Uso de RMN en solución para caracterizar condensados biomoleculares bajo condiciones bifásicas

Resumen

Aquí presentamos protocolos para metodologías de RMN, DIFfusión RErestricted of INvisible speciEs (REDIFINE) y CONdensate DEtectioN por transferencia de magnetización SEmi-sólida (CONDENSE-MT), que permiten la caracterización cuantitativa y sin etiqueta de condensados biomoleculares bajo condiciones bifásicas, revelando la partición molecular, la dinámica de intercambio, la hidratación de condensados y la estructura de gotas sin sedimentación ni marcado.

Resumen

Los condensados biomoleculares formados mediante separación en fase líquido-líquido (LLPS) organizan el entorno intracelular y regulan diversos procesos bioquímicos. A pesar de su importancia, explorar la composición del condensado, la dinámica de intercambio y la organización interna sigue siendo un reto, especialmente sin etiquetas externas. La espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) puede proporcionar una ventana única sin etiquetas a estos conjuntos a mesoescala, capturando tanto el movimiento molecular como la heterogeneidad ambiental. Dos metodologías complementarias de RMN permiten una caracterización completa de los condensados directamente dentro de su estado bifásico. Para condensados lo suficientemente dinámicos como para ser observables mediante RMN, el enfoque de intercambio de difusión, la fusión REstricted of INvisible speciEs, abreviada como REDIFINE, utiliza el contraste de difusión con el intercambio químico para cuantificar la fracción de moléculas divididas entre fases condensada y diluida, determinar el tamaño de las gotas y la permeabilidad de la interfaz, y extraer tasas de intercambio molecular a través del límite de fase. Para condensados más rígidos que son invisibles por RMN, el método de magnetización-transferencia de magnetización semisólida detectado por agua, CONdensate DEtectioN por Transferencia de Magnetización SEmi-sólida, o en abreviatura CONDENSE-MT, aprovecha el contraste de relajación y el intercambio de protones entre biomoléculas condensadas y disolvente en fase diluida para monitorizar los condensados sobre los protones de agua a granel, proporcionando acceso a la partición relativa, tasas de rotación molecular, dinámica de hidratación y contenido de agua ligada. En conjunto, estos enfoques ofrecen una visión multidimensional y cuantitativa de la estructura y dinámica del condensado bajo condiciones bifásicas casi nativas, sin etiquetas fluorescentes ni de detección. Su integración amplía la caja de herramientas de RMN para estudiar la separación de fases biomoleculares y establece una base para conectar las propiedades fisicoquímicas del condensado con su función biológica y su mala regulación patológica.

Introducción

Las células logran su extraordinaria organización espacial y temporal compartimentando las reacciones^{bioquímicas 1,2,3}. Además de los orgánulos unidos a membrana, muchos procesos celulares cruciales ocurren dentro de compartimentos sin membrana formados por la separación en fase líquido-líquido (LLPS) de proteínas y ácidos^nucleicos. Estos conjuntos dinámicos, a menudo denominados condensados biomoleculares, incluyen el nucleolo, los gránulos de tensión, los moteados nucleares y los cuerpos procesadores, que desempeñan roles esenciales, por ejemplo, en el metabolismo del ARN, la regulación de la transcripción o la transducción de^{señales 5,6}. Su capacidad para formar, disolver e intercambiar componentes en respuesta a señales ambientales proporciona a las células un mecanismo versátil para organizar actividades bioquímicas sin depender de las membranas lipídicas.

Un gran subconjunto de condensados biomoleculares proviene de proteínas que se unen al ARN (RBPs) y que contienen regiones intrínsecamente desordenadas (IDRs) y dominios de unión al ARN (RBDs^)7,8. Estas proteínas pueden separarse en fase, ya sea por sí solas o en complejo con ARN, dando lugar a condensados con diversas propiedades materiales y funciones biológicas. Por ejemplo, la proteína nucleocápside (N) del SARS-CoV-2 forma condensados biomoleculares^{dependientes de ARN 9} implicados en el empaquetado y ensamblaje del genoma viral, mientras que la proteína de unión al tracto polipirimidina 1 (PTBP1) forma condensados nucleares que contribuyen al silenciamiento^{génico 10}. Además, proteínas como FUS y DDX4 sufren LLPS impulsadas por sus regiones desordenadas, influyendo en el metabolismo del ARN y en la formación de gránulos de^{estrés 11,12}. La desregulación de estos procesos está relacionada con enfermedades neurodegenerativas como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y la demencia frontotemporal, donde las transiciones de fase aberrantes pueden provocar agregación y pérdida de función¹³.

La condensación no se limita a proteínas y complejos proteína–ARN. El ARN por sí solo puede sufrir LLPS, especialmente en el contexto de secuencias de expansión repetida asociadas a varios trastornos^{neurodegenerativos 14,15}. Las expansiones repetidas de trinucleótidos y hexanucleótidos, como la CAG en la enfermedad de Huntington o la CUG en la distrofia miotónica, pueden formar condensados similares a gotas tanto in vitro como en células¹⁴. Comprender la base física de la condensación del ARN, así como cómo difiere de los condensados impulsados por proteínas y ARN proteínas, es fundamental para esclarecer los mecanismos moleculares que subyacen a las enfermedades de expansión repetida.

A pesar de su importancia biológica, la caracterización cuantitativa y sin etiquetas de los condensados biomoleculares sigue siendo un desafío^{formidable 16}. Las técnicas convencionales de microscopía y espectroscopía de fluorescencia se basan en etiquetas externas, que pueden alterar la estructura, dinámica o comportamiento de las fases^{de la biomolécula 17,18}. Además, algunos condensados son invisibles por RMN debido a un movimiento molecular restringido y a formas lineales amplias, lo que limita la información accesible mediante los enfoques tradicionales de RMN. En consecuencia, existe una necesidad urgente de estrategias experimentales que puedan sondar los condensados directamente en su estado bifásico, similar al nativo, sin etiquetado. Dado el importante papel del límite de la fase de gotas en los procesos de intercambio y la maduración del condensado, es igualmente importante estabilizar las gotas biomoleculares dentro de un volumen de muestra dado, evitando así la sedimentación de la fase densa. Esto se puede lograr fácilmente utilizando los hidrogeles de agarosa que imitan el citoesqueleto.

Los desarrollos recientes en metodologías basadas en RMN ofrecen esta solución. El enfoque REDIFINE (REstricted DIffusion of INvisible speciEs)¹⁹ combina RMN por difusión con análisis de intercambio químico para cuantificar la partición molecular, la cinética del intercambio y el tamaño de las gotas en condensados de proteínas y proteínas–ARN. De forma complementaria, la técnica CONDENSE-MT (CONdensate DEtectioN by SEmi-solid Magnetization Transfer^{) 20} detecta condensados invisibles por RMN mediante transferencia de magnetización de agua, permitiendo cuantificar la cantidad de materia condensada en condiciones dadas y revelando aún más la dinámica de hidratación y las tasas de rotación molecular dentro del condensado. En conjunto, estos métodos permiten investigaciones sin marcador y no invasivas de diversos tipos de condensados, solo proteínas, proteína-ARN y condensados solo de ARN bajo condiciones bifásicas de equilibrio. Al ampliar la caja de herramientas de RMN, abren la puerta a una exploración sistemática y cuantitativa de la estructura del condensado, la dinámica y sus conexiones con la función biológica y la enfermedad.

Protocolo

1. Preparación de muestras

1. Elección de tampón: Utiliza tampones probados en los que las biomoléculas sean más estables.
   NOTA: Las señales de RMN suelen ser más fuertes a pH bajo. Como requisito técnico, añadir 5% de D₂O como bloqueo de campo a todas las muestras de RMN (v/v final).
2. Estabilizar la muestra bifásica, utilizando un hidrogel de agarosa que imita el citoesqueleto como medio. Pesa polvo de agarosa para preparar un fondo de agarosa al 1,5% (p/v) en el mismo tampón. Utiliza la agarosa normal como alternativa más económica a los condensados biomoleculares formados por proteínas intrínsecamente desordenadas (IDPs) y ARN que pueden soportar temperaturas más altas. Utiliza agarosa de baja fusión al preparar condensados delicados que involucren proteínas que contienen dominios^{plegados 19}.
3. Preparación de la culata de agarosa: Calienta la suspensión hasta aproximadamente 80 °C durante 10 minutos y disuelve completamente la agarosa mezclando o haciendo vórtice.
   PRECAUCIÓN: La agarosa fundida está caliente y puede arder; Maneja con guantes resistentes al calor.
   NOTA: Mantenga la agarosa fundida caliente (por ejemplo, 55 °C para la agarosa normal y 37 °C para la agarosa de baja fusión en el fondo) en un baño maria para que permanezca líquida antes de mezclarla con la muestra biológica.
   La agarosa fundida puede mantenerse caliente durante varias decenas de^{minutos 19,21}.
4. Preparar la muestra bifásica final:
   1. Para preparar una muestra bifásica estabilizada con hidrogel de agarosa, mezclar stocks de proteína (y/o ARN) con el correspondiente tampón de agarosa tibio en un tubo microcentrífuga de 1,5 ml.
      NOTA: La concentración final de proteína/ARN suele ser de 50-500 μM para ser adecuada para la detección de RMN.
   2. Transfiere inmediatamente la mezcla a un tubo de RMN de 3 mm usando una piquita larga de cristal. Permite que la agarosa se solidifique poco después de la transferencia.
      NOTA: Sin agarosa, la muestra bifásica se sedimenta con el tiempo, lo que complica la adquisición y análisis de datos de RMN porque la muestra cambia físicamente en la escala temporal del experimento.
5. Realizar una inspección visual: Inspeccionar la muestra visualmente. Si se produce separación de fases, la muestra aparece inmediatamente turbia y permanece así. Esto indica que la muestra bifásica ha sido estabilizada con éxito en agarosa.
6. Cuando se planee ejecutar CONDENSE-MT, prepare una muestra de referencia adicional de agarosa haciendo los mismos pasos, solo omitiendo la adición de la biomolécula. Añade el buffer en su lugar para obtener el mismo volumen de muestra. Prepara esta muestra solo después de preparar la muestra de condensado y medir todos los datos que contiene para asegurarte de que la muestra de referencia de agarosa no se incube durante más tiempo.

2. Registro de experimentos REDIFINE

1. Bloquea, cuña, empareja y sintoniza el canal ¹H como siempre. Calibra la longitud del pulso de 90° en ¹H usando tu procedimiento general.
2. Graba un espectro 1D con supresión de agua. Idealmente se observa una señal biomolecular fuerte (Figura suplementaria 1A).
   1. Si no se observa o se observa muy poca señal, suponga que la proteína o ARN condensado no es observable por RMN y que la partición en la fase condensada es alta. En este caso, no procedas con REDIFINE ya que esta metodología se basa en una señal biomolecular observable.
   2. En esta situación, en principio los experimentos CONDENSE-MT deberían funcionar muy bien, así que pasa inmediatamente al Paso 4 (Grabación de experimentos CONDENSE-MT).
3. Carga el experimento convencional de Espectroscopía Ordenada por Difusión (DOSY) que se basa en un procedimiento convencional de eco estimulado 2D usando gradientes bipolares (secuencia de pulsos de Bruker: stebpgp1s19). Consulta los manuales de usuario de Bruker DOSY y Diffusion para más detalles.
4. Ajusta P0, P1 y P27 a la longitud calibrada de 90° de pulso. Configura como regla general, NS a 32 escaneos, DS a 16, TD1 a 16, y ajusta TD2 y SW2 para obtener un tiempo de adquisición AQ de 80-100 ms. Ajusta d1 a 1,5 s.
   NOTA: Los gradientes deben estar correctamente calibrados.
5. Optimiza el retardo Watergate d19 como de costumbre según tu campo magnético, para obtener la máxima excitación en aromáticos (aprox. 7 ppm) o alifáticos (aprox. 1 ppm). Ajusta d20 a 75 ms. La elección del p30 dependerá del tamaño de la proteína o ARN. Para proteínas >20 kDa, usar 5 ms; Para proteínas más pequeñas, usa 3,5 ms como regla general.
6. Registra un experimento DOSY por el comando: 'xau dosy 2 95 16 l y y', que calcula la intensidad del gradiente de difusión del 2 al 95 % en 16 pasos, de forma lineal.
   1. Idealmente, se debe observar la decaiencia inicial de la señal derivada de la fase diluida, mientras que la decaimiento de la señal de fase condensada debería estabilizarse (Figura 1A y Figura suplementaria 1B).
7. Para seguir adquiriendo datos para el conjunto completo de REDIFINE, crea 9 nuevos stebpgp1s19 copiando los parámetros del inicial que acabas de ejecutar. En cada experimento consecutivo, solo se cambia el retardo de difusión del d20 en pasos variables para cubrir el rango de 100 a 1000 ms (es decir, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 700, 1.000 ms).
8. Haz cada uno de estos experimentos bajo el comando 'xau dosy 2 95 16 l y n'. La última "n" asegura que la ganancia del receptor se mantenga a lo largo de los 10 experimentos.

3. Procesamiento de conjuntos de datos REDIFINE y visualización de los resultados

1. Procesar cada experimento (10 en total) de la siguiente manera:
   1. Establece qsine de SSB 2 como función ventana, extrae la^{quinta porción} usando qsin; fp, fasear el 1D y guardar los parámetros de fase en el conjunto de datos 2D.
   2. Luego procesa 2D con xf2, haz la corrección base de abs2 y extrae estas 16 porciones con split2D (entradas adicionales en la ventana emergente: r – 16 – 11). Esto extraerá 16 espectros adquiridos usando diferentes intensidades de gradiente y los guardará como experimentos procesados en 1D de 11 a 26 dentro del mismo conjunto de datos.
   3. Repite lo mismo para los 9 experimentos restantes. A veces es crucial revisar al menos las primeras 4-5 rebanadas para asegurarse de que la fase y la corrección de la línea base son correctas. Si es necesario, corrija manualmente: una buena fase y una línea base son requisitos previos para una cuantificación adecuada (Figura 1B).
2. Utiliza el LLPS_REDIFINE_fit de código Matlab proporcionado para el análisis (Figura suplementaria 2A). En el código, ajusta según tus experimentos lo siguiente: 'Delta' (difusión por d20), 'P.d' (duración total del gradiente 2*p30), exp(1,:) a exp(10,:) según el # de los experimentos que realizaste. Luego ajusta P.G según la intensidad de los gradientes de tu sonda (accesible en la carpeta de experimentos TopSpin en el archivo "difflist").
3. Ajusta la 'carpeta' y la 'ruta' según la ubicación de tus datos. Ejecuta el código hasta la línea 40. Esto te dará la porción 1D: desde aquí, elige las regiones de integración; Estos deben incluir aromáticos o alifáticos, y elegir la región lo más estrecha posible, sin tener en cuenta diferentes grupos moleculares como las amidas.
4. Introduce los límites de integración en puntos de variables 'izquierda' y 'derecha' en consecuencia (Figura suplementaria 2A). Esto es para integrar los datos del análisis cuantitativo (Figura 1C). Elige el nombre de la matriz según tu muestra, fecha de ejecución y algunos detalles experimentales.
5. Ejecuta todo el código. En 'fit0', puedes elegir los parámetros iniciales que la función de optimización usará para iniciar la minimización. Empieza con los valores por defecto y, si no se logra la convergencia, cambia el segundo valor fit0 (población en la fase condensada) en pasos de 0,1 de 0,1 a 1.
   NOTA: A veces el conjunto de datos tiene varios mínimos locales, y es necesario variar extensamente los parámetros iniciales para empezar a converger hacia el mínimo más global.
6. Cuando se logra un ajuste satisfactorio, los valores de ajuste se escriben dentro de la figura (Figura 1D y Figura Suplementaria 2B) y pueden accederse en la variable 'ajuste'. Además, grafica estos parámetros como un gráfico estadístico para una mejor visualización.

4. Grabación de experimentos CONDENSE-MT

NOTA: El objetivo del experimento es detectar indirectamente los condensados mediante su observación en la señal de agua del disolvente mediante el intercambio de^{protones 20}. En el experimento CONDENSE-MT, se adquiere y analiza un perfil de MT por huella dactilar (Figura 2A)²⁰.

1. Graba tu espectro 1D favorito con supresión de agua. Si se observa muy poca señal, es muy probable que el experimento CONDENSE-MT funcione muy bien.
2. El análisis cuantitativo CONDENSE-MT requiere la determinación previa de la tasa R1 del agua. Determina la tasa de_R1 mediante la recuperación de inversión de_T1 . Copia la secuencia de pulsos proporcionada, el conjunto de parámetros de Bruker y la lista vd a las carpetas correspondientes. Carga el conjunto de parámetros "T1_inversion_recovery" y ajusta potencias y frecuencias a tu espectrómetro de RMN (según "edprosol").
   1. Calibra el pulso de 90° en 1H (p1), ajusta NS a 2, DS a 0, d1 a 20 s, SW a 10 ppm, TD2 a 16k y TD1 a 24 (de la longitud de tu lista de vd ajustada). Activar un gradiente débil a lo largo de Z (GPZ0 = 0,1 %) para evitar efectos de amortiguación de radiación.
3. Para el experimento CONDENSE-MT,
   1. Copia el conjunto de parámetros de Bruker, la secuencia y la lista de frecuencias proporcionados a las carpetas específicas de Bruker, carga el conjunto de parámetros "CONDENSE-MT" y ajusta las frecuencias y potencias según tu espectrómetro.
   2. Ajusta P1 a la longitud calibrada de 90° del pulso y P4 a 1 μs para el pulso de excitación para evitar la amortiguación de radiación. Configura NS a 2, DS a 16, d1 a 4 s, SW2 a 20 ppm, TD2 a 8k, TD1 a la longitud de la lista de frecuencias (normalmente 46). Ajusta SPNAM10 a Squa100.1000 y su duración de p10 a 5 s.
   3. Encuentra la potencia del SP10 que produzca irradiación de 100 Hz (el comando 'pulse 100 Hz' calculará tu potencia tanto en vatios como en dB). Ajusta la potencia SP10 del pulso de irradiación en consecuencia y ejecuta este experimento pseudo-2D usando el comando 'zg'.
      NOTA: El experimento utilizará la lista de frecuencias proporcionada que abarca los desplazamientos de irradiación desde la resonancia en resonancia con el agua hasta la resonancia muy alejada (100000 Hz) para detectar la señal del agua en diferentes desplazamientos de irradiación (Figura 2B). Un gráfico de integrales de agua (asegurar una correcta fase de los espectros; Figura 2C) respecto al desplazamiento de irradiación da como resultado el perfil CONDENSE-MT mostrado en la Figura 2A.
4. Crear 7 nuevos experimentos y, en cada uno consecutivo, aumentar solo la potencia de irradiación para cubrir el rango de 170 Hz a 1000 Hz (es decir, 170, 250, 330, 500, 650, 780, 1.000 Hz). En cada experimento, usa el comando del punto anterior. Para cada potencia de saturación, se adquirirá toda la lista de desplazamiento (Figura 2D).
   NOTA: El ajuste condense-mt requiere los datos de referencia adquiridos en la muestra solo de agarosa (medio sin condensados biomoleculares). Asegurarse del mismo intervalo de tiempo entre la preparación de la muestra y la adquisición de datos, y adquirir el mismo conjunto de datos de 8 experimentos en una muestra de referencia agarosa. Esto es para asegurar que tanto la referencia de agarosa como la muestra bifásica fueran incubadas durante el mismo tiempo.

5. Procesamiento de conjuntos de datos CONDENSE-MT y visualización de los resultados

1. Procesar cada experimento CONDENSE-MT (8 en total, Figura Suplementaria 3A) de la siguiente manera.
   1. Establece qsine de SSB 2 como función ventana, extrae la^46ª porción usando qsin; fp, fasear el pico de agua en 1D y guardar los parámetros de fase en el conjunto de datos 2D, luego procesar 2D con xf2 y extraer estas 46 cortes con split2D (entradas adicionales en la ventana emergente: r – 46 – 11).
      NOTA: Esto extraerá 46 espectros 1D adquiridos usando diferentes desplazamientos de irradiación y los guardará como experimentos procesados en 1D del 11 al 56 dentro del mismo conjunto de datos (Figura suplementaria 3A, mostrada para el experimento CONDENSE-MT de 1000 Hz).
   2. Repite lo mismo para los 7 experimentos restantes. Revisa varias rebanadas de cada experimento para asegurarte de que la fase y la línea base son correctas (Figura 2C). Si es necesario, corregir manualmente: una buena fase y una línea base son requisitos previos para una cuantificación adecuada.
2. Repite los mismos pasos en los datos obtenidos usando muestra de referencia de agarosa y para los experimentos de recuperación por inversión, extrayendo la vigésima cuarta porción para la fase y usando split2D (r – 24 – 11).
3. Ajusta los datos adquiridos usando el código Matlab proporcionado. Sigue las instrucciones específicas del guion.
4. Realizar primero el análisis de ajuste para la muestra de referencia de agarosa para obtener los parámetros de fondo en ausencia de condensados. El código read_CONDENSE_MT_data primero lee los datos procesados de RMN e integra la señal de resonancia de agua en las cortes 1D generadas por el comando split2D (Figura suplementaria 3B).
5. Establecer los límites de integración individualmente; se representará un espectro 1D de referencia en Matlab para evaluar los límites de integración (Figura suplementaria 3C). El código normalizará aún más los datos y ajustará las integrales normalizadas del agua en función del desplazamiento de irradiación y la potencia al modelo^{CONDENSE-MT 20}. El read_CONDENSE_MT_data almacenará las integrales normalizadas en la variable integral_water_real_all, que luego se utiliza para el ajuste posterior.
6. Determinar la tasa de relajación_R1 del agua en presencia de agarosa o condensados antes de ajustar los datos CONDENSE-MT.
   NOTA: El ajuste del experimento de recuperación por inversión de agua puede realizarse dentro de la primera sección del guion CONDENSE-MT_full Matlab (o el script CONDENSE_MT_referenceMTpool en el caso de los datos de referencia de agarose). El nombre del archivo y la ruta del experimento, así como el ID del experimento, pueden introducirse para ejecutar el script Inversion_Recovery Matlab (Figura suplementaria 4A, sección 1). Si es necesario, el número de cortes 1D y los límites de integración pueden ajustarse en este script; este último depende de los parámetros de procesamiento utilizados en TopSpin. Esta sección determinará la tasa R1 del agua y la almacenará en la variable P.R1w , que es necesaria para el ajuste posterior de los datos CONDENSE-MT.
7. Para datos de agarose, utiliza las integrales normalizadas de forma sencilla para ajustar, usando el script CONDENSE_MT_referenceMTpool (que llama a la función function_1MT ).
8. Para la cuantificación de condensados, se utilizan los parámetros ajustados de agarosa como entrada para el ajuste global de los datos adquiridos en la muestra condensada (Figura suplementaria 4A). Esto fijará las propiedades físicas de la malla de agarosa como valores constantes al ajuste, permitiendo cuantificar el efecto adicional mediado por condensado de un condensado incrustado en la malla de agarosa (Figura 2E).
9. Haz la cuantificación del condensado usando el script CONDENSE-MT_full , que llama a la función function_2MT Matlab. Los parámetros iniciales para la optimización computacional se dan mediante fit0 (Figura suplementaria 4B). La incertidumbre del parámetro del ajuste se calculará con la matriz jacobiana de la que se derivará la matriz varianza-covarianza (Figura suplementaria 4B).
10. Evalúa la calidad del ajuste mediante la desviación del ajuste, que se asemeja a la desviación residual de la predicción del modelo respecto a los datos experimentales. Para un control de calidad adicional, grafica el ajuste junto con los datos experimentales (Figura suplementaria 4C).

Resultados

El protocolo LLPS REDIFINE descrito aquí se aplicó al dominio FUS N-terminal (NTD). La DTN de FUS se separa fácilmente en condiciones ambientales a concentraciones^{micromolares 19,21}. Esta muestra en particular se preparó a una concentración de 200 μM en un tampón HEPES de 30 mM que contenía 200 mM de KCl a pH 7,5, con un 0,5% de agarosa regular. Tras la separación de fase, las señales FUS NTD permanecen observables en la fase condensada (Figura 1A,B). Esto lo convierte en un candidato perfecto para estudiar LLPS REDIFINE. Es decir, la mayoría de las proteínas propensas a LLPS contienen regiones largas intrínsecamente desordenadas que normalmente permanecen observables en la fase condensada; Sin embargo, en proteínas más estructuradas, esto no ocurre.

El ajuste de REDIFINE (Figura 1D y Figura 3A,B) reveló múltiples parámetros únicos para esta muestra de FUS NTD. Específicamente, determinó los coeficientes de difusión en la fase diluida y condensada (D_dil y_{D cond}), la población de proteínas en la fase condensada (ν_cond), el tamaño medio de la gota R y la permeabilidad de interfase p. El tamaño de la gota y la permeabilidad definen la tasa de intercambio de interfase desde la fase condensada a la diluida k_cd=3p/R, permitiéndonos obtener la información sobre la dinámica del intercambio¹⁹.

Estos resultados pueden visualizarse de diferentes maneras (Figura 3B). Utilizando un gráfico de arañas, se podrían comparar resultados entre diferentes condiciones o muestras. Por otro lado, se pueden representar pictóricamente los parámetros REDIFINE en el modelo para visualizarlos de la forma más eficaz. Ten en cuenta que REDIFINE proporciona todos estos resultados sin etiqueta en solo un par de horas usando solo una muestra.

Como la señal RMN de FUS NTD sigue siendo detectable en la fase condensada (Figura 3C), lo más probable es que el CONDENSE-MT no sea aplicable debido a la falta de contraste de relajación. Registramos el conjunto de datos CONDENSE-MT en FUS NTD y, de hecho, no se observa ninguna diferencia en el perfil MT entre la muestra bifásica de referencia agarosa y FUS NTD bifásica (Figura 3C). Esto hace que la metodología CONDENSE-MT no sea aplicable a esta muestra particular de FUS NTD.

Sin embargo, el CONDENSE-MT proporciona caracterización dinámica de los condensados de ARN de expansión repetida (Figura 3C,D)²⁰. Cabe señalar que CONDENSE-MT podría proporcionar múltiples parámetros que caracterizan de forma única el ARN en la fase condensada (Figura 3D), a pesar de que su señal no es observable en la RMN convencional (Figura 3C). Los parámetros obtenidos son la cinética de intercambio de protones entre el condensado y el agua a granel (_{condensado k, H2O} y k_{H2O, condensado}), la tasa de relajación de T₂ para el condensado (T_{2, condensado}), que refleja el grado de detención dinámica de las biomoléculas tras la condensación, y la aparente tasa de R₂ del agua a granel (R_{2, agua}). Este último parámetro es una combinación lineal de la tasa de rotación del agua diluida a granel y del agua condensada de lenta rotación. Valores de agua más altos de_{R 2} indican una mayor población de agua en el condensado, lo que eleva la tasa aparente total de agua^{de R 2 (}Figura 2E y Figura 3D).

DISPONIBILIDAD DE DATOS Y CÓDIGO

Los datos en bruto y los códigos de procesamiento LLPS REDIFINE están disponibles en el repositorio Zenodo: https://doi.org/10.5281/zenodo.15228787 . Los datos en bruto y los códigos de procesamiento de CONDENSE-MT se han depositado en el repositorio Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.15789697. MATLAB es necesario para el procesamiento. También se proporcionan en este artículo (Archivos de codificación suplementaria).

Figura 1: Flujo de trabajo REDIFINE. (A) Las mediciones de difusión producen curvas complejas de decaimiento bifásico de difusión en muestras condensadas. La desintegración resultante contiene parámetros desconvoludos que describen los coeficientes de difusión de la especie en la fase condensada y diluida, sus poblaciones, el tamaño de las gotas y la tasa de intercambio de interfase. (B) Para decodificar estos parámetros aislados, es necesario registrar un conjunto de datos pseudo-3D variando no solo la intensidad del gradiente, sino también los retardos de difusión. Es absolutamente esencial para la cuantificación que cada segmento de estas mediciones sea correctamente faseado y corregido según la línea base. (C) Tras comprobar la calidad de los datos medidos y procesados, estos cortes 1D se introducen en el código MATLAB para su análisis y la gráfica final. (D) Los datos son ajustados por un solucionador de programación no lineal. El ajuste y los parámetros resultantes se ilustran para la muestra bifásica FUS NTD. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Flujo de trabajo CONDENSE-MT (A) Un perfil único de CONDENSE-MT observado en la resonancia del agua que ilustra la ampliación debido a la presencia de biomoléculas condensadas y agua. (B) Se observa agua para cada desfase de irradiación. (C) Para la cuantificación, es esencial que todos los espectros se fasen correctamente. (D) Tras adquirir la resonancia del agua en diferentes desplazamientos de irradiación, el experimento se repite a diferentes potencias de irradiación. Esto proporcionará un conjunto de datos de la señal relativa del agua en función tanto del desplazamiento de irradiación como de la potencia de irradiación (E). Los datos son ajustados por un solucionador de programación no lineal. El ajuste y los parámetros resultantes se ilustran para la muestra bifásica de ARN 31xCAG. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Presentación de los resultados de MT de REDIFINE y CONDENSE. (A) Representación en gráfico de araña de los parámetros de REDIFINE para análisis comparativo entre muestras o condiciones. (B) Modelo esquemático que ilustra parámetros derivados de REDIFINE, incluyendo coeficientes de difusión, radio de gotas, partición y tasa de intercambio interfase. (C) Comparación de perfiles CONDENSE-MT adquiridos para referencia de agarosa y FUS NTD bifásica en agarosa a 500 Hz.
(D) Análisis CONDENSE-MT de condensados de ARN de expansión repetida 31xCAG mostrando la extracción de parámetros y visualización de los efectos de transferencia de magnetización asociados al condensado. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura suplementaria 1: Configuración de REDIFINE. (A) El dominio FUS N-terminal permanece observable tras la preparación de la muestra condensada bifásica. Se observa una señal fuerte de amida/amino y protones aromáticos. (B) La desintegración de señal observada en el experimento de difusión DOSY ilustra una desintegración más rápida de la población de proteínas en fase diluida y una desintegración más lenta de la proteína en la fase condensada. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 2: Procesamiento de REDIFINE. (A) Código Matlab usado para el ajuste de REDIFINE, con parámetros resaltados donde se necesita la entrada específica. El recuadro ilustra cómo se elige el área de integración. (B) Minimización de la función de ajuste y los resultados resultantes. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura 3 suplementaria: Configuración CONDENSE-MT. (A) Visión general de los experimentos de RMN necesarios para el análisis CONDENSE-MT, incluyendo el experimento de recuperación por inversión de agua (expno. 5) y los experimentos CONDENSE-MT a diferentes potencias de irradiación (expno 11-18). (B), (C) Visión general del script Matlab para la lectura e integración de los espectros 1D de agua para conjuntos de datos CONDENSE-MT. Los experimentos CONDENSE-MT se presentan como main8. Los límites de integración se introducen como water_left y water_right. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 4: Procesamiento CONDENSE-MT. (A) Primera sección del script de ajuste CONDENSE-MT, que incluye el acoplamiento de recuperación por inversión de agua (sección 1) y la entrada de los parámetros de fondo de agarosa previamente determinados. (B) Ajuste y determinación de la incertidumbre de parámetros de conjuntos de datos CONDENSE-MT. Los parámetros iniciales para el ajuste pueden establecerse dentro del fit0. (C) Trazando la sección del resultado del ajuste CONDENSE-MT. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivos de codificación suplementaria: scripts MATLAB para análisis REDIFINE y CONDENSE-MT. Bruker Topspin codifica para configurar el experimento CONDENSE-MT y los scripts MATLAB usados para procesar y ajustar conjuntos de datos de difusión REDIFINE y conjuntos de datos de transferencia de magnetización CONDENSE-MT, incluyendo integración de datos, análisis de relajación y rutinas globales de ajuste de modelos. MATLAB es necesario para ejecutar los scripts. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Aquí presentamos protocolos detallados para la caracterización sin etiquetar y RMN de condensados biomoleculares bifásicos. Estas incluyen las dos metodologías emergentes, LLPS REDIFINE y un experimento complementario, aunque ortogonal, llamado CONDENSE-MT. Aunque es generalmente aplicable, LLPS REDIFINE se basa en la detección biomolecular y requiere una señal observable al separar las fases para un análisis adecuado. Aunque esto puede limitar la aplicabilidad de REDIFINE, la mayoría de los condensados contienen proteínas con regiones intrínsecamente desordenadas que suelen ser observables mediante RMN. En particular, para los condensados solo de proteína:ARN y ARN, la señal de las biomoléculas en fase condensada se amplía más allá de los límites de detección tras la separación de fases. Si el coeficiente de partición en la fase condensada es alto, casi no se observa señal mediante la RMN convencional. CONDENSE-MT evita esta limitación de detección al ser una técnica observada en agua que se basa en una diferencia significativa en la relajación entre especies moleculares en fases diluida y condensada.

La preparación adecuada de la muestra es clave para la aplicación exitosa tanto de REDIFINE como de CONDENSE-MT. Por ello, es importante asegurarse de que la agarosa esté completamente fundida antes de transferirla a la mezcla, para evitar la formación extensa de burbujas de aire durante la transferencia y proporcionar suficiente material para llenar de forma fiable un tubo de RMN con mezclas bifásicas que tienden a adherirse inicialmente a la pared de vidrio. Para CONDENSE-MT, es crucial transferir de forma reproducible un volumen dado de agarosa, ya que el fondo de agarosa se cuantificará por separado. Si la partición de biomoléculas entre fases condensada y diluida está muy sesgada, o si el intercambio entre fases es muy lento o rápido, los efectos REDIFINE o CONDENSE-MT podrían estar ausentes o ser demasiado débiles para una cuantificación fiable. Esto puede ser una limitación clave de estas técnicas. Sin embargo, en tal caso, aumentar o disminuir la temperatura puede ser útil, ya que la temperatura es un potente modulador de la partición molecular y las tasas de intercambio química. Una vez adquiridos los conjuntos de datos, los resultados óptimos de ajuste suelen obtenerse iterativamente repitiendo la optimización computacional usando los parámetros de mejor ajuste del ajuste inicial o anterior como valores de entrada.

Para sistemas que producen fuertes efectos REDIFINE y CONDENSE-MT, estos experimentos pueden proporcionar información sin etiqueta sobre la partición molecular, los tipos de cambio y la dinámica molecular que son difíciles de lograr con otros métodos sin marcador. Además, los métodos basados en RMN son generalmente no invasivos, permitiendo analizar muestras varias veces o almacenarse durante períodos prolongados, lo que permite el seguimiento de las propiedades del condensado a lo largo del tiempo. Esto es especialmente interesante en el contexto de la maduración patológica del condensado en fibrilización, que resulta difícil de estudiar con métodos complementarios durante periodos de tiempo muy largos.

Dado que los orgánulos celulares sin membrana suelen ser conjuntos multicomponentes con arquitectura compleja, las futuras aplicaciones de esta técnica incluirán la detección y caracterización de sistemas modelo de condensados multicomponente cada vez más sofisticados, así como análisis de condensados en un contexto celular mediante RMN en celda. Sin embargo, esto requiere la adaptación de REDIFINE o CONDENSE-MT a sistemas tan complejos, y se están llevando a cabo esfuerzos para lograrlo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Espectrómetro RMN Avance NEO de 700 MHz	Bruker Biospin	https://www.bruker.com/en.html	Los datos se adquieren en un espectrómetro RMN de 700 MHz.
Topspin	Bruekr Biospin	https://www.bruker.com/en.html	Los datos se procesan mediante este software.
Proteína FUS NTD		N/A	Esta proteína se extrae y purifica en nuestro laboratorio
ARN 31xCAG		N/A	El ARN se produce y purifica en nuestro laboratorio
MATLAB	MathWorks	https://www.mathworks.com/products/matlab.html	Los datos se procesan y visualizan mediante este software.