamos es significativamente mayor que la reportada en los estudios mencionados, no está claro si aumentar la concentración final a más de 50 μM tendría algún efecto.

Por último, aunque el consumo de oxígeno depende principalmente de la respiración, la acidificación extracelular no es impulsada exclusivamente por el lactato producido por la glucólisis, sino también por la conversión del dióxido de carbono en ácido carbónico. Se ha informado que en mioblastos alimentados con glucosa, un tercio de la acidificación extracelular se debe al dióxido de carbono en condicionesbasales. Por lo tanto, recomendamos precaución en la interpretación de las mediciones ECAR resultantes del analizador Seahorse si no se ha realizado corrección por la proporción de acidificación impulsada porla respiración 38.

Divulgaciones

Los autores declaran no haber conflicto de intereses.

Agradecimientos

Estamos agradecidos a Nick Howe (Agilent Technologies) y Thomas Nicol (Universidad de Oxford) por su apoyo y discusión crítica durante el desarrollo de este método. Queremos reconocer al personal de nuestro centro animal en el Nivel 1 (Unidad de Servicios Biomédicos de la Universidad de Oxford) y del Instituto de Medicina del Desarrollo y Regenerativa (Universidad de Oxford) por mantener y transferir el pez cebra. Este trabajo ha sido apoyado por el Medical Research Council (MR/W006731/1 a KL), el Hospital Especializado y Centro de Investigación King Faisal (beca postdoctoral para RA), el Wellcome Institutional Strategic Support Fund (204826/Z/16/Z a JSOM), la British Heart Foundation IBSRF (FS//17/58/33072 a LCH), el Consejo Europeo de Investigación (ERC) bajo el programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea (715895). CAVEHEART, ERC-2016-STG a MTMM), subvenciones de proyectos de la British Heart Foundation (PG/15/111/31939 y PG/23/11189 a MTMM), MTMM reconoce el apoyo del Centro de Excelencia en Investigación BHF de Oxford, la Universidad de Oxford (RE/24/130024) y el Centro de Medicina Regenerativa BHF (RM/13/3/30159).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1,5 ml tubos Eppendorf  StarlabS1615-5550
Placa de 96 pozos  ThermoFisherAB-0800
Antimicina AChemCruz  SC-202467A
Medio DMEMAgilent1035755-100
DMSOSigma-Aldrich & nbsp;D2650-100mL
Hielo seco  
EtanolSupelco1.00983.2500
Kit de Ensayo de Flujo Extracelular  Agilent103518-100El pack contiene placa utilitaria, hidrobooster, cartucho sensor y tapa (viene con las placas del islote)
FCCPSigma-Aldrich & nbsp;C2920
GlucosaAgilent103577-100
GlutaminaAgilent103579-100
Incubadora
Microplaca de captura de islotesAgilent101122-10025 cuadrículas incluidas en el pack
Herramienta de captura de pantalla de islotesAgilent101135-100
Pinzas de microdisecciónideal-tek3131760Tamaño 5-S (serán necesarios 2x para aislar el ventrículo del bulbo arterioso y la aurícula)
Tijeras de microdisecciónFST15009-08
MS-222Sigma-Aldrich & nbsp;E10521
OligomicinaMP 151786
Homogeneizador de mottor de mano:VWR431-0100
MorterosVWR431-0094
Placa de Petri 35mmGreiner Bio-One627102
Placa de Petri 92mmStarstedt82.1473
Kit de ensayo BCA PierceTermo Científica23227
Mini comprimidos de Pierce Proteasa e Inhibidor de Fosfatasa, libres de EDTATermo CientíficaA32961
PiruvatoAgilent103578-100
Búfer de lisis RIPASanta CrusSC-364162
RotenoneMP 02150154-CF
Interfase Agilent de Seahorse AnalyticsAgilenthttps://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-software/agilent-seahorse-analytics-787485
Analizador Seahorse XFe24Agilenthttps://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-analyzers/seahorse-xfe24-analyzer-740878
SelladorTermo CientíficaAB-0558
SPECTROstar NanoMG LABTECH GmbH601-0298
EsponjaHaz una incisión lo suficientemente larga y profunda para que el pez encaje hacia arriba en el lado ventral
Wave (versión 2.6.1.56)Agilenthttps://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/software-download-for-wave-desktop
Calibrante XF  Agilent100840-000

Referencias

  1. Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science (1979). 298 (5601), 2188-2190 (2002).
  2. Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
  3. Kikuchi, K., et al. Primary contribution to zebrafish heart regeneration by gata4+ cardiomyocytes. Nature. 464 (7288), 601-605 (2010).
  4. Bertozzi, A., et al. Is zebrafish heart regeneration "complete"? Lineage-restricted cardiomyocytes proliferate to pre-injury numbers but some fail to differentiate in fibrotic hearts. Dev Biol. 471, 106-118 (2021).
  5. Nguyen, P. D., et al. Interplay between calcium and sarcomeres directs cardiomyocyte maturation during regeneration. Science (1979). 380 (6646), 758-764 (2023).
  6. Fukuda, R., et al. Stimulation of glycolysis promotes cardiomyocyte proliferation after injury in adult zebrafish. EMBO Rep. 21 (8), e49752(2020).
  7. Honkoop, H., et al. Single-cell analysis uncovers that metabolic reprogramming by ErbB2 signaling is essential for cardiomyocyte proliferation in the regenerating heart. Elife. 8, e50163(2019).
  8. Lekkos, K., et al. Oxidative phosphorylation is required for cardiomyocyte redifferentiation and long-term fish heart regeneration. Nat Cardiovasc Res. 4 (10), 1363-1380 (2025).
  9. Zhang, H., et al. A Langendorff-like system to quantify cardiac pump function in adult zebrafish. Dis Model Mech. 11 (9), dmm034819(2018).
  10. Zhang, P. C., Llach, A., Sheng, X. Y., Hove-Madsen, L., Tibbits, G. F. Calcium handling in zebrafish ventricular myocytes. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 300, 56-66 (2011).
  11. Lin, E., et al. Construction and use of a zebrafish heart voltage and calcium optical mapping system, with integrated electrocardiogram and programmable electrical stimulation. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 308, R755-R768 (2015).
  12. Miklas, J. W., et al. Amino acid primed mTOR activity is essential for heart regeneration. iScience. 25 (1), 103574(2022).
  13. García-Poyatos, C., et al. Cox7a1 controls skeletal muscle physiology and heart regeneration through complex IV dimerization. Dev Cell. 59 (14), 1824-1841.e10 (2024).
  14. How Agilent Seahorse XF Analyzers Work. , Agilent. https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/how-seahorse -xf-analyzers-work?srsltid=AfmBOopkIZodH4uZO 5puXTOp1U5gdkky661L6TKluz5XgBWGqujHEzww (2026).
  15. Yoo, I., Ahn, I., Lee, J., Lee, N. Extracellular flux assay (Seahorse assay): Diverse applications in metabolic research across biological disciplines. Mol Cells. 47 (8), 100095(2024).
  16. Chablais, F., Jaźwińska, A. Induction of myocardial infarction in adult zebrafish using cryoinjury. J Vis Exp. (62), e3666(2012).
  17. González-Rosa, J. M., Mercader, N. Cryoinjury as a myocardial infarction model for the study of cardiac regeneration in the zebrafish. Nat Protoc. 7 (4), 782-788 (2012).
  18. Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS One. 6 (4), e18503(2011).
  19. Aleström, P., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Lab Anim. 54 (3), 213-224 (2019).
  20. Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio. J Vis Exp. (55), e3165(2011).
  21. Duan, X., Liu, X., Zhan, Z. Metabolic regulation of cardiac regeneration. Front Cardiovasc Med. 9, 933060(2022).
  22. Yu, F., Cong, S., Yap, E. P., Hausenloy, D. J., Ramachandra, C. J. Unravelling the interplay between cardiac metabolism and heart regeneration. Int J Mol Sci. 24 (12), 10300(2023).
  23. Cook, M., Lal, S., Hume, R. D. Transcriptional, proteomic and metabolic drivers of cardiac regeneration. Heart. 111 (18), 851-858 (2025).
  24. Chen, X., et al. Metabolic reprogramming: A byproduct or a driver of cardiomyocyte proliferation. Circulation. 149 (20), 1598-1610 (2024).
  25. Bond, S. T., McEwen, K. A., Yoganantharajah, P., Gibert, Y. Live metabolic profile analysis of zebrafish embryos using a seahorse XF 24 extracellular flux analyzer. Methods Mol Biol. 1797, 393-401 (2018).
  26. Gibert, Y., McGee, S. L., Ward, A. C. Metabolic profile analysis of zebrafish embryos. J Vis Exp. (71), e4300(2013).
  27. Trampel, K. A., et al. Seahorse metabolic analysis for human and mouse cardiac organotypic slices. bioRxiv. , (2025).
  28. Ruggiero, G., et al. A balanced circadian glycolytic rhythm drives cardiomyocyte cell cycle progression during fish heart regeneration. bioRxiv. , (2025).
  29. Lee, L., et al. Functional assessment of cardiac responses of adult zebrafish (Danio rerio) to acute and chronic temperature change using high-resolution echocardiography. PLoS One. 11 (1), e0145163(2016).
  30. Shaftoe, J. B., Geddes-McAlister, J., Gillis, T. E. Integrated cellular response of the zebrafish (Danio rerio) heart to temperature change. J Exp Biol. 227 (20), jeb247522(2024).
  31. Ryan, R., Moyse, B. R., Richardson, R. J. Zebrafish cardiac regeneration—looking beyond cardiomyocytes to a complex microenvironment. Histochem Cell Biol. 154 (5), 533-548 (2020).
  32. Angelini, A., Pi, X., Xie, L. Evaluation of long-chain fatty acid respiration in neonatal mouse cardiomyocytes using SeaHorse instrument. STAR Protoc. 3 (2), 101392(2022).
  33. Ludikhuize, M. C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Rodríguez Colman, M. J. Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse. STAR Protoc. 2 (1), 100386(2021).
  34. Neary, M. T., et al. Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function. J Mol Cell Cardiol. 74 (100), 340-352 (2014).
  35. Cheng, Y. Y., et al. Metabolic changes associated with cardiomyocyte dedifferentiation enable adult mammalian cardiac regeneration. Circulation. 146 (25), 1950-1967 (2022).
  36. Li, X., et al. Inhibition of fatty acid oxidation enables heart regeneration in adult mice. Nature. 622 (7983), 619-626 (2023).
  37. Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochim Biophys Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).
  38. Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and analysis of extracellular acid production to determine glycolytic rate. J Vis Exp. (106), e53464(2015).

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Regeneraci n card aca en pez cebraensayo Seahorsemetabolismo oxidativogluc lisistasa de consumo de ox genotasa de acidificaci n extracelularrediferenciaci n de los cardiomyocytesmetabolismo card aco
Evaluación de la actividad metabólica de ventrículos de pez cebra regenerador ex vivo mediante un ensayo de flujo extracelular
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.