Ingeniería de un modelo preclínico murino de alta fidelidad para metástasis cerebral utilizando la técnica de inyección pulsátil interlock y reparación vascular microquirúrgica

Resumen

Este estudio establece modelos murinos de alta fidelidad de metástasis cerebral mediante inyección intracarótida transitoria de células tumorales mediante inyección pulsátil Interlock y reparación microquirúrgica. Preserva el flujo sanguíneo cerebral, previene la oclusión de la arteria carótida común y proporciona modelos preclínicos superiores con mejores tasas de metástasis tumorales y reducción de la mortalidad.

Resumen

La metástasis cerebral sigue siendo un problema clínico devastador. Un gran desafío en la investigación sobre metástasis cerebrales es la falta de modelos de alta calidad que recapitulen con precisión el proceso metastásico, permitiendo así una visión mecanicista de cómo las células cancerosas colonizan el cerebro. Los modelos tradicionales de inyección intracarótida de metástasis cerebral suelen requerir una ligadura permanente de la arteria carótida común (CCA), lo que altera la hemodinámica cerebral y compromete la integridad de la barrera hematoencefálica (BBB). El protocolo presenta un método refinado para establecer un modelo murino de alta fidelidad para la metástasis cerebral. La innovación principal implica la técnica de Inyección Pulsátil Interlock (IPI) para la entrega de células tumorales, seguida de una reconstrucción arterial microquirúrgica en el lugar de la punción para restaurar el flujo sanguíneo fisiológico en el CCA. En comparación con el modelo convencional de ligadura CCA, el enfoque de reparación microquirúrgica IPI redujo significativamente la mortalidad perioperatoria (2,86% frente a 25,71%) y aumentó la tasa de establecimiento de metástasis cerebrales (94,12% frente a 65,38%). La técnica IPI utiliza una configuración de jeringuilla en tándem para minimizar la regurgitación celular durante la inyección intracarótida. Tras la infusión de células tumorales, el ACC se repara meticulosamente mediante suturas microquirúrgicas bajo un estereomicroscopio, evitando así una oclusión permanente. Esto preserva la hemodinámica cerebral nativa y la integridad del BBB en el momento de la entrada de las células tumorales, al tiempo que mejora significativamente las tasas de éxito quirúrgico y reduce la mortalidad. Las lesiones intracraneales metastásicas se validan mediante imágenes de bioluminiscencia en serie e histopatología. El método proporciona una plataforma superior para estudiar la fisiopatología de la metástasis cerebral y para la evaluación terapéutica preclínica, recapitulando así el proceso metastásico.

Introducción

Las metástasis cerebrales representan el tipo más común de tumor cerebral maligno en adultos, ocurriendo aproximadamente diez veces más frecuentemente que los tumores cerebrales^{primarios 1}. Se estima que entre el 10% y el 20% de los pacientes con cáncer sistémico desarrollarán metástasis cerebrales durante las fases avanzadas de su enfermedad, lo que es una de las principales causas de^{mortalidad 1,2}. A pesar de los avances significativos en el tratamiento de los cánceres primarios, el pronóstico para pacientes con metástasis cerebrales sigue siendo pobre. La tasa de supervivencia a un año de los pacientes con metástasis cerebral es inferior al 20%³. El mecanismo de por qué y cómo algunos cánceres metastatizan al cerebro sigue siendo desconocido. El desafío terapéutico se ve agravado por la biología única de las metástasis cerebrales, incluyendo la presencia del BBB, el microambiente inmunológico cerebral distintivo y las complejas interacciones de las células tumorales con las células^{neurogliales 4,5}.

Tanto la investigación farmacodinámica como la patogénesis sobre la metástasis cerebral dependen en gran medida de modelos animales preclínicos precisos que recapitulan con exactitud el proceso de enfermedad humana. Los modelos animales actuales de metástasis cerebral, aunque ampliamente utilizados, se basan principalmente en la implantación ortotópica intracraneal, inyección intravenosa o en venas caudales, inyección intracardíaca o inyección intracarótida 6,7,8,9,10. Sin embargo, estos modelos reflejan imperfectamente la progresión de la enfermedad humana, sin lograr a menudo capturar pasos clave como la extravasación de células tumorales a través de una BBB intacta bajo condiciones de flujo^{fisiológico 11}. Las inyecciones intravenosas e intracardíacas resultan en una baja eficiencia específica de formación tumoral cerebral y a menudo conducen a metástasis extracraneales generalizadas, causando muerte prematura de animales antes de que se desarrollen metástasis cerebrales^{sustanciales 12}. El método tradicional de inyección de la arteria intracarótida aumenta las tasas de formación de tumores intracraneales, pero requiere una ligadura permanente de la CCA. Al alterar la hemodinámica cerebral, esta ligadura puede inducir isquemia en regiones cerebrales ipsilaterales y afectar los patrones fisiológicos de flujo sanguíneo necesarios para la entrega de células tumorales, afectando así su distribución espacial y nicho de colonización dentro del^{cerebro 13,14}.

Los modelos animales de alta calidad que puedan imitar más fielmente la fisiopatología de la metástasis cerebral son^{cruciales 15}. Un modelo ideal de metástasis cerebral debería recapitular toda la cascada metastásica, incluyendo el retorno de células tumorales a la vasculatura cerebral, la extravasación a través de la barrera hematoencefálica (BBB) y las interacciones dinámicas con el microambiente^{cerebral 16}. La alta fidelidad de los modelos es fundamental tanto para estudios mecanicistas como para la evaluación^{terapéutica 6}. Sin embargo, los modelos existentes de inyección intracarótida no reproducen completamente condiciones fisiológicas clave, especialmente la preservación del flujo sanguíneo cerebral normal y la distribución natural de las células tumorales circulantes.

Para superar las limitaciones de los modelos preclínicos existentes de metástasis cerebral, se desarrolló un modelo animal de alta fidelidad que recapitula con mayor precisión la cascada metastásica basado en la técnica IPI y la reparación arterial microquirúrgica. Este método implica una oclusión arterial transitoria tras la inyección de células tumorales, seguida de una reparación meticulosa del sitio de punción arterial para restablecer el flujo sanguíneo fisiológico hacia la CCA ipsilateral. Este enfoque no solo mejora la consistencia y las tasas de éxito del modelo, sino que, de manera crucial, preserva la BBB manteniendo la hemodinámica cerebral nativa. Al minimizar la interrupción del flujo sanguíneo cerebral, el modelo modificado de inyección intracarótida proporciona una plataforma de alta fidelidad que recapitula con mayor precisión el proceso natural de colonización metastásica cerebral, ofreciendo así una herramienta mejorada para investigar los mecanismos de metástasis cerebral y evaluar posibles terapias.

Protocolo

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal (IACUC) del Instituto de Biofísica de la Academia China de Ciencias (número de aprobación: SYXK2021124). Los animales que alcanzaron objetivos predefinidos fueron eutanasiados de acuerdo con las Directrices para la Eutanasia de Animales del Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal (IACUC) del Instituto de Biofísica de la Academia China de Ciencias y las Directrices AVMA para la Eutanasia de Animales (2020⁾¹⁷.

1. Preparación de la suspensión de celda única

1. Cultivar células B16F10 y 4T1 en medio completo de RPMI-1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina.
2. Mantener las células a 37 °C en una incubadora humidificada con un 5% de CO₂.
3. Confirmar la expresión de luciferasa y verificar la ausencia de contaminación por micoplasma un día antes de los procedimientos quirúrgicos.
4. El día de la operación quirúrgica, extraer las células cuando alcancen el 80% de confluencia primero lavándolas con solución fisiológica con suero tamponado con fosfato (PBS) antes de la tripsinización (0,25%) durante menos de 3 minutos a 37 °C.
5. Añade un 10% de medio RPMI-1640 con FBS en las células para disipar el 0,25% de tripsina.
6. Centrifuga las celdas a 300 × g durante 3 minutos. Lava las células dos veces en PBS para eliminar el suero residual y luego cuéntalas con un hemotómetro.
7. Utilice el ensayo de exclusión de azul de Trypan para confirmar que la viabilidad celular se mantiene entre el 90% y el 95% durante la inyección.
8. Resuspende las células en PBS a 2 × 10⁶ células/mL. Mantén las células en hielo hasta la inyección.
   NOTA: Se pueden utilizar células B16F10 y 4T1 marcadas con luciferasa. B16F10 se presenta como el ejemplo representativo.

2. Preparación de ratones y preparación perioperatoria

1. Utiliza ratones machos C57BL/6 de 7–8 semanas.
2. Coloca una almohadilla térmica bajo la placa quirúrgica para evitar la hipotermia. Enciende la almohadilla térmica 30 minutos antes de la cirugía.
3. Esteriliza todos los instrumentos quirúrgicos, la placa quirúrgica y la jaula con un autoclave. Desinfecta el estereomicroscopio y la mesa quirúrgica con etanol al 75%.
4. Otros artículos que no pueden ser esterilizados mediante autoclavado deben desinfectarse mediante irradiación UV y etanol al 75% (Figura 1A).
5. Pesa al ratón antes de la anestesia y registra el peso preoperatorio como referencia.
6. Añade 10 g de tribromoetanol a un tubo de centrífuga y luego 10 mL de alcohol amílico terciario. Sacude el tubo hasta que el tribromoetanol esté completamente disuelto.
   NOTA: El tribromoetanol puede causar efectos adversos, incluyendo mortalidad; Monitoriza cuidadosamente la profundidad de la anestesia.
7. Filtra la solución a través de un filtro de 0,22 μm para preparar una solución 100% de stock.
8. Diluye la solución 100% de stock con 0,9% de NaCl salina o diluyente hasta una solución de trabajo al 2,5% (dilución 1:40). La eficacia de cada solución de trabajo recién preparada debe ser probada para anestesia en ratones.
9. Anestesiar ratones mediante inyección intraperitoneal (i.p.) de tribromoetanol al 2,5% a 0,2 mL/10 g de peso corporal. Cuando sea necesario, prolonga la anestesia administrando una dosis adicional a un tercio del volumen anestésico original (Figura 1B).
   NOTA: Ajusta la dosis de anestesia según el peso corporal y monitoriza continuamente la respiración.
10. Asegúrate de que el ratón esté completamente anestesiado aplicando un estímulo leve (por ejemplo, pellizco en el dedo del pie) y observando que no haya respuesta motora.
11. Afeita el pelaje de la zona del cuello y haz una marca de corte en el dedo del pie tras la anestesia.
12. Aplica pomada para ojos para proteger los ojos de la sequedad.
13. Coloca al ratón sobre una placa quirúrgica y asegura las 4 extremidades y los incisivos superiores con cinta adhesiva (Figura 1C).
14. Monitoriza la profundidad de la anestesia evaluando la frecuencia respiratoria y el reflejo de pellizco para asegurarte de que los ratones permanezcan indoloros e inmóviles durante el procedimiento.
15. Los animales se asignan aleatoriamente a grupos experimentales, y el análisis de imagen fue realizado por investigadores cegados a la asignación de grupos.

3. Procedimientos quirúrgicos estándar de la técnica IPI y reparación microquirúrgica

1. Desinfecta la región del cuello con una solución de povidona-yodo y deja que la piel se seque completamente antes de proceder (Figura 1D).
2. Drapear al ratón de forma aséptica usando una cortina quirúrgica estéril, exponiendo solo la zona del cuello (Figura 1E).
3. Realizar una incisión cervical en la línea media de aproximadamente 0,8–1 cm de longitud con tijeras quirúrgicas estériles, con pinzas finas para la retracción del tejido (Figura 2A).
4. Realizar una disección roma de la fascia superficial y los músculos subyacentes utilizando pinzas de ángulo fino para exponer la vaina carótida derecha (Figura 2B1, Figura 2C1).
5. Aislar la arteria carótida externa derecha (ECA) de la vaina carótida y ligar la ECA derecha para evitar la fuga celular hacia las ramas extracraneales (Figura 2B2, Figura 2C2).
6. Aislar cuidadosamente el CCA derecho dentro de la vaina carótida, preservando el nervio vago situado lateralmente y bajo el vaso (Figura 2C1).
7. Coloca un pequeño trozo de guante de goma y una bola de algodón humedecida con suero bajo el CCA derecho aislado como almohada para elevar y estabilizar el vaso.
   NOTA: Elevar el CCA estabiliza el vaso y facilita una punción e inyección precisas. (Figura 2B4, Figura 2C4).
8. Coloque dos nudos sin apretar con lazos abiertos en el CCA distal y proximal al algodón, y luego ate el nudo proximal (Figura 2B3, Figura 2C3).
9. Aplica un clip microvascular en el CCA cerca del nudo distal no apretado para bloquear temporalmente el flujo sanguíneo del CCA (Figura 2B4, Figura 2C4).
10. Implantación de células cancerosas
    1. Pinchazo de interbloqueo
       1. Pincha el segmento elevado del CCA derecho usando una aguja de 32G con el bisel orientado hacia arriba.
       2. Retira la jeringuilla inicial manteniendo el lugar de la punción.
       3. Mezcla la suspensión de células cancerosas con vórtices y toma 100 μL en la jeringuilla de microlitros, asegurando que no se aspiren burbujas de aire.
       4. Inserta la punta de la aguja de la jeringuilla de microlitros en el sitio de punción creado en el paso 3.10.1.1 y mantenla firme sin iniciar la inyección para asegurar una posición estable antes de la entrega celular (Figura 2B, Figura 2C5, Figura suplementaria 1).
          NOTA: Utilice una jeringuilla de 32G para la perforación y una jeringuilla de microlitros para la inyección para asegurar una posición estable y una administración controlada. La Figura 1 complementaria muestra los parámetros de las dos jeringuillas. El diámetro exterior de la jeringuilla de 32G es de 0,22 mm, mientras que la aguja de la jeringuilla de microlitros mide 0,26 mm, lo que facilita la inserción segura y la inyección controlada.
    2. Inyección pulsátil (Figura 2C5)
       1. Retira el clip microvascular aplicado en el paso 3.9.
       2. Inicia la inyección de la suspensión de células tumorales en la ICA a través de la jeringuilla de microlitros.
       3. Administra la suspensión mediante un movimiento de inyección pulsátil, avanzando suavemente el émbolo de la jeringuilla en pequeños pulsos en lugar de presión continua.
       4. Administrar la suspensión utilizando uno de los siguientes criterios: el criterio del ciclo cardíaco, inyectar ~1 μL de suspensión celular cada 8 ciclos cardíacos guiados por flujo sanguíneo retrógrado pulsátil en la arteria carótida interna distal; o el criterio de la tasa de inyección, inyectando ~1 μL/s asegurándose de que la tasa no supere los 60 μL/min.
       5. Monitoriza el vaso durante la inyección. La entrega exitosa se indica cuando el recipiente rojo se vuelve temporalmente transparente a medida que la suspensión pasa por la luz, sin extravasación visible alrededor del lugar de la punción.
       6. Tras completar la inyección, retira cuidadosamente la jeringuilla de microlitros.
       7. Apriete inmediatamente el nudo distal de forma controlada para sellar el vaso y minimizar la regurgitación (Figura 2B6, Figura 2C6).
          NOTA: La inyección pulsátil reduce la sobreperfusión y minimiza el riesgo de elevación de la presión intracraneal.
11. Reparación microquirúrgica (Figura 2B6, Figura 2C6)
    1. Utiliza una sutura microquirúrgica de nylon 10-0 para cerrar el lugar de la punción de forma hermética, posicionando los puntos de entrada y salida de la aguja justo al lado del margen del defecto para minimizar la fuga vascular y preservar la patencia luminal.
    2. Pasar la aguja de sutura microquirúrgica por el orificio de la perforación en la pared del vaso bajo alta magnificación y dejar la sutura suelta temporalmente.
    3. Lava el campo quirúrgico con solución fisiológica heparinizada.
    4. Asegura la sutura con dos o tres nudos cuadrados.
    5. Recorta los extremos libres de la sutura aproximadamente entre 1 y 2 mm para evitar aflojarse y minimizar la carga de cuerpo extraño.
       NOTA: Los procedimientos quirúrgicos estándar de la técnica IPI y la reparación microquirúrgica se describen en el Vídeo Suplementario 1.

4. Restauración del flujo sanguíneo del CCA

1. Afloja poco a poco el nudo proximal.
2. Enjuaga la luz para eliminar cualquier posible coágulo microscópico. Coloca una bola de algodón seca en el campo quirúrgico para controlar el sangrado excesivo.
3. Una vez que no se confirme derrame activo en el lugar de la punción, afloje cautelosamente el nudo distal para restaurar el flujo sanguíneo carotídeo (Figura 2B7, Figura 2C7).

5. Confirmar la reparación exitosa

1. Restauración de la pulsación
   1. Observa la CCA para pulsaciones robustas, indicando reperfusión exitosa.
2. Verifica la patencia y la integridad de la embarcación
   1. Inspecciona el lugar de reparación para asegurarse de que está libre de estenosis y que el lumen permanece patente y continuo con el segmento proximal del vaso.

6. Riego y cierre por heridas

1. Irriga el campo quirúrgico a fondo con solución fisiológica normal no heparinizada para eliminar restos y coágulos sanguíneos.
2. Cierra la incisión cutánea usando una sutura continua.
   NOTA: Mantenga el campo quirúrgico húmedo y realice todas las manipulaciones con delicadeza para minimizar la lesión tisular.

7. Cuidados postoperatorios

1. Soporte de líquidos: administrar 0,5–1 mL de solución salina estéril tibia por vía subcutánea inmediatamente después de la cirugía para compensar la pérdida de líquido perioperatorio.
2. Profilaxis de infecciones: Si la duración de la operación supera los 40 minutos, administra enrofloxacina (5 mg/kg, una vez al día) durante 3 días consecutivos. No se requieren antibióticos si el procedimiento dura menos de 40 minutos.
3. Nutrición e hidratación: Proporciona hidrogel o alimentos ablandados durante al menos una semana después de la operación para asegurar una hidratación y nutrición adecuadas.
4. Monitorización diaria: Realiza evaluaciones de salud diarias, observando comportamientos circulares, déficits neurológicos, infecciones de heridas y pérdida de peso.
5. Curso postoperatorio esperado: Durante las primeras 48 horas, los ratones pueden mostrar actividad reducida, piloerección leve y pérdida de peso hasta el 15% del valor inicial preoperatorio, seguido de una recuperación gradual.
6. Analgesia: Administrar meloxicam (5 mg/kg, por vía subcutánea) una vez al día durante 2–3 días para aliviar el dolor y promover la recuperación.

8. Criterios de evaluación para el establecimiento exitoso de modelos animales

1. Monitorización del peso corporal
   1. Pesa los ratones a diario y registra el peso corporal.
2. Evaluación clínica
   1. Evalúa los signos clínicos a diario, incluyendo la postura y el comportamiento de círculos.
3. Imagen bioluminiscencia
   1. Enciende los interruptores de encendido del instrumento de imagen y del ordenador.
   2. Inicia el software de análisis de imagen por bioluminiscencia (Versión 4.7.2) y haz clic en "Inicializar" para iniciar el sistema de imagen por bioluminiscencia.
   3. Durante la inicialización, la luz de estado de temperatura en el panel de control del sistema de imagen aparecerá en rojo. Realiza la imagen solo después de que la luz de estado de temperatura se ponga verde.
   4. Priva de los ratones de comida y agua durante 6 horas antes de las imágenes para evitar la aspiración durante la anestesia.
   5. Prepara el sustrato de imagen a una concentración de 10 mg/mL, protegido de la luz durante todo el procedimiento. Calcular el volumen de inyección en 10 μL/g de peso corporal.
   6. Sujeta al ratón para la imagen. Limpia el lugar de la inyección en la parte inferior izquierda del abdomen con un 75% de alcohol medicinal.
   7. Utiliza un hisopo de algodón para estimular suavemente la pared abdominal en el lugar de la inyección y así minimizar el riesgo de que la aguja entre en el intestino.
   8. Después de perforar la pared abdominal, aspira suavemente para confirmar la ausencia de sangre y luego inyecta lentamente el sustrato de imagen in vivo .
   9. A los 4 minutos y 30 segundos de la inyección del sustrato, transfiera al ratón a una cámara de inducción anestésica.
   10. Induce la anestesia usando isoflurano al 3%. Una vez que se pierdan los reflejos de enderezamiento y pellizco, reduce la concentración de isoflurano al 2% para el mantenimiento.
   11. Coloca al ratón anestesiado en la cámara de imagen, asegurándote de que el cono nasal cubra completamente la boca y la nariz. Cierra bien la puerta de la cámara de imagen.
   12. En el panel de control del sistema de imagen, selecciona "Luminiscente" como modo de imagen. Ajusta manualmente el tiempo de exposición a 60 s. Selecciona "Fotografía", "Superposición" y "Cuadrícula de alineación".
   13. Configura el campo de visión a D para obtener imágenes de tres ratones. Ajusta la altura de imagen a 1,5 cm. Selecciona "bloque" para el filtro de excitación y "abierto" para el filtro de emisión.
   14. A los 10 minutos de la inyección del sustrato, haz clic en "Adquirir" para capturar la imagen.
   15. Tras adquirir la imagen, navega a la Paleta de Herramientas y selecciona "Herramientas ROI". Utiliza la herramienta "Círculo" para delimitar la región de interés (ROI), luego haz clic en "Medir ROIs" para obtener datos cuantitativos.
4. Análisis histológico
   1. Extraer tejidos cerebrales en el punto final experimental y someterlos a análisis histológico.
   2. Identificar y confirmar las lesiones metastásicas mediante tinción de hematoxilina y eosina (H&E).

9. Objetivos humanos

1. Para garantizar el bienestar animal y el cumplimiento de los estándares éticos, se han establecido criterios humanos predefinidos como criterios para la eutanasia inmediata.
2. Los ratones son eutanasiados por inhalación de dióxido de carbono (CO₂), seguida de una dislocación cervical como método físico secundario para confirmar la muerte.
3. Se debe realizar una eutanasia inmediata si se produce alguna de las siguientes condiciones.
   1. Déficits neurológicos
      1. Disfunción motora: ataxia (marcha inestable, balanceo), círculos, parálisis, hemiparesia o temblores.
      2. Alteraciones conductuales o de conciencia: letargo, estupor o coma.
      3. Signos de aumento de la presión intracraneal: postura anormal (por ejemplo, espalda encorvada que indica malestar) o inclinación de la cabeza.
      4. Convulsiones: convulsiones generalizadas o focales.
   2. Cambios en el peso corporal y la función fisiológica
      1. Pérdida de peso corporal superior al 20% o incapacidad para comer o beber de forma independiente debido a la carga tumoral o debilidad severa.
      2. Dispnea (jadeos o jadeos) o incontinencia urinaria/fecal.
   3. Estado tumoral
      1. Terminar el experimento inmediatamente si se detecta ulceración, infección o necrosis asociada al tumor.
   4. Carga tumoral máxima tolerada
      1. Los ratones se someten a imágenes de bioluminiscencia dos veces por semana.
      2. Una vez que la señal del tumor intracraneal entra en una fase de crecimiento exponencial (por ejemplo, duplicándose entre dos sesiones consecutivas de imagen), el monitoreo neurológico se incrementa a dos veces al día.
      3. La eutanasia se realiza inmediatamente al inicio de la ataxia o las convulsiones, independientemente del valor de la señal de bioluminiscencia.

Resultados

Imagen bioluminiscente y análisis cuantitativo
Siguiendo el protocolo quirúrgico estandarizado, el modelo murchino optimizado de metástasis cerebral demostró señales bioluminiscentes intracraneales estables en imágenes seriadas in vivo postoperatorias. La imagen bioluminiscente continua in vivo (Figura 3A) y el análisis cuantitativo (Figura 3B) durante 4 semanas después de la inoculación int...

Discusión

Modelos preclínicos sólidos que recapitulen con precisión la metástasis cerebral son esenciales para dilucidar los mecanismos fisiopatológicos y evaluar la eficacia terapéutica. El modelo tradicional de inyección intracarótida requiere la ligadura de la arteria carótida común (CCA), que altera el flujo sanguíneo cerebral de manera no fisiológica, lo que podría inducir una lesión isquémica ipsilateral y alterar la barrera hematoencefálica (BBB⁾

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
10-0 microsurgical suture with needle	Lingqiao	2650798	Microsurgical suture para la reparación del sitio de punción de la arteria carótida común
100 µL microliter syringe	Bolige Tools	100UL	Jeringa de microlitro para la entrega de células tumorales durante la inyección pulsatil intercalada
100 µL pipette	Eppendorf	3123-000250	Pipeta para irrigación salina del campo quirúrgico
32G 1 mL insulin syringe	Kindly	YY0497	Jeringa de insulina utilizada para crear el sitio inicial de punción arterial
4-0 silk suture	Ethicon	W501	Material de sutura para el cierre de la incisión cutánea
4T1 breast cancer cell line	Obtained from Laboratory Shengdian Wang, Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences	CRL-2539	Línea celular tumoral utilizada para el modelado de metástasis cerebral intracarotídea
75% Ethanol	Annjet	Q/371402AAJ008	Desinfectante para la limpieza del sitio de inyección
7–8-week-old male C57BL/6J mice	Charles River Laboratories	1.10011E+17	Animales experimentales utilizados para el modelo de metástasis cerebral B16F10
8-week-old female BALB/c mice	Charles River Laboratories	1.10011E+17	Animales experimentales utilizados para el modelo de metástasis cerebral 4T1
Angled-tip forceps	Kewo Tools	—	Pinza microquirúrgica para la disección de tejidos y manipulación de vasos
B16F10 melanoma cell line	Obtained from Laboratory Shengdian Wang, Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences	CRL-6475	Línea celular de melanoma utilizada para el modelado de metástasis cerebral intracarotídea
Bioluminescence imaging analysis software	Living Image (version 4.7.2)	—	Software para el análisis de datos de imágenes de bioluminiscencia
DMEM	Xigong Bio Tech	M1805	Medio de cultivo celular para el mantenimiento de células tumorales
Enrofloxacin (antibiotic)	MCE	HY-B0502	Antibiótico utilizado para la profilaxis de infecciones postoperatorias
Eosin Y solution	Beyotime	E301879	Reactivo de tinción histológica para la tinción de eosina
Eye ointment	Baiyunshan	H44023089	Ungüento oftálmico para la protección de los ojos durante la anestesia
Fetal bovine serum (FBS)	Pan Sera Tech	ST30-3302	Suplemento sérico para el medio de cultivo celular
GraphPad Prism	Version 4.7.2	—	Software de análisis estadístico para curvas de supervivencia y análisis de datos cuantitativos
Hematoxylin solution	Beyotime	C0105S	Reactivo de tinción histológica para la tinción de hematoxilina
Isoflurane	H.F.Q. Biotechnology	101357015	Anestésico inhalatorio utilizado durante los procedimientos de imagen
IVIS Spectrum in vivo imaging system	Lumina Series III	—	Sistema de imagen para la bioluminiscencia in vivo
Meloxicam (analgesic)	Qilu Animal Health	150252467	Fármaco antiinflamatorio no esteroideo utilizado para la analgesia postoperatoria
Microsurgical scissors	Kewo Tools	—	Tijeras microquirúrgicas para la disección de tejidos
Mini vessel clip	Zheyong Tools	200521	Clip microvascular para la oclusion temporal de la arteria carótida común
Needle holder	Jiangxin Tools	1420 20Cr13	Instrumento quirúrgico para manipular suturas microquirúrgicas
Paraformaldehyde (4%)	Zhongsheng Wanda Tech	20240411	Fijador para la preservación del tejido cerebral antes del análisis histológico
Penicillin	Gibco	1758-9324	Antibiótico para el cultivo celular
Povidone-iodine solution	Sihuanpai	Q/PGSHW0009	Solución antiséptica para la desinfección cutánea quirúrgica
RPMI-1640 medium	Xigong Bio Tech	12-115F	Medio de cultivo celular para el crecimiento de células tumorales
Scilogex mixers	Scilogex	MX-S	Mezclador de vórtice para homogeneizar suspensiones de células tumorales
Steam indicator tape	3M-Comply	1322-24MM	Cinta indicadora de esterilización para instrumentos quirúrgicos autoclavados
Stereomicroscope	Olympus	SZ61	Microscopio utilizado para la visualización durante procedimientos microquirúrgicos
Zeiss Stemi 508 stereomicroscope	Zeiss	Stemi 508	Estereomicroscopio utilizado para la visualización quirúrgica de alta magnificación
Sterile saline (0.9%)	Kelun	25M14D07	Solución de irrigación estéril utilizada para mantener la humedad del campo quirúrgico
Streptomycin	Gibco	1758-9319	Antibiótico para el cultivo celular
Surgical drape	Dafang	001-2016	Drapé quirúrgico utilizado para aislar el campo quirúrgico
Surgical gloves	Ansell Medi-grip	210-64005	Guantes quirúrgicos utilizados durante los procedimientos quirúrgicos
Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	MKBH0634V	Anestésico inyectable para procedimientos quirúrgicos
Ultrasound Doppler	Mindray S7 SCI	—	Sistema de ultrasonido de alta resolución para la evaluación del flujo sanguíneo de la arteria carótida