Combinando inyecciones de colagénasa con sobrecarga mecánica inducida por el ejercicio: un modelo murino que simula la sobrecarga por estrés Lesiones de rodilla

Resumen

Este protocolo describe el establecimiento de un modelo murino de osteoartritis de rodilla inducida por estrés por sobrecarga combinando inyecciones de colagenosa intraarticular con sobreesfuerzo inducido por el ejercicio, proporcionando una plataforma mínimamente invasiva para investigar la patogénesis degenerativa.

Resumen

La osteoartritis de rodilla (KOA) es una enfermedad articular degenerativa multifactorial impulsada por la compleja interacción de la degradación biológica del tejido y la sobrecarga mecánica sostenida. los modelos quirúrgicos convencionales en animales suelen inducir destrucción postraumática de las articulaciones desencadenantes, lo que no logra replicar con precisión la patogénesis gradual y acumulativa de la KOA degenerativa humana. Para cerrar esta brecha traslacional, el presente estudio establece un modelo de ratón novedoso y reproducible que simula la KOA inducida por estrés por sobrecarga mediante la sinergia de una degradación leve del cartílago enzimático con una carga mecánica sostenida. Específicamente, las inyecciones intraarticulares estandarizadas de colagénasa tipo II se combinaron con sobreesfuerzo mecánico diario mediante un aparato de fatiga tipo rotador estrictamente calibrado durante un periodo de cuatro semanas. La eficacia de esta intervención de doble factor fue validada mediante análisis conductuales, histológicos y moleculares integrales. El análisis automatizado de la marcha reveló graves déficits locomotores en el grupo combinado. Estas se caracterizaron por reducciones significativas en la longitud de la zancada, la anchura de la zancada y la superficie máxima de la postura de la pata. Las evaluaciones histomorfológicas utilizando tinción verde O-fast con safranina confirmaron estos déficits funcionales, mostrando daño estructural progresivo en el cartílago, defectos superficiales y puntuaciones significativamente elevadas de la Osteoarthritis Research Society International (OARSI) que reflejan fielmente las características patológicas de los KOA humanos en estadios tempranos a medios. Además, evaluaciones inmunohistoquímicas demostraron una marcada regulación alcista del canal mecanosensible Potencial Transitorio Potencial Vasiloide 4 (TRPV4) y una reducción simultánea en la proteína crucial de la matriz Colágeno Tipo II Alfa 1 (COL2A1) en los condrocitos articulares. Al integrar la inestabilidad articular localizada con el control del estrés mecánico, esta estrategia mínimamente invasiva evita el trauma agudo asociado a los modelos quirúrgicos. Este protocolo establece una plataforma experimental clínicamente relevante para el seguimiento de mecanismos moleculares dinámicos, la evaluación de fenotipos del dolor crónico y la prueba de intervenciones terapéuticas a largo plazo para la osteoartritis en estadio inicial.

Introducción

La artrosis (OA) es una afección degenerativa multifactorial caracterizada por dolor, hinchazón, rigidez y deterioro de la función, que se originan por factores como la obesidad, la tensión mecánica y el trauma¹. La osteoartritis de rodilla (KOA) es muy prevalente y cada vez más común con el envejecimiento, sin embargo, los ensayos clínicos suelen ser limitados en alcance debido a la diversidad de manifestaciones clínicas. Por lo tanto, el desarrollo de tratamientos efectivos requiere modelos animales^{adecuados 2}. Dada la heterogeneidad intrínseca de la OA, no existe un modelo universalmente aceptado como "estándar de oro", lo que exige a los investigadores identificar modelos específicos que se alineen con su investigación científica.

Actualmente, la KOA se caracteriza en la medicina moderna como una condición que implica la interacción de factores mecánicos y biológicos en el cartílago articular y el tejido pericondral. La consecuencia de esta compleja interacción es principalmente el deterioro progresivo del cartílago articular y su matriz^circundante. El estrés mecánico actúa como una señal de transducción crucial que regula diversos procesos fisiológicos y patológicos dentro de las células y tejidos^{articulares 4}. Mantener el cartílago articular en un estado saludable requería una carga mecánica adecuada dentro del rango fisiológico. Por el contrario, la sobrecarga excesiva suele provocar la degeneración del cartílago y el posterior inicio de KOA⁵. Los modelos espontáneos se ven obstaculizados por importantes inversiones de tiempo^{y economía 6}, mientras que los modelos inducidos quirúrgicamente utilizan un enfoque destructivo que representa principalmente KOA en etapa media o avanzada, desviándose de la progresión degenerativa^{natural 7,8}. Por el contrario, los modelos inducidos químicamente se dirigen a la matriz de colágeno pero no capturan los cambios completos de la OA degenerativa humana cuando se usan sin estrés mecánico⁹. Combinar la degradación enzimática con el sobreesfuerzo mecánico aborda estas lagunas al recapitular de forma más fiel la patogénesis gradual de la lesión por estrés por sobrecarga. El objetivo de este estudio es establecer y validar un modelo novedoso de ratón de KOA combinando inyecciones intraarticulares de colagenosa tipo II con sobreesfuerzo utilizando un aparato de fatiga de rueda giratoria.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron conforme a los protocolos aprobados por el Comité de Cuidado y Uso Animal de la Universidad de Medicina Tradicional China de Shanghái. Los experimentos se realizaron bajo una licencia de proyecto (NO.: PZSHUTCM201016022) concedida por el Centro de Animales Experimentales de la Universidad de Ética de la Medicina Tradicional China de Shanghái, en cumplimiento con el Comité de Actualización de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Consejo Nacional de Investigación (EE. UU.).

1. Protocolo de producción de modelos animales

1. Asignar aleatoriamente 32 ratones C57BL/6 de 10 semanas en cuatro grupos: control, colagenasa, ejercicio excesivo y colagénasa + ejercicio excesivo.
   1. Aclimatar a todos los ratones durante una semana bajo condiciones estándar de alimentación y alojamiento antes de iniciar los procedimientos de modelado.
2. Induce los modelos animales durante un periodo de 4 semanas según los grupos experimentales asignados.
   1. Administrar colagenasa tipo II mediante inyección intraarticular a los ratones del grupo colagenasa.
   2. Someta a los ratones del grupo de ejercicio excesivo a entrenamiento con un aparato de ruedas giratorias.
   3. Aplica tanto la inyección intraarticular de colagénasa como el ejercicio de rueda giratoria a los ratones del grupo colagnasa + ejercicio excesivo.
   4. Mantén la misma frecuencia y duración de entrenamiento en todos los grupos de ejercicio relevantes.

2. Protocolo de inyección intraarticular de colagénasa tipo II

1. Anestesia
   1. Induce la anestesia usando isoflurano administrado mediante una máquina calibrada de anestesia gasosa. Realizar inducción rápida a una concentración de isoflurano del 2%–3%.
   2. Mantener la anestesia entre un 1,5% y un 2% de isoflurano. Asegurarse del correcto funcionamiento del sistema de evacuación anestésico para evitar la exposición laboral.
   3. Monitoriza la frecuencia respiratoria y los reflejos del ratón de forma continua durante todo el procedimiento.
2. Preparación de la piel
   1. Aplica crema depilatoria en la zona que rodea la articulación de la rodilla izquierda. Elimina completamente el pelo usando un raspador.
   2. Limpia bien la piel expuesta. Mantén condiciones asépticas durante toda la preparación.
3. Preparación de colagenasa tipo II
   1. Equilibra el polvo de colagénasa tipo II a temperatura ambiente durante 30 minutos en un armario de bioseguridad estéril. Utiliza solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS, pH 7,2–7,4) como disolvente y tampón exclusivo para el proceso de disolución.
   2. Pesa con precisión la masa necesaria de polvo de colagénasa usando una balanza analítica. Añade lentamente el PBS estéril al polvo para alcanzar una concentración final de trabajo de 0,04 U/μL.
   3. Mezcla la solución suavemente pipeteando la mezcla arriba y abajo hasta que esté clara y libre de partículas visibles. Evitar vórtices violentos durante este paso para evitar la pérdida de actividad enzimática.
   4. Centrifugar la solución preparada de 0,04 U/μL a 1.000 rpm durante 5 minutos a 4 °C. Esto elimina las micropartículas no disueltas y previene la obstrucción de la aguja durante la inyección posterior.
   5. Aspira el sobrenadante en tubos estériles y guárdalos en un baño de hielo a 4 °C para su uso inmediato. Prepara la solución de forma fresca para cada sesión para asegurar la máxima actividad enzimática.
4. Inyección intraarticular
   1. Agarra la piel dorsal del ratón usando el pulgar y el índice de la mano no dominante. Asegura ambas extremidades inferiores con el anular y el meñique para extender las articulaciones de la rodilla de forma natural y exponer completamente la zona de inyección.
   2. Sujeta una microjeringa de 10 μL equipada con una aguja de 30 G. Inserta la aguja paralela a la superficie de la piel en la capa superficial de la piel durante aproximadamente 0,2 cm en el punto de entrada.
   3. Ajusta la dirección de la aguja lentamente hasta una orientación perpendicular respecto a la piel cuando la resistencia del tejido disminuya.
   4. Continúa avanzando la aguja aproximadamente entre 0,3 y 0,5 cm hasta que una pérdida de resistencia indique la entrada en la cavidad articular. Retira el émbolo de la jeringuilla lentamente para confirmar la ausencia de reflujo sanguíneo.
   5. Inyectar 5 μL de la solución de colagénasa tipo II (concentración: 0,04 U/μL) en la cavidad articular a velocidad^{constante 10}.
   6. Mantén la posición de la aguja inmediatamente después de la inyección. Presiona suavemente la piel que rodea el lugar de la inyección durante 10–15 segundos.
   7. Retira la aguja despacio. Presiona ligeramente el punto de entrada con una gasa estéril durante 30 segundos para evitar fugas de fármacos.
   8. Coloca al ratón en una jaula doméstica cálida y seca. Deja que el animal se recupere de forma natural de la anestesia, lo que normalmente tarda entre 5 y 10 minutos.
   9. Reanuda las condiciones estándar de alojamiento y alimentación una vez que el ratón se haya recuperado completamente.
   10. Realiza estas inyecciones intraarticulares dos veces por semana, con un intervalo de 3–4 días entre las inyecciones, exclusivamente durante el periodo de modelado de 4 semanas (tras la aclimatación inicial de 1 semana).
   11. Desecha todos los objetos punzantes inmediatamente en recipientes aprobados para riesgos biológicos.
       NOTA: Asegurarse de que el personal capacitado realice todas las inyecciones para minimizar las lesiones articulares y la variabilidad experimental.

3. Protocolo de sobreesfuerzo inducido por rueda giratoria

1. Preparación de aparatos y control de seguridad
   1. Ajustar la velocidad del aparato de fatiga tipo rotador a 12 rpm (equivalente a aproximadamente 0,063 m/s) y la duración a 2 horas por sesión.
   2. Enciende el módulo de estimulación eléctrica. Confirma que la salida de corriente está dentro del rango seguro preestablecido de 0,1–0,3 mA. No aumentes la intensidad de la corriente manualmente.
      PRECAUCIÓN: Utiliza el módulo de estimulación eléctrica estrictamente para guiar a los ratones de vuelta a la rueda, no como un estímulo punitivo. Revisa el cableado del aparato en busca de daños y asegúrate de tener un buen contacto con los electrodos antes de usarlo para evitar cortocircuitos y descargas eléctricas.
2. Formación de aclimatación
   1. Asegúrate de que las cámaras giratorias de las ruedas del aparato de fatiga estén limpias, secas y libres de residuos. Desactiva los electrodos de estimulación eléctrica en la entrada de la rueda para eliminar cualquier posible estrés relacionado con la estimulación.
   2. Manipula cada ratón suavemente por la base de la cola o recoge a cada ratón usando tejido blando estéril. Coloca los ratones individualmente en la región central de la superficie de marcha de la rueda giratoria.
   3. Coloca al ratón en una postura natural cuadrúpedo de pie sobre la superficie horizontal de carrera. Orienta el cuerpo paralelo al eje central de rotación de la rueda con las patas delanteras hacia delante y las traseras ligeramente hacia atrás.
   4. Utiliza una barrera blanda temporal y no restrictiva para evitar que el ratón entre en la zona estrecha de electrodos durante los primeros 2 minutos. Retira la barrera tras este periodo para que el ratón pueda explorar toda la cámara libremente.
   5. Deja a los ratones en el aparato fijo durante 10 minutos diarios durante los primeros 3 días. No inicies la rotación de la rueda ni inicies ninguna estimulación eléctrica durante este periodo.
   6. Vigila al ratón en busca de signos de estrés severo como congelación persistente o crianza excesiva. Recoloca el ratón suavemente en la zona central de la rueda si muestra un comportamiento anormal para restaurar una postura natural.
   7. Arranca el volante a una velocidad de 5 rpm durante 30 minutos en el día 4. Este paso acostumbra a los ratones al ritmo de movimiento del aparato sin el uso de señales eléctricas.
   8. Guía manualmente los ratones de vuelta al centro de la rueda si caen o se detienen durante la fase de adaptación rítmica. Asegúrate de que la estimulación eléctrica permanezca desactivada durante todo el periodo de aclimatación de 4 días.
      PRECAUCIÓN: Evita usar estimulación eléctrica durante la fase de aclimatación para prevenir respuestas al estrés inducidas por miedo y asegurar el cumplimiento de la formación futura.
3. Ejecución formal del ejercicio
   1. Realizar la formación formal a una hora fija cada día (por ejemplo, de 9:00 a 11:00 AM). Lleva guantes aislantes para colocar los ratones en el aparato de fatiga tipo rotador.
   2. Cierra la puerta del aparato. Inicia los parámetros preestablecidos de 12 rpm (~0,063 m/s) para una duración máxima de 2 horas por sesión (véase la Figura 1).
      PRECAUCIÓN: Vigila a los ratones de forma continua durante el entrenamiento. Pausa el entrenamiento durante 5 minutos si un ratón cae continuamente (más de 3 veces en 1 minuto) para evitar un agotamiento severo y lesiones inducidas por estrés.
4. Determinación y estimulación de la fatiga final
   1. Monitoriza continuamente a los ratones para evaluar su estado de fatiga. Terminar la sesión de entrenamiento antes de tiempo, sin forzar la duración completa de 2 horas, si un ratón cumple al menos dos de los cuatro criterios específicos de fatiga para evitar el exceso de estrés.
   2. Define el Criterio 1 como la incapacidad de permanecer en la rueda de roda durante más de 5 segundos antes de caer. Define el Criterio 2 como un aumento significativo de la frecuencia de caída de 3 o más veces en un periodo de 1 minuto.
   3. Define el Criterio 3 como la falta de intención voluntaria de volver a la rueda, donde el ratón permanece inmóvil o se mueve solo brevemente a pesar de la estimulación eléctrica.
   4. Defina el Criterio 4 como la presentación de posturas locomotoras anormales. Busca señales evidentes como arrastrar las extremidades o un paso tambaleante.
   5. Permite que el aparato active automáticamente una estimulación eléctrica leve cuando un ratón cae hacia la entrada del spinner. Asegúrate de que la estimulación eléctrica se detenga inmediatamente en cuanto el ratón vuelva a la^{rueda 11}.
      PRECAUCIÓN: Termina el entrenamiento inmediatamente si el ratón presenta condiciones anormales como convulsiones o disnea. Retira al ratón del aparato y proporciona tratamiento sintomático si es necesario.
5. Procesamiento y frecuencia post-entrenamiento
   1. Apaga la alimentación del aparato después de que termine el entrenamiento. Lleva guantes aislantes para retirar los ratones y devuélvelos a sus jaulas de casa.
   2. Proporciona a los ratones agua potable adecuada. Observa a los animales en busca de cualquier actividad anormal, estado mental o problemas en las extremidades (por ejemplo, claudicación o temblores musculares).
   3. Registra cualquier anomalía y proporciona tratamiento oportuno.
   4. Mantén esta frecuencia de entrenamiento de una vez al día, 2 horas por sesión, durante 4 semanas consecutivas. Mantén los parámetros de entrenamiento y la monitorización de la seguridad consistentes durante todo el periodo.
      NOTA: Verifique que el aparato de fatiga y el módulo de estimulación eléctrica funcionen correctamente antes de cada sesión diaria de entrenamiento para asegurar una intensidad de estimulación constante.

4. Análisis de la marcha

1. Resumen del sistema
   1. Realiza la adquisición y análisis de la marcha utilizando un sistema automatizado de imagen de la marcha.
   2. Realizar todos los procedimientos de marcha en 32 ratones C57BL/6 de 10 semanas tras el periodo de modelado de 4 semanas.
   3. Coloca la cámara de alta velocidad bajo la cinta transparente de la cinta para capturar imágenes ventrales durante la locomoción.
2. Aclimatación y preparación
   1. Aclimata a todos los ratones al aparato de la cinta antes de la recogida formal de datos para minimizar el estrés.
   2. Ajusta la velocidad de la cinta a 20 cm/s para igualar el ritmo fisiológico de los ratones.
   3. Registrar tres ensayos válidos independientes por ratón con un intervalo de descanso de 2 minutos entre ensayos.
3. Grabación de la prueba y selección de zancadas
   1. Permite que el ratón camine de forma continua durante un periodo de adquisición de 60 segundos en cada prueba.
   2. Realiza una prueba de reemplazo si una grabación es inválida debido a "congelamiento", saltos o giros.
   3. Inicia la recogida de datos solo después de que el ratón haya alcanzado una locomoción estable y constante durante al menos 10 segundos.
   4. Selecciona un mínimo de 4 pasos completos consecutivos de cada ensayo de 60 segundos para el análisis.
   5. Asegúrate de que dos observadores independientes y cegados realicen la selección de pasos para eliminar el sesgo subjetivo.
   6. Confirma que el ratón mantiene una postura cuadrúpedo natural sin saltos ni fluctuaciones bruscas de velocidad.
   7. Verifica que la zancada incluya tanto una fase de postura con carga de peso como una fase de oscilación de propulsión hacia adelante.
   8. Revisa imágenes claras de contacto con cinturones de patas sin pérdida de seguimiento, borrosidad o contaminación.
4. Procesamiento de imágenes y extracción de parámetros
   1. Utiliza los algoritmos integrados del software del sistema para digitalizar imágenes capturadas y detectar puntos de contacto tipo cinturón de patas.
   2. Calcula la relación Swing/stance como la relación entre la duración de la fase del swing y la duración de la fase de la postura.
   3. Mide la longitud de la zancada (cm) como la distancia lineal recorrida durante una sola zancada completa.
   4. Mide el ancho de zancada (cm) como la distancia horizontal entre los bordes mediales de las patas traseras contralaterales en la posición máxima.
   5. Determina el área de la pata en la postura máxima (cm²), que representa el área total de contacto en la máxima capacidad de apoyo.
   6. Calcula la variabilidad del área de la pata (cm²) como el coeficiente de variación del área de contacto a lo largo de zancadas consecutivas.
   7. Calcula el valor medio de los 3 ensayos válidos para cada ratón individual y exporta los conjuntos de datos finales.
      NOTA: Excluyan del análisis los ensayos con comportamientos irregulares de detenerse, saltar o girar.

5. Histología

1. Recogida y fijación de tejidos
   1. Eutanasiar a todos los ratones de forma humana mediante luxación cervical tras el periodo de inducción de 4 semanas. Disecciona cuidadosamente la articulación de la rodilla izquierda y elimina el exceso de tejido blando circundante.
   2. Sumergir la muestra inmediatamente en un fijador preenfriado al 4% de paraformaldehído (PFA) (p/v). Asegúrate de que el volumen del fijador sea de 10 a 15 veces el volumen de la muestra para sumergir completamente el tejido.
   3. Fija el pañuelo a temperatura ambiente durante 48 horas. Agita suavemente el recipiente de fijación cada 8 horas para asegurar una penetración adecuada del fijador.
2. Descalcificación tisular
   1. Enjuaga la muestra fija con agua que corre lentamente durante 10 minutos. Repite este proceso de enjuague tres veces para eliminar el PFA residual.
   2. Transfiere la muestra a una solución de descalcificación de ácido etilendediaminético (EDTA) de 0,5 mol/L (pH 7,2–7,4). Mantener el volumen de la solución de descalcificación en 20 veces el volumen de la muestra y almacenarlo a 4 °C.
   3. Descalcifique el tejido durante 14–21 días. Sustituye el líquido viejo por una solución nueva de descalcificación con EDTA cada 3 días.
   4. Prueba el punto final de la descalcificación perforando suavemente el hueso subcondral con una aguja estéril. Concluye el proceso de descalcificación cuando la aguja penetre suavemente sin resistencia.
   5. Lava la muestra completamente descalcificada bajo agua corriente durante 2 horas para eliminar el residuo de EDTA. Lava la muestra posteriormente con solución salina tamponada con fosfato (PBS) tres veces durante 5 minutos cada una.
3. Incrustación y seccionado
   1. Deshidratar la muestra descalcificada secuencialmente usando una serie de etanol graduada (70%, 80% y 90% durante 2 horas cada uno; 95% durante 1 hora; etanol absoluto dos veces durante 1 hora cada uno).
   2. Elimina el tejido deshidratado en xileno dos veces durante 10 minutos cada una. Insumerge el tejido desinfectado en parafina.
   3. Corta el tejido incrustado en parafina en secciones sagitales continuas de 5 μm de grosor usando un microtomo. Montar las secciones sobre portaobjetos de vidrio recubiertos de poli-L-lisina y hornearlas en una placa eléctrica secadora a 60 °C durante 2 horas.
4. Evaluación histomorfológica
   1. Teñe las secciones con safranina O-fast verde para evaluar la histomorfología del cartílago articular.
   2. Evalúa la degeneración del cartílago utilizando el sistema de puntuación de la Osteoarthritis Research Society International (OARSI) en condiciones de doble^{ciego 12}.
5. Flujo de trabajo central en inmunohistoquímica (IHC)
   1. Deparafina las secciones en xileno dos veces durante 10 minutos cada una. Rehidrata las secciones secuencialmente mediante una serie de etanol graduado hasta agua desionizada.
   2. Sumergir las secciones en un tampón de citrato de 0,01 mol/L (pH 6,0) para la recuperación de epítopos de calor inducida por microondas. Calienta el buffer hasta que hierva a alta potencia y luego mantén un cocido suave a potencia media durante 15 minutos.
   3. Enfría las secciones de forma natural hasta que se haga a temperatura ambiente. Lava las láminas con PBS tres veces durante 5 minutos cada una
   4. Incubar las secciones en una solución de metanol al 3% de peróxido de hidrógeno (H2O2) durante 20 minutos a temperatura ambiente para bloquear la actividad endógena de la peroxidasa. Lava las láminas con PBS tres veces durante 5 minutos cada una.
   5. Aplica una solución bloqueadora de suero de cabra al 5% en las secciones. Incuba durante 60 minutos a temperatura ambiente para bloquear los sitios de unión inespecíficos.
   6. Desecha la solución bloqueadora sin lavar. Aplicar la solución primaria específica de acción de anticuerpos (Transient Receptor Potential Vanilloid 4 (TRPV4) a 1:100, Caspasa-3 a 1:200, o Colágeno Tipo II Alfa 1 (COL2A1) a 1:150 de dilución).
   7. Incubar las secciones con el anticuerpo primario en una cámara humidificada a 4 °C durante la noche durante 12–16 horas.
   8. Equilibra las secciones a temperatura ambiente durante 30 minutos al día siguiente, luego lávate con PBS tres veces durante 5 minutos cada una. Aplicar un anticuerpo secundario IgG anti-conejo o anti-ratón conjugado con peroxidasa picante (HRP) (dilución 1:500).
   9. Incuba las secciones con el anticuerpo secundario durante 60 minutos a temperatura ambiente. Lava las láminas con PBS tres veces durante 5 minutos cada una.
   10. Aplica una solución de cromógeno 3,3'-diaminobenzidina (DAB) e incuba en la oscuridad durante 3–5 minutos a temperatura ambiente. Detener la reacción inmediatamente con agua desionizada cuando aparezca una señal marrón clara bajo observación microscópica.
   11. Contrateñe las secciones con una solución de hematoxilina durante 5 minutos. Enjuaga bajo agua corriente durante 10 minutos para que la mancha se vuelva azul.
   12. Diferencia las secciones usando una solución ácida al 1% durante 30 s. Enjuaga los tobogáns bajo agua corriente durante 5 minutos.
   13. Deshidrata rápidamente las secciones mediante una serie de etanol graduado y limpia el tejido en xileno dos veces durante 10 minutos cada una.
   14. Monta las correderas usando bálsamo neutro y cúbrelas con cubiertas de resina óptica. Deja que las correderas montadas se sequen a temperatura ambiente.
6. Controles IHC y análisis de imágenes
   1. Establezca un control negativo reemplazando el anticuerpo primario por PBS durante el procedimiento de tinción. Incluye una sección de tejido cartílago positiva conocida como control positivo para verificar la eficacia de los anticuerpos.
   2. Adquiere las imágenes de la sección teñida usando un escáner de diapositivas completa a aumentos del 40× y 100×.
      NOTA: Realizar todas las evaluaciones histológicas de forma independiente por al menos dos observadores ciegos para reducir el sesgo subjetivo.

6. Análisis estadístico

1. Manejo de Datos y Pruebas Generales
   1. Realizar toda la recogida y análisis de datos en condiciones de ciego para minimizar el sesgo experimental.
   2. Analizar las variables continuas entre los cuatro grupos experimentales utilizando un análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) para comprobar las diferencias generales.
   3. Aplicar la prueba H de Kruskal-Wallis a cualquier variable que no cumpla las suposiciones paramétricas necesarias.
2. Pruebas Post Hoc y umbrales de significación
   1. Realiza comparaciones post hoc por pares usando la prueba de Tukey para identificar diferencias específicas de grupo si la ANOVA inicial indica significación estadística.
   2. Confía únicamente en la prueba de Tukey para controlar la tasa de error familiar. No combines esto con métodos adicionales de corrección por comparación múltiple.
   3. Defina la significación estadística de forma uniforme como p < 0,05

Resultados

Análisis de la marcha
Parámetros del ciclo de marcha: Se evaluó la relación balanceo/postura—definida como la relación entre la duración de la fase de swing sin carga de peso y la fase de postura de apoyo de una sola zancada—para reflejar el equilibrio entre carga de peso y propulsión. En comparación con el grupo control (2,10 ± 0,06), los ratones que recibieron una inyección intraarticular de colagénasa (1,45 ± 0,05) o que realizaron ejercicio excesivo (1,68 ± 0,05) ...

Discusión

En este estudio, desarrollamos un modelo novedoso de KOA en ratones que imita los efectos del estrés excesivo en la articulación combinando la inyección intraarticular de colagénasa con entrenamiento de ejercicio que induce fatiga mediante ruedas. Estos hallazgos confirman una vez más la idea de que la KOA surge de la interacción de factores biológicos y mecánicos. Comprender e identificar estos factores es prometedor para diseñar planes de tratamiento individualizados y estrategias prev...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Fijador de paraformaldehído al 4%	Beyotime	P0099
Ácido acético	Sinopharm	631-61-8
Sistema de imagen DigiGait para ratones	Ciencias de la Vida RWD	MSI-DIG-MS
Solución EDTA	Procell	PB180320
Incrustación de casetes	Leica	IP C
Etanol	Sinopharm	64-17-5
Tinte verde rápido	Leyan	1085995
Crema depilatoria	Veet	G20161330
Hematoxilina	Adamas	61753A
Centrífuga refrigerada de alta velocidad	Hermle	Z366K
Incubadora	TAITEC	M-210FN
Máquina de anestesia inhalada	Ranger	RZ-Viking
Isoflurano	Webio	W100
Microtomo	Ted Pella	10180-220
Aparato de fatiga tipo rotador de ratón	Tecnología Biológica Beijing Zhishu Duobao	YLS-10B
Balsámico neutro	Sinopharm	96949-21-2
Mancha Safranin O	Bioss	S0062
Centro semiautomático de incrustación de tejido	Thermo Fisher	HistoStar
Placa eléctrica de secado por corredera	Ciencias de la Microscopía Electrónica	XH-2002
Baños de agua de flotación de tejidos	BIOBASE	BT-I
Colagenasa tipo II	Sigma-Aldrich	C4-22-1G
Escáner de diapositivas completo	Leica	Aperio VERSA
Xileno	Sinopharm	1330-20-7