Artículo de método

Estrategia integrada de UHPLC-MS/MS y HRMS para el cribado de compuestos potencialmente hepatotóxicos que contienen furán en Dioscorea bulbifera L.

DOI:

10.3791/70865

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19 de mayo de 2026

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1The First Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, 2School of Pharmacy, Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Medicine and Health Management, Guizhou Medical University, 4Guizhou Provincial Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM, Guizhou Medical University

En este artículo

Resumen

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Este estudio desarrolló una estrategia integrada que combina UHPLC–MS/MS y HRMS para detectar compuestos potencialmente hepatotóxicos contenedores de furán en Dioscorea bulbifera L.

Resumen

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Dioscorea bulbifera L. (DBL), una medicina herbal tradicional utilizada para tratar trastornos y tumores tiroideos, ha generado considerables preocupaciones de seguridad debido a sus posibles efectos hepatotóxicos. Investigaciones previas sugieren que esta lesión hepática podría estar asociada con la activación metabólica de compuestos que contienen furan (FCC) presentes en la DBL. Aquí, caracterizamos sistemáticamente las FCC y sus metabolitos reactivos en el extracto de DBL mediante un enfoque analítico integrado que combina cromatografía líquida de ultraalta potencia combinada con espectrometría de masas en tándem (UHPLC-MS/MS) y cromatografía líquida de ultra alto rendimiento junto con espectrometría de masas de alta resolución en tándem (UHPLC-HRMS). Utilizando análisis tanto dirigidos como no dirigidos por espectrometría de masas, identificamos un total de 849 constituyentes en el extracto acuoso de DBL, incluyendo 10 furanoditerpenoides y 17 FCC adicionales. Para dilucidar las vías de activación metabólica, utilizamos glutatión (GSH) y 4-bromobenzilamina (BBA) como agentes de doble atrapamiento dentro de un sistema de incubación microsomal de hígado (MLM) de ratón. Mediante metabolismo mediado por P450, siete aductos correspondientes derivados de diosbulbina B (DSB), C (DSC), D (DSD), E (DSE), L (DSL), N (DSN) y 2-pentilfurano fueron atrapados y caracterizados con éxito. Este estudio establece un enfoque sensible y específico para el perfilado integral de compuestos potencialmente hepatotóxicos de furano en DBL, y aporta valiosas perspectivas sobre la formación de metabolitos reactivos y los mecanismos de toxicidad relacionados con la medicina herbal que contiene furán.

Introducción

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Las preocupaciones de seguridad relacionadas con la medicina tradicional china (MTC), especialmente las lesiones hepáticas inducidas por fármacos (DILI), dificultan su amplia utilidad clínica ymodernización 1,2,3. Cada vez hay más evidencias que sugieren que la mayoría de los componentes de la MTC no son intrínsecamente tóxicos; en cambio, su hepatotoxicidad resulta de la activación metabólica in vivo 1,4,5. Los compuestos que contienen furano (FCC) son bien reconocidos como precursores hepatotóxicos prominentes, que experimentan activación metabólica mediada por P450 para producir intermediarios electrofílicos altamente reactivos, específicamente cis-enediales, que son cruciales para iniciar la toxicidad hepática. Estos metabolitos electrófilos forman aductos covalentes con tiolles de cisteína y grupos aminos de proteínas esenciales, facilitando así la progresión de efectostóxicos 6,7,8.

En la MTC, Dioscorea bulbifera L. (DBL) se ha utilizado ampliamente para el tratamiento de trastornos tiroideos, tumores y enfermedades de la piel 9,10. Un total de 152 constituyentes químicos han sido aislados y caracterizados a partir de DBL, incluyendo 41 furanoditerpenoides11. Entre ellas, la diosbulbina B (DSB), un componente bioactivo principal, ha demostrado inducir lesiones hepáticas en modelos murinos, un efecto estrechamente vinculado a la formación del cis-enedial (DDE) derivado de DSB12,13. Impulsada por los avances en la instrumentación analítica, la espectrometría de masas se ha convertido en una herramienta importante para analizar componentes químicos complejos y metabolitos de laMTC 14,15. Convencionalmente, los cis-enediales producidos por el metabolismo de DSB se detectan atrapando especies electrofílicas con N-acetil-L-lisina en combinación con glutatión o N-acetil-L-cisteína, seguido de un análisis LC-MS/MS de los derivados de pirrol químicamenteestables resultantes 16,17. Basándonos en este enfoque, desarrollamos previamente una estrategia mejorada que empleaba la captura simultánea de intermediarios metabólicos derivados del furán con GSH y BBA, junto con análisis LC-MS/MS mediante un escaneo de pérdida neutra de 129 Da y un escaneo iónico precursor de m/z 272 para aductos GSH, junto con un escaneo iónico precursor 1:1 de m/z 169 y 171 derivado de la mitad BBA para detección de pirrol (Figura 1)18. 19. Aunque eficaz para furanoides conocidos, este enfoque presenta limitaciones notables cuando se aplica a mezclas complejas, especialmente para FCCs que carecen de información estructural previa. Por lo tanto, sigue existiendo una necesidad urgente de una estrategia analítica integral capaz de permitir una caracterización química exhaustiva de matrices complejas de la MTC y, al mismo tiempo, apoyar un cribado eficiente de precursores hepatotóxicos.

Aquí, presentamos una estrategia integrada para la caracterización sistemática de las FCC potencialmente hepatotóxicas en DBL (Figura 2). La estrategia implica tres pasos clave: (i) perfilado químico exhaustivo del extracto acuoso de DBL utilizando metabolómica (WTM) ampliamente dirigida basada en UHPLC–MS/MS; (ii) captura de intermediarios reactivos generados por FCC con GSH y BBA; y (iii) detección y elucidación estructural de aductos de GSH/BBA formados mediante activación metabólica de componentes potencialmente tóxicos utilizando HPLC–MS/MS y UHPLC–MS/MS. Este enfoque integrado permite la identificación inequívoca de precursores tóxicos clave responsables de la hepatotoxicidad inducida por DBL a partir de matrices complejas de MTC y proporciona un marco altamente sensible y específico para la evaluación de seguridad de la MTC.

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Protocolo

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NOTA: Los reactivos y el equipo utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de la solución de prueba DBL

  1. Recoge y autentica tres lotes de tubérculos de Dioscorea bulbifera L. Siguiendo la Especificación Nacional para el Procesamiento de la MTC, retira las raíces fibrosas de los tubérculos, lávalas para eliminar la suciedad, córtalas en rodajas circulares de 1 cm de grosor mientras están frescas, sécalas en un horno de aire forzado a 60 °C, luego sácalas y enfríalas hasta temperaturaambiente de 20.
  2. Pesa 200 g de DBL de cada lote y molédelos hasta obtener un polvo grueso (tamaño de partícula 250-850 μm) usando una trituradora de alta velocidad.
  3. Remoja 20 g de polvo crudo en 200 mL de agua desionizada (1:10, p/v) durante 30 minutos. Simultáneamente, procesar una mezcla de los tres lotes de polvo grueso preparados en el paso 1.2 (mezclados en una proporción de 1:1:1, p/w).
  4. Extrae el material empapado calentándolo bajo reflujo durante 60 minutos. Filtra el extracto mediante gasa o un colador para eliminar los residuos insolubles. Añade 200 mL de agua desionizada al residuo restante y repite la extracción por reflujo dos veces, cada una durante 60 minutos. Combina los tres filtrados y concentra el extracto acumulado hirviéndolo hasta un volumen final de 100 mL.
  5. Transfiere el extracto concentrado a un liofilizador al vacío y liofilízate para obtener polvo.
  6. Pesa con precisión 18 mg de cada lote de extracto en polvo. Disuelva cada uno en 1,5 mL de acetonitrilo al 50% y vierte la mezcla en vórtice durante 30 s para asegurar la homogeneidad.
  7. Centrifugar la solución a 13.800 x g durante 10 minutos a 4°C y recoger el sobrenadante como solución de incubación MLM.
  8. Pipetear 20 μL de la solución original, diluirla a 1:50 con un 50% de acetonitrilo y usar el vórtice durante 30 segundos. Luego filtra la solución a través de una membrana microporosa de 0,22 μm para obtener la solución de la muestra lista para el análisis espectrométrico de masas.

2. Caracterización química de DBL

  1. Condiciones cromatográficas
    1. Utiliza una columna C18 (2,1 mm x 100 mm, 1,8 μm) y ajusta la temperatura del horno de columna a 40 °C. Preparar la fase móvil A como ácido fórmico al 0,1% (v/v) en agua y la fase móvil B como acetonitrilo.
    2. Programa la elución del gradiente de la siguiente manera: 0–10 min, 2%–50% B; 10–11 min, 50%–95% B; y 11–13 min, 95% B. Se ajusta el caudal a 0,4 mL/min e inyecta 2 μL de la muestra.
  2. Realizar análisis espectrométricos de masas utilizando los siguientes parámetros: Fuente iónica: ionización electrospray Iondrive Turbo V (ESI); Modo de adquisición: Monitorización de múltiples reacciones (MRM) con adquisición simultánea en modos de iones positivo y negativo; Tensión de pulverización de iones: +5,5 kV (positivo) / −4,5 kV (negativo); Gas cortina: 35 psi; Temperatura de origen: 400 °C; Gas fuente iónica 1: 60 psi; Gas fuente iónica 2: 60 psi; Potencial de desagrupamiento (DP): ±100 V.
  3. Procesamiento de datos
    1. Adquirir y procesar datos MRM utilizando el software SCIEX Analyst (v1.6.3). Convierte los archivos de datos en bruto (.wiff) a formato TXT usando MSConvert. Anota los compuestos detectados consultando la biblioteca propietaria BiotreeDB (V2.1) de MS. La anotación se basaba en la comparación de tiempos de retención (RT), relaciones masa-carga (m/z) y patrones de fragmentación con estándares auténticos.

3. Caracterización de conjugados GSH/BBA generados en incubaciones MLM

  1. Incubación de MLM
    1. Descongelar lentamente la suspensión microsomal del hígado del ratón sobre hielo. Sobre hielo, prepara la mezcla de incubación en un tubo microcentrífuga de 2 mL añadiendo secuencialmente los componentes que se indican a continuación. Añadir el sistema regenerador de NADPH al final. Para el grupo de control, se sustituye el sistema regenerador de NADPH por un volumen igual de PBS helado. Vórtice para mezclar brevemente.
      1. Prepara una mezcla de incubación compuesta por los siguientes componentes: Suspensión microsomal de hígado de ratón (MLM, proteína 4 mg/mL): 125 μL; Solución de cloruro de magnesio (MgCl₂) (32 mM): 10 μL; DBE (12 mg/mL) o solución estándar DSB (35 mM): 10 μL; solución de glutatión (GSH) (50 mM): 100 μL; Solución BBA (250 mM): 10 μL; Tampón PBS (pH 7,4, que contiene 1,0 mol/L EDTA y 0,1 mol/LK 2HPO 4): 145 μL; Solución del sistema regenerador de NADPH (5,0 mM): 100 μL.
    2. Inmediatamente al finalizar la incubación, retira todos los tubos de la incubadora. Termina la reacción enzimática añadiendo 1 mL de acetonitrilo helado (-20 °C) a cada tubo.
    3. Vórtice durante 3 minutos para precipitar proteínas. Centrifugar a 13.800 x g durante 10 minutos a 4 °C.
    4. Recoge el sobrenadante, filtra a través de una membrana de 0,22 μm y transfiere el filtrado a un frasco automuestreador.
  2. Cribado preliminar de la incubación MLM de extractos de DBL por HPLC-MS/MS
    1. Condiciones cromatográficas
      1. Utiliza una columna C18 (150 mm x 4,6 mm, 3 μm) y ajusta la temperatura de la columna a 25 °C. Preparar la fase móvil A como ácido fórmico al 0,1% (v/v) en agua y la fase móvil B como acetonitrilo.
      2. Corre la siguiente pendiente: 0–2 min, 10% B; 2–15 min, aumento lineal del 10% al 90% B. Ajustar el caudal a 0,8 mL/min e inyectar 5 μL de la muestra preparada.
    2. Condiciones de espectrometría de masas. Configura el rango de escaneo completo a m/z 500–1000. Escaneos de iones precursores (PI) en m/z 169 y 171, y un escaneo de pérdida neutra (NL) de 129 Da en modo de iones positivos, y un escaneo PI a m/z 272 en modo de iones negativos. Establecer parámetros clave de la siguiente manera: voltaje de pulverización iónica (IS), +5.500 V (positivo) / −4.500 V (negativo); potencial de desagrupamiento (DP), ±70 V; potencial de entrada (EP), ±10 V; energía de colisión (CE), +35 V (positiva) / −40 V (negativa); potencial de salida de celda de colisión (CXP), ±10 V; gas fuente de iones 1 y 2 (GS1/GS2), 50 psi cada uno; gas cortina (CUR), 40 psi; y temperatura de fuente (TEM), 650 °C.
    3. Adquiere y procesa todos los datos de espectrometría de masas utilizando el software SCIEX Analyst (v1.6.3).
  3. Identificación de derivados de pirrol y FCC por UHPLC-HRMS
    1. Condiciones cromatográficas
      1. Utiliza una columna C18 (2,1 mm x 100 mm, 1,9 μm) y ajusta el horno de columna a 30 °C. Preparar la fase móvil A como ácido fórmico al 0,1% (v/v) en agua y la fase móvil B como acetonitrilo.
      2. Programa el gradiente de la siguiente manera: 0-20 min, 5%-95% B; 20-21 min, 95% B. Ajusta el caudal a 0,3 mL/min e inyecta 2 μL de la muestra.
    2. Realizar análisis espectrométricos de masas con los siguientes parámetros: Fuente iónica: ESI; voltaje de pulverización de iones: +3,5 KV (iones positivos)/-2,5 KV (iones negativos); temperatura capilar: 320 °C; temperatura del calentador de sonda: 350 °C; gas de vaina: 10 arb; corriente máxima de pulverización: 100 μA; Nivel de RF de la lente S: 50%; energía de colisión: 35 V (iones positivos) y 40 V (iones negativos); Alcance de escaneo: 100-1000 m/z.
    3. Preprocesamiento de datos
      1. Basándose en las FCC identificadas de DBL y el mecanismo de trampa (Figura 1), extrae los conjugados GSH/BBA predichos usando ChemBioDraw Ultra 14.0 (Figura suplementaria 1).
      2. Importa los archivos crudos de HRMS adquiridos (.raw) al módulo Qual Browser de Xcalibur (V4.1). Crea un flujo de trabajo de identificación en el software para filtrar los conjugados GSH/BBA.
      3. Compare los espectros experimentales de MS1 y MS2 con las estructuras predichas de conjugados GSH/BBA derivadas de FCC (predichas usando ChemBioDraw Ultra 14.0) basándose en los mecanismos de adducción conocidos (Figura 1 y Figura suplementaria 1). Utiliza un umbral mínimo de intensidad máxima de 1 x 105 y una tolerancia de precisión de masa de ± 10 ppm para todos los iones monitorizados. Confirmar los conjugados basándose en el patrón característico de isótopos de bromo (aproximadamente 1:1) observado tanto en los espectros de MS1 como deMS 2 , incluyendo iones diagnósticos en m/z 169 y 171.
      4. Determinar los pesos moleculares de las FCC parentales restando la masa de la etiqueta GSH/BBA de los iones moleculares observados. Usa 472/474 Da (C17H21O5N4BrS) para la resta.
      5. Caracterizar las FCC principales en DBL mediante UHPLC–HRMS basándose en los resultados obtenidos anteriormente.

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Resultados

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FCCs identificadas en DBL
Para caracterizar el perfil químico del DBL, se empleó una combinación de perfilado WTM y HRMS basado en triple cuadrupolo. Este enfoque dual permitió el análisis exhaustivo de pares iónicos extraídos, generando cromatogramas iónicos extraídos (EICs, Figura 3A) y cromatogramas iónicos totales (TICs, Figura 3B) altamente informativos. Bajo las condiciones cromatográficas y de detecció...

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Discusión

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Investigaciones previas sobre la hepatotoxicidad de DBL se han centrado principalmente en los intermedios metabólicos de las FCC individuales utilizando estrategias de capturadirigidas 9,22. Aunque estos enfoques proporcionan valiosas ideas mecanicistas, su eficacia en matrices herbales complejas suele estar limitada por la baja detectabilidad de intermediarios bioactivados de baja abundancia. En el presente estudio, desarrollamo...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 82360759), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Guizhou (Nº ZK [2024]406, ZK [2024] 397, Estación Postdoctoral [2021]007, BSH [2024]005), y Universidad de Medicina Tradicional China de Guizhou TD Hopes [2023]005.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
4-BromobenzilaminaJiuding Chemical (Shanghai) Technology Co., LtdX114214A
AcetonitriloSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd1000294000
CentrifugadoraWuxi BaiTaKe Biotechnology Co., LtdCR3180
Cromatográfico  Sample  BotellasZhejiang ALWSCI Technology Co., LtdC0000008
Diosbulbina BChengdu PufeiDe Biotech Co., Ltd18022603
Dioscorea bulbifera L.-DBL-1; DBL-2; DBL-3Los materiales vegetales fueron autenticados por el Prof. Weike Jiang (Universidad de Medicina Tradicional China de Guizhou, Guiyang, China), con muestras de comprobación depositadas en el Laboratorio Clave de Farmacología Básica de la provincia de Guizhou.
Balance electrónicoFábrica de Instrumentos Electrónicos de Anting de ShangháiFA1004B
Ácido fórmicoThermo Fisher Scientific Co., Ltd195715
GlutatiónSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., LtdSLBX5462
Alta velocidad  TrituradorYongkang Biao Hardware Products Co., LtdXC-2000Y
Ratones de Kunming Microsomas hepáticos (macho)Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd.MB12496-1
Cloruro de magnesioBeijing Solarbio Science & Technology Co., LtdM8161
MetanolSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd646377
Filtro MilliporeTianjin Jinteng Experimental Equipment Co., LtdNylon66
NADPH Na4Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd102X022
HornoInstrumento de laboratorio y instrumento de laboratorio de Tianjin Equipment Co., LtdGFL125
Solución salina tamponada con fosfatoBeyotime Biotechnology & nbsp; Co., LtdC0221B
Termostática  agua  Bath  osciladorShanghai Zijia Instrument Co., LtdTHZ-82A
Ultra-congeladorThermo Fisher Scientific Co., LtdTDE60086FV-ULTS
Limpiador ultrasónicoShanghai Zijia Instrument Co., LtdL10-250A
Mezclador de vórticesFábrica de Instrumentos Médicos Haimen de JiangsuVM-D

Referencias

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