Artículo de método

Un modelo estandarizado de oromucosas porcinas ex vivo para la evaluación de flujos de péptidos

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DOI:

10.3791/70935

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9 de junio de 2026

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1UCD School of Veterinary Medicine and UCD Conway Institute, University College Dublin, 2UCD School of Mechanical and Materials Engineering, University College Dublin

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe una plataforma de cribado utilizando mucosas del tejido epitelial bucal porcino recién aislado para evaluar la permeación peptídica. El método integra la permeación de un GLP-1RA en presencia de un potenciador de permeación procedente de soluciones, cámaras Hilltop, películas en células de difusión Franz y insertos impresos en 3D, acompañados de una evaluación histológica de la mucosa.

Resumen

La administración oromucosa de fármacos en películas, tabletas, pastillas y otras formas de dosificación proporciona una vía de administración sistémica conveniente para pacientes pediátricos y ancianos, así como para aquellos que no pueden tragar cápsulas o comprimidos fácilmente. El desarrollo de formulaciones de péptidos bucales y sublinguales requiere modelos preclínicos que se alineen con las estructuras epiteliales oromucosas no queratinizadas de los humanos, de las cuales los cerdos y perros son los más adecuados. Obtuvimos tejidos oromucosos porcinos frescos desechados de un matadero. Las mucosas se diseccionaban del músculo liso subyacente mediante calentamiento controlado y luego se montaban en células de difusión Franz o en nuevos insertos curados en resina impresos en 3D de bajo volumen. Se añadieron combinaciones potenciadoras de permeación peptídica al lado donante, y se muestrearon moléculas permeadas del lado receptor y se cuantificaron mediante cromatografía líquida de ultraalto rendimiento (uHPLC). Para los insertos, se midieron los valores de resistencia eléctrica transepitelial (TEER) de las mucosas montadas utilizando electrodos EVOM de palillos de corte. Se examinó la histologia tisular tras la incubación tanto en células de difusión de Franz como en insertos 3D. La concentración óptima de potenciador de permeación se seleccionó cuando mezclas acuosas de péptido y potenciador produjeron un aumento en la permeación. La permeación peptídica alcanzó el 4,3% en 3 horas en insertos tridimensionales (3D) y el 1,7% en modelos de cámara Hilltop, estos últimos simulando la exposición directa de una película bucal. Se desarrollaron y aplicaron películas mucoadhesivas poliméricas capa por capa que contenían combinaciones de péptidos-potenciadores en tejido mucoso para estudios de permeación utilizando cámaras de difusión. La permeación peptídica ex vivo a través de las mucosas bucales porcinas alcanzó el 2% cuando estas se expusieron a la combinación óptima de glicodesoxicolato (GDC) incorporada en las películas bucales. Estos estudios de cribado ex vivo proporcionan una vía para la posterior evaluación farmacocinética de formulaciones de película cargada de péptidos administradas por la vía oromucosa en cerdos y personas.

Introducción

Las oromucosas bucales y sublinguales son vías atractivas para la administración oral de fármacos porque ofrecen sitios directamente accesibles y evitan el metabolismo hepático en primer paso, lo que puede mejorar la biodisponibilidad y la aceptabilidad por parte del paciente en comparación con otras vías, incluida laoral 1,2. Los péptidos generalmente se administran por inyección en lugar de la administración oral debido a la mala permeación a través del epitelio intestinal, debido a su mayor peso molecular, hidrofilia y susceptibilidad a la degradaciónenzimática 3. La FDA ha aprobado 102 péptidos para aplicaciones terapéuticas, con ~450 péptidos terapéuticos en evaluación en ensayos preclínicoso clínicos. Estas incluyen tabletas orales formuladas con potenciadores de permeación (por ejemplo, semaglutida, Rybelsus)5 y plataformas oromucosas (Minirin Melt y acetato sublingual de desmopresina Nocdurna) desarrolladas usando la tecnología de tabletas desintegradoras orales (ODT) deCatalent6. A pesar de una extensa investigación en estudios de permeabilidad bucal a fármacos, los valores de permeabilidad de las moléculas muestran baja reproducibilidad y comparabilidad limitada entre los estudios 7,8. Estas inconsistencias se deben en gran medida a variaciones en los modelos animales experimentales utilizados y a diferencias en el manejo y preparación de mucosas bucalesaisladas 9.

Los ensayos de permeabilidad ex vivo utilizando mucosas bucales y sublinguales aisladas son una herramienta valiosa para predecir la permeabilidad in vivo de pequeñas moléculas oromucosas y para el cribado preclínico de componentes de formulación relevantes para las formasdosificadas 10,11,12; sin embargo, su uso en el cribado de péptidos ha sido limitado porque la permeabilidad basal es insignificante. En los últimos años, la mucosa bucal porcina se ha convertido en el modelo preferido porque su estructura no queratinizada y sus características fisiológicas y bioquímicas se parecen mucho a lashumanas 13. Las muestras bucales de perros son aún menos accesibles en comparación con el tejido porcino de los mataderos, aunque ambas fuentes son14 no queratinizadas. Persiste una considerable variabilidad en el espesor epitelial y los métodos de procesamiento. La estandarización de la preparación oromucosa bucal y sublingual es esencial. Variables como las condiciones de almacenamiento a corto y largo plazo, el grosor del tejido y el mantenimiento de la viabilidad durante los experimentos influyen en los resultados de permeabilidad ex vivo 8. La preservación tisular es fundamental, ya que tanto la integridad estructural como la actividad metabólica de la mucosa afectan directamente a los perfiles de difusión12,15. La pérdida de función de barrera puede resultar en tasas de permeación de fármacos artificialmenteelevadas 16,17. Más allá del almacenamiento, el método utilizado para diseccionar las mucosas bucales porcinas para su montaje en cámaras de permeación introduce una mayor variabilidad. Las diferencias en la eliminación del tejido conectivo submucoso, ya sea por medios mecánicos, químicos o térmicos, pueden alterar lapermeabilidad 18. Aunque algunos informes sugieren que la separación del calor para aislar el epitelio del músculo liso preserva lapermeabilidad 19, no hay consenso. Actualmente, no existe un método universalmente aceptado para diseccionar y evaluar la integridad de las mucosasbucales aisladas 20. El azúcar hidrofílico marcado fluoresceína isotiocianato-dextrano (FITC dextrano 4000, FD-4) se utiliza comúnmente como marcador de integridad para la mucosa bucal porcina, ya que solo moléculas pequeñas por debajo de ~500 Da pueden penetrar pasivamente en el tejido. En cambio, una mucosa intacta restringe el transporte de FD-4, y una transferencia de donante a receptor por debajo del 0,6% suele considerarse aceptable en 2-4 horas 21,22. Además, la tinción tejidal de hematoxilina y eosina proporciona una evaluación sencilla de la morfologíaepitelial 23.

En este trabajo, establecimos un protocolo estandarizado para el manejo de mucosas bucales porcinas aisladas, diseñado para optimizar la integridad y permeabilidad mucosa durante un periodo determinado. Nuestros objetivos eran proporcionar un marco experimental para diseccionar tejido epitelial bucal porcino y mejorar la fiabilidad de las evaluaciones de permeabilidad ex vivo de péptidos en oromucosas montadas en cámaras de difusión e insertos. Primero realizamos análisis visuales para identificar la mucosa bucal libre de daños procedente del matadero. Optimizamos las técnicas de procesamiento de tejidos, el grosor mucoso y los métodos para mantener la integridad tisular durante los experimentos. Utilizando un agonista estable y de baja potencia del receptor del receptor de péptido-1 similar al glucagón (GLP-1 RA) como molécula herramienta, realizamos estudios de permeación peptídica en presencia y ausencia de un potenciador de permeación de sales biliares, el glicodesoxicolato sódico (GDC), en mucosas bucales montadas en células de difusión de Franz y insertos personalizados impresos en 3D tipo transwell. La GDC y la GLP-1 RA se presentaron a mucosas bucales procedentes de soluciones, cámaras Hilltop y películas poliméricas mucoadhesivas bicapas. Utilizamos marcadores de permeabilidad, histología tisular y valores de resistencia eléctrica trans-epitelial/endotelial (TEER) como nuestros principales criterios de evaluación.

Protocolo

Las mejillas de cerdo utilizadas en este estudio se recogieron de un matadero local; por lo tanto, no se requería ninguna aprobación ética.

1. Aislamiento, preparación y almacenamiento del epitelio bucal porcino

  1. Recoger tejidos de mejillas de cerdo de un matadero local y transportarlos en un plazo de 90 minutos al laboratorio en solución salina de fosfato frío (PBS, pH 7,4). En los siguientes 60 minutos, preparar los tejidos según la metodologíadescrita anteriormente 19,24, con modificaciones menores para diferentes sitios oromucosos como se muestra en la Figura 1.
  2. Con un bisturí, separa las mucosas bucales del tejido subyacente y enjuaga el tejido tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Descarta las mucosas con daño visual en la superficie.
  3. Sumerge mucosas intactas en PBS a 65 °C durante 3 minutos y separa el epitelio y el tejido conectivo subyacente restante del músculo liso usando una pinza de relojero talla 5. Este método también es aplicable para aislar mucosas epiteliales sublinguales y de la lengua.
  4. Seca suavemente las oromucosas diseccionadas sobre papel filtro de celulosa y procede a estudios de permeación (la opción preferible) o congela durante un máximo de 4 semanas.
  5. Para el proceso de congelación tras la separación, sumergir oromucosas durante 2 horas en un crioprotector, 85% glicerol25%, con agitaciones suaves. El glicerol de alta viscosidad reemplaza el agua intercelular para evitar la formación de cristales de agua, que podrían dañar la estructura del tejido.
  6. Después de este periodo, sustituye el glicerol por PBS fresco y glicerol al 10%. Congela las muestras mucosas a -20 °C o -70 °C, dependiendo de la duración de almacenamiento requerida. Realizar el procedimiento de congelación a una tasa controlada de ~-1 °C·min-1.
    NOTA: Todos los experimentos se realizan utilizando al menos tres muestras de tejidos de las mejillas de diferentes animales.

2. Estudio de permeación ex vivo en mucosas montadas en células de difusión de Franz y uso de cámaras Hilltop para presentar la GLP-1 RA y GDC

NOTA: Los estudios de permeabilidad ex vivo se realizan inicialmente en mucosas bucales porcinas recién aisladas utilizando células de difusión de Franz (FDC).

  1. Montar las mucosas del tejido diseccionado en cámaras (área de ventana 1,2cm 2) mostrada en la Figura 2 y equilibrar durante 30 minutos con PBS, pH 6,8 (lado donante, volumen de 1 mL) y PBS, pH 7,4 (lado receptor, volumen de 10 mL).
  2. Tras 30 minutos de equilibrio, se sustituye la solución donante PBS (pH 6,8) por 1 mL de PBS que contenga una proporción 1:1 entre GLP-1RA (25 mg/mL) y GDC (25 mg/mL).
  3. Sigue removiendo la cámara del receptor con 10 mL de PBS pH 7,4, manteniéndose a 37 °C a 300 rpm. Toma una muestra de 1 mL del compartimento receptor cada 60 minutos durante 180 minutos. Tomen muestras triplicadas de los compartimentos donantes al inicio y al final del experimento. Tras cada muestreo, repone las cámaras con 1 mL de PBS.
  4. Al final del experimento, almacenar el tejido en un 10% de formalina para histologia o homogeneizarlo para cuantificar el péptido GLP-1RA que queda en el tejido.
  5. De manera similar, se realiza la permeabilidad del GLP-1RA utilizando cámaras Hilltop (HTC).
    NOTA: El propósito de usar HTC es confirmar el efecto oromucoso de mejora de la permeación de GDC sobre el GLP-1 RA en solución antes de formular una película bucal de dos capas. El HTC es una cámara construida a partir de Kraton G-2705, un copolímero biocompatible de bloque de estireno-etileno-butileno-estireno (SEBS), con un diámetro exterior de 19 mm, y contiene una almohadilla Webril (12,7 mm de diámetro) compuesta por fibras de algodón 100% no tejidas, que sirve como material absorbente antiadherente para la aplicación de la solución26.
  6. Asimismo, se evalúa la permeabilidad ex vivo de GLP-1RA y GDC (relación 1:1) cargadas en películas bicapa mucoadhesivas colocando las películas en cámaras donadoras de FDC o en insertos 3D, como se describe para HTC.
  7. Para confirmar la integridad del tejido epitelial bucal porcina, utilice FD-4 (0,05 mM) como marcador de flujo fluorescente y añádelo al lado donante para evaluar la fuga en el tejido.
    NOTA: Los tejidos que muestran fugas están excluidos de los cálculos de permeabilidad.
  8. Tras el experimento de 3 horas, cuantificar el flujo acumulado de GLP-1 de AR mediante análisis uHPLC de las muestras de 200 μL extraídas del compartimento basolateral en triplicado. Repite todos los experimentos de permeación tres veces. Cuantificar el flujo acumulado de GLP-1RA a partir de una curva de calibración generada a partir de concentraciones fijas de GLP-1RA.

3. Preparación de películas bucales atrapadas con el GLP-1RA y GDC

NOTA: Las películas bucales bicapa que contienen una capa mucoadhesiva y de respaldo se fabrican mediante colada con disolvente y un recubridorsemiautomatizado 27.

  1. Prepara una película de dos capas para atrapar GLP-1RA usando HPMC y PVP-K90 como polímeros formadores de película, y un componente mucoadhesivo, Na-CMC.
    NOTA: Consulte la Tabla 1 para la composición del mucoadhesivo y la capa de respaldo de la película bucal. La GDC se incorpora junto con un péptido GLP-1 RA en películas modelo en cantidades bajas de mg para observar su efecto sobre la permeación peptídica en las mucosas bucales porcinas montadas en cámaras.
  2. Prepara la capa mucoadhesiva disolviendo los polímeros formadores de película, 45 mg de HPMC, 10 mg de Na-CMC y 25 mg de PVP-K90, en agua desionizada que contenga un 3% de glicerol a 400 rpm durante 10 minutos utilizando un agitador de placa caliente magnética.
    NOTA: El HPMC es soluble a temperatura ambiente, mientras que el PVP-K90 requiere calentamiento a 40 °C durante 30 minutos para disolverse.
  3. Añadir 2 mg de Aerosil 200 F bajo agitación, seguido de la incorporación del GLP-1 RA. Luego, añade GDC y dispérsalo a 600 rpm durante 30 minutos.
  4. Ultrasonica la solución polimérica final durante 90 minutos usando un baño de ultrasonicación para eliminar las burbujas.
  5. Fundido las películas sobre un forro de polietileno tereftalato (PET) y recubre con una cuchilla de doctor ajustada a 2600 μm a 2 mm/s. Seca las películas en un horno de aire caliente a 40 °C durante ~1 hora.
  6. Para la capa de respaldo, disuelve el 5% de celulosa etílica (CE) y el 5% de propileno glicerol (PG) en agua hidroalcohólica (etanol:agua), y luego vierte la suspensión disuelta sobre un revestimiento PET. Finalmente, corta las películas secas en cuadrados de 1 cm × 1 cm, envuelve sobres de aluminio y guárdalos a 4 °C.

4. Impresión de un inserto 3D personalizado que imite transwells

NOTA: Los insertos personalizados impresos en 3D se fabrican siguiendo un método previamente descrito con modificacionesmenores 28.

  1. En resumen, diseña el modelo 3D utilizando software de diseño asistido por ordenador (CAD).
  2. Mantener las dimensiones del inserto 3D iguales a las del cuerpo cilíndrico principal (cámara donante), con una superficie máxima de 1659,06mm2, y dimensiones externas totales de 25,20 mm a lo largo del eje x, 14,50 mm a lo largo del eje y y 21,63 mm a lo largo del eje z.
  3. Además, diseña un anillo circular de retención desmontable para soportar el tejido epitelial. El anillo tiene un diámetro exterior de aproximadamente 19,90 mm y un diámetro interior de 17,93 mm, correspondientes a las dimensiones del cuerpo cilíndrico principal, y puede caber en placas Transwell de 12 pozos (Figura 3).
  4. Fabrica todos los componentes usando una impresora 3D de estereolitografía de sobremesa (SLA) con una resina transparente curable por UV. Todas las dimensiones son aproximadas y pueden ajustarse según sea necesario para asegurar un ajuste adecuado en los Transwells y compatibilidad experimental.
    NOTA: Para asegurar la eliminación de monómeros no reaccionados y posibles lixiviantes, todas las piezas pasaron por un protocolo estandarizado de postprocesado, incluyendo un lavado de 10 minutos en alcohol isopropílico al 99% (IPA) prístino, seguido de curado UV según las especificaciones del fabricante, es decir, 1 minuto a temperatura ambiente en una Form Cure 2. El archivo de estereolitografía (STL) para el diseño de modelos 3D puede encontrarse en archivos https://doi.org/10.5281/zenodo.19368577 o suplementarios (Archivo Suplementario 1 y Archivo Suplementario 2).

5. Permeación a través de las mucosas montadas en insertos 3D

NOTA: La permeabilidad ex vivo de GLP-1RA y GDC incorporada en películas bucales bicapa mucoadhesivas también puede evaluarse utilizando insertos 3D de bajo volumen diseñados a medida que imitan Transwell (Figura 2) como alternativa a los FDC. Esto se debe a que el lado receptor de 10 mL de las FDC diluye el péptido, desafiando la sensibilidad de detección de uHPLC. Por tanto, el diseño de la FDC no es rentable ni práctico para flujos peptídicos, ya que requeriría la detección continua de un ensayo inmunoenzimático ligado (ELISA) o radioinmunoensayo (RIA).

  1. Fabrica/imprime los insertos en una resina curable por UV usando una impresora SLA 3D de sobremesa28, y móntalos en placas de cultivo de tejidos de 12 pozos.
  2. Colocar las mucosas bucales porcinas en una ventana de 1,4cm 2 entre las cámaras apical y basolateral, medir la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) base utilizando el voltohómetro EVOM 2 con electrodos STX2 de palillos colocados en los lados donante y receptor de los insertos. TEER se calcula según la Ley de Ohm.
  3. Tras colocar la película (1,0 × 1,0cm 2) sobre la parte superior del tejido, se pipetean 0,5 mL de PBS (pH 6,8) en la cámara apical y 1,5 mL de PBS (pH 7,4) en la cámara basolateral.
  4. Recoger muestras (0,2 mL) de los lados del receptor en intervalos de 1 hora durante 3 horas y reemplazar por volúmenes iguales de buffer fresco.
  5. Cuantifique el péptido GLP-1 RA con flujo mediante uHPLC.
    NOTA: No se observa adsorción de GLP-1RA con inserciones 3D tras 3 horas, como se muestra en la Figura Suplementaria 1 y el Archivo Suplementario 3.
  6. Mide la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) usando el voltómetro EVOM 2 con electrodos de palillos STX2 a intervalos de 1 hora durante 3 horas. El TEER se calcula mediante la Ley de Ohm.
  7. Para confirmar la integridad del tejido epitelial bucal y sublingual, utilice FD-4 (0,05 mM) como marcador fluorescente.
    NOTA: Todos los experimentos se realizan en triplicado, y los resultados reportados corresponden a la media ± DE de tres conjuntos de datos.

6. detección uHPLC del GLP-1 RA

  1. Cuantificar la cantidad de GLP-1 RA permeada a través de oromucosas montadas en FDCs e insertos, de cada una de las soluciones laterales donantes, HTCs y películas por uHPLC utilizando una columna CSH C18 (130 Å, 1,7 μm, 2,1 mm × 50 mm) con una fase móvil de 0,1% TFA en acetonitrilo (Eluent A) y 0,1% TFA en agua (Eluent B), elusión por gradiente durante 8 minutos a 30 °C, con un volumen de inyección de 20 μL y un caudal de 0,7 mL/min, y detección UV a 214 nm (tiempo de retención: ~4,2 min).
  2. Realiza un estudio de linealidad.
    1. Diseñar un estudio de linealidad para estimar la respuesta analítica de las condiciones optimizadas de uHPLC utilizando estándares de calibración GLP-1 en el rango de 2,5–20,0 μg·mL⁻1.
    2. Preparar estándares de calibración (n = 6–8 niveles) de forma independiente e inyectar muestras en triplicado. Realizar una regresión lineal de mínimos cuadrados del área máxima (mAU) frente a la concentración nominal, y evaluar la linealidad utilizando el coeficiente de determinación (r2), el % de intersección y y la distribución de residuos (respuesta observada–predicha).
      NOTA: La inspección visual del gráfico de calibración y del gráfico de residuos indicó una desviación insignificante respecto a la linealidad en el nivel de sensibilidad más bajo (2,5 μg·mL⁻1), con residuos dentro del límite de aceptación predefinido (±3%). El rango de calibración se restringe posteriormente a un rango de 2,5–20,0 μg·mL⁻1, en el que la regresión mostró una linealidad aceptable (r2 ≥ 0,999, % de intersección y < 2%, y todos los residuos dentro del ±3%).

7. Estimación de GLP-1RA retenido en tejido bucal

  1. Retirar las mucosas epiteliales bucales porcinas expuestas a la GLP-1 AR y GDC de las FDC/insertos.
  2. Enjuaga el tejido tres veces con PBS para eliminar el fármaco adsorbido y los excipientos de películas.
  3. Luego, homogeneiza el tejido en 5 mL de PBS usando un homogeneizador de mesa hasta que esté completamente fragmentado.
  4. Almacenar la muestra durante la noche a 4 °C para permitir el equilibrio de la partición de péptidos entre tejido homogeneizado y PBS.
  5. Posteriormente, centrifugar la mezcla a 5000 × g durante 5 minutos para precipitar los fragmentos y recoger el sobrenadante para cuantificar.
  6. Esterilizar el sobrenadante mediante filtros centrifugadores de 0,22 μm para eliminar partículas residuales antes del análisis uHPLC.

8. Histotología del tejido oromucoso

NOTA: Tras 3 horas de permeación del GLP-1 RA de mezclas, HTCs o películas, se procesan las mucosas para evaluar daños.

  1. Fija los tejidos con un 10% de formalina durante 48 horas y luego insumerge los tejidos fijos en parafina.
  2. Seccionar los tejidos a un tamaño de 5 μm usando un microtomo.
  3. Luego se tiñen los tejidos con hematoxilina y eosina (HE) para examinar la integridad histológica mediante microscopía óptica a 4× aumento.
  4. Las láminas se fotografían con un microscopio vertical y se analizan mediante software de análisis de imágenes.
    NOTA: El flujo de trabajo general se resume en la Figura 4.

Resultados

Aislamiento y disección de tejidos epiteliales bucales porcinos
La mucosa bucal porcina se utiliza ampliamente como tejido sustituto para oromucosas humanas porque comparten características anatómicas comparables y propiedades de barrera fisiológica29. Los tejidos epiteliales bucales porcinos se aíslan mediante métodos quirúrgicos y de calentamiento, como se muestra en la Figura 4. Inicialmente, se utiliza un bisturí para extraer los músculos y los tejidos conectivos más profundos de las mejillas. Los fragmentos aislados de tejido con capas mucosas combinadas e intactas y tejido conectivo se colocan luego en PBS caliente a 65 °C durante 3 minutos. El tejido se extrae del tampón y el epitelio y la lámina propia subyacente se despegan con pinzas tamaño 5. El calentamiento permite un espesor uniforme y consistente en el epitelio disecado resultante.

Permeación ex vivo de un GLP-1RA a través de oromucosas bucales porcinas montadas en FDCs e insertos impresos en 3D
La permeación ex vivo de GLP-1RA se evaluó utilizando mucosas del tejido epitelial bucal porcino montadas en FDCs e insertos. Para evaluar la proporción óptima de concentración de la GLP-1 RA: GDC, se colocaron HTC con almohadillas de algodón de 12,7 mm en el lado donante de las mucosas montadas en FDC, y la mezcla de péptido-potenciador se pipeteó sobre el algodón. La permeación acumulada de la AR GLP-1 alcanzó aproximadamente el 4,3% en 3 horas cuando se incluyó la GDC en una proporción 1:1 (GLP-1RA 25 mg; GDC 25 mg). En contraste, en ausencia de GDC, no se observó ningún flujo detectable de GLP-1RA27. Los parámetros cuantitativos de permeabilidad, incluida laaplicación P, se calculan usando la siguiente fórmula:

Papp = figure-results-1

Donde:
P app: coeficiente de permeabilidad aparente (cm/s).
dQ/dt: tasa de transporte del GLP-1RA en estado estacionario, calculada como la cantidad de péptido transportado por unidad de tiempo (μg/s).
A: área del inserto 3D (cm2).
Co: la concentración inicial del péptido en el compartimento donante (apical) (μg/mL).

El coeficiente de permeabilidad aparente (Papp) de GLP-1RA en las mucosas bucales porcinas se muestra en la Figura Suplementaria 2. Cuando la relación GLP-1RA:GDC era 1:1, se incorporaban las mismas concentraciones que para los HTC en las películas de dos capas; sin embargo, la permeación del GLP-1RA en tejidos bucales porcinos aislados no fue cuantificable usando la configuración convencional de FDC, ya que la presentación del GLP-1RA de las películas a las mucosas es más lenta que la de mezclas en solución o de HTCs. Para superar esta limitación, se desarrollaron insertos personalizados de bajo volumen impresos en 3D para reducir el volumen del receptor a 1,5 mL, mejorando así la sensibilidad de detección. Utilizando insertos 3D, la permeación acumulada de GLP-1RA de las películas bucales durante 3 horas fue medible y alcanzó aproximadamente el 1,8 %, como se muestra en la Figura 5. Se utilizaron valores TEER y flujos FD-4 para evaluar la integridad de la barrera epitelial y la permeabilidad paracelular. Se observó un descenso dependiente del tiempo en la TEER (Figura suplementaria 3) en los grupos de tratamiento y correspondió con un aumento de la permeación de GLP-1RA. PBS y tejidos tratados con película en blanco no mostraron cambios en TEER, lo que indica que la matriz de película de dos capas no rompió la barrera. Estos datos implican a la GDC como el principal contribuyente al efecto potenciador de la permeación.

Evaluación histológica del tejido porcino
Se realizó una evaluación histológica de la mucosa bucal porcina ex vivo para evaluar el impacto de los métodos de aislamiento tisular y examinar la integridad epitelial tras 3 horas de exposición a GLP-1RA y GDC. Como se muestra en la Figura 6, los tejidos recién aislados obtenidos mediante el método de calentamiento conservaron una arquitectura fisiológica epitelial normal, con capas estratificadas intactas y mucosidad superficial continua, y no mostraron evidencia de daño estructural. En cambio, los tejidos aislados por separación mecánica o sometidos a almacenamiento/congelación mostraron alteraciones menores en la morfología celular epitelial y una reducción del grosor del moco superficial. Las mucosas bucales expuestas a 25 mg de GLP-1RA en presencia de 25 mg de GDC mantuvieron la integridad epitelial y se parecieron mucho a controles no tratados. Solo se observaron edema leve y erosión epitelial superficial. Exposición a GLP-1RA sola o a blank y GLP-1RA: Las películas de doble capa cargadas con GDC no produjeron daño tisular visible, y las características histológicas fueron comparables a las de los tejidos de control tratados con PBS.

figure-results-2
Figura 1: Cavidad bucal porcina mostrando áreas mucosas bucales y sublinguales. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 2: FDCs y componentes. Seis cámaras están montadas en un sistema integrado (izquierda). Se muestra un individuo, Franz Cell (en el centro). El sistema de montaje para tejido bucal en una cámara individual (derecha). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 3: Componentes de insertos de resina impresos en 3D de 1 cm 2. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 4: Flujo de trabajo para el aislamiento, montaje, permeación y procesos de caracterización histológica del epitelio bucal porcina. Creado en BioRender.com. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 5: Cantidad acumulada de la RA GLP-1. Cantidad acumulada ex vivo de GLP-1 AR permeada en el lado receptor de la mucosa epitelial bucal porcina tras la aplicación de 180 minutos de 25 mg/mL de GLP-1RA (Rojo), 25 mg/mL de GLP-1RA: 25 mg/mL de solución GDC (Negra) y 25 mg/mL de GLP-1RA: 25 mg/mL de GDC cargada en películas (morado) aplicada mediante HTC, FDC y insertos 3D. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 6: Imágenes microscópicas teñidas con HE de mucosas epiteliales bucales porcinas bajo diferentes condiciones de exposición. (A) película en blanco, (B) mezcla acuosa de GLP-1RA: GDC, (C) películas atrapadas con GLP-1RA:GDC, (D) mucosas aisladas de tejido fresco tras tratamiento térmico (65 °C), (E) epitelio bucal aislado de tejido congelado tras tratamiento térmico, (F) mucosas aisladas mediante un método mecánico. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Composición de la capa mucoadhesiva
ComponentesConcentración (mg)
GLP-1RA12,5 mg
GDC12,5 mg
HPMC45 mg
Na-CMC10 mg
PVP-K9025 mg
Glicerol3 mg
Aerosil 200F2 mg
Capa de respaldo
Celulosa etil5 mg
Propilenglicol5 mg

Tabla 1: Composición de las capas mucoadhesivas y de soporte de película bucal.

Figura suplementaria 1: Adsorción de GLP-1RA tras incubar 0,5 mg de GLP-1RA durante 6 horas con insertos 3D. Los datos son la media ± DE de tres experimentos (n = 3).Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 2: Coeficiente de permeabilidad aparente (Papp) de un GLP-1RA tras la exposición de 3 horas de tejido mucoso bucal porcino montado en insertos 3D. 25 mg/mL de solución de GLP (rojo), 25 mg/mL de GLP + 25 mg/mL de solución acuosa de GDC (negro) y 25 mg/mL de GLP + 25 mg/mL de GDC incorporado en películas bucales (morado). Los datos representados son la media ± DE (n = 3). Se observó significación estadística entre grupos: p < 0,05. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 3: Resistencia transepitelial (TEER). Reducción gradual de la resistencia transepitelial (TEER) a partir de tejido epitelial bucal porcino aislado fijado en insertos 3D, tras la exposición a 25 mg/mL de GLP-1 + 25 mg/mL de solución GDC (rojo), 25 mg/mL de GLP-1 + 25 mg/mL de GDC en radiografías bucales (verde) y 25 mg/mL de GLP-1RA en PBS (azul). Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 4: Integridad y fuga de tejidos. La integridad y la fuga tisular se evaluaron exponiendo tejidos epiteliales bucales porcinos en insertos 3D a 0,05 mM FD4 en el lado donante. Las muestras se retiraron a intervalos fijos de 60 minutos durante 6 horas. Media +DS de tres experimentos. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 1: transwell-Oring-v7 (JOVE).stl.Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 2: transwell-v9 (JOVE).stl.Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 3: Detalles experimentales adicionales.Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Esta metodología describe protocolos experimentales para el aislamiento de epitelios bucales porcinos y otros epitelios oromucosos, junto con ensayos de permeabilidad para terapias basadas en péptidos utilizando un análogo estable de GLP-1RA de baja potencia comoejemplar 30. Los péptidos son macromoléculas hidrofílicas con permeabilidad despreciable a través de las membranas mucosas17. La ejecución exitosa del protocolo anterior depende del aislamiento y montaje precisos de la mucosa bucal y sublingual. El aislamiento requiere habilidad especializada y un riguroso control de la temperatura; Incluso pequeñas fluctuaciones térmicas durante el proceso de calentamiento pueden inducir cambios fisiológicos y morfológicos perjudiciales en el tejido epitelial, comprometiendo finalmente la integridad de los datos de permeación. Además, la fijación del tejido aislado dentro de los insertos personalizados impresos en 3D representa un paso crítico. Dada la naturaleza delicada de las capas epiteliales, existe un mayor riesgo de rotura o fuga de tejido durante el montaje. Para mitigar esto, empleamos una prueba de fuga FD4, que sirve como medida de control de calidad para asegurar la integridad de la membrana antes de comenzar los estudios de flujo. La fuga FD4 se evaluó inicialmente visualmente y se cuantificó aún más mediante espectroscopía UV-visible. Los datos correspondientes se proporcionan en los datos suplementarios (Figura Suplementaria 4 y Archivo Suplementario 3).

La FDC convencional, considerada estándar para estudios ex vivo , suele presentar desafíos a la hora de cuantificar terapias peptídicas debido a los altos volúmenes en la cámara receptora, típicamente de 10 mL. El alto volumen conduce a una dilución excesiva de la muestra, lo que reduce las concentraciones de péptidos permeados por debajo del LOD más bajo para los métodos analíticos estándar. Para evitar esto, desarrollamos un novedoso inserto impreso en 3D que imita la escala y el volumen del sistema de transwells utilizado para monocapas celulares epiteliales, incluyendoCaco-2 31. Los insertos pueden colocarse directamente en placas estándar de cultivo tisular de 12 pozos y acomodan de forma segura mucosas epiteliales bucales porcinas aisladas. Esta modificación reduce significativamente el volumen del compartimento donante casi 7 veces hasta 1,5 mL, concentrándose así en el analito y superando las limitaciones de sensibilidad del uHPLC. Esta adaptación es especialmente importante para la cuantificación de fármacos péptidicos costosos de baja permeabilidad.

Se observó un aumento en la permeación de la AR de GLP-1 en presencia de GDC utilizando el sistema de inserción 3D. La cantidad acumulada permeada de GLP-1RA alcanzó ~55,3 μg a las 3 horas, correspondiendo al ~4,3 % de la concentración inicialmente aplicada al lado donante. En contraste, no se detectó un flujo medible de GLP-1 RA cuando se aplicaron concentraciones similares de GLP-1RA y GDC atrapadas en películas bucales a mucosas bucales montadas en FDCs, lo que sugiere que pudo producirse permeación peptídica pero permaneció analíticamente indetectable debido a una dilución excesiva en el gran volumen receptor. Sin embargo, la permeación acumulada de GLP-1 RA de la formulación de película bucal bicapa alcanzó aproximadamente el 1,8 % a 3 horas en insertos 3D durante 3 horas, demostrando la viabilidad de detectar el transporte peptídico de bajo nivel a través del tejido bucal a partir de formas dosificadas utilizando el sistema receptor miniaturizado. La permeación ex vivo de GLP-1 AR también se evaluó utilizando HTCs que contenían un algodón cargado con el péptido y la GDC. Este es un dispositivo de cribado inicial muy útil para demostrar el concepto de que la presentación de un péptido a partir de películas con un potenciador de permeación puede ser posible. La integridad de la barrera del epitelio bucal porcino puede monitorizarse durante el experimento utilizando TEER y fuga FD-4. Se observó una disminución lenta y dependiente del tiempo en la TEER durante la exposición al agonista del receptor GLP-1 (GLP-1 AR), lo cual es consistente con un aumento del transporte paracelular inducido en las mucosas bucales por la salbiliar 32.

Una limitación de esta técnica es la dependencia de tejido porcino fresco, que no siempre está disponible bajo demanda en los mataderos, y la calidad del tejido puede variar. Para abordar las limitaciones de obtener tejido fresco a una distancia razonable del laboratorio, evaluamos la crioprotección para almacenar muestras de alta calidad que podríamos utilizar posteriormente. Aunque el uso de tejido fresco es óptimo, el uso de tejidos mucosos almacenados aislados requiere un uso cuidadoso de crioprotectores y tasas de congelación para evitar la formación de cristales de hielo y el posterior daño a la barrera. El protocolo tiene la capacidad de salvar la brecha entre los estudios estándar de permeación a gran escala y el análisis de péptidos de alta sensibilidad. Al optimizar tanto el proceso de aislamiento tisular como el protocolo de permeación utilizando insertos 3D, hemos logrado un grado mayor de reproducibilidad y sensibilidad que el que normalmente se informa con los FDC. Además, el uso de insertos 3D proporciona un marco para que los investigadores establezcan límites de detección para costosas moléculas peptídicas, lo que representa una mejora significativa en la flexibilidad y el rendimiento de la investigación mucosa ex vivo .

Estos protocolos proporcionan una base para la medición fiable de la permeación del tejido mucoso utilizando clases de fármacos más allá de los péptidos. La capacidad de generar perfiles de permeación de alta resolución a partir de modelos ex vivo ayudará a predicir datos de absorción preclínica derivados de modelos animales. La permeación ex vivo de la RA GLP-1 también fue evaluada utilizando HTCs que contenían una almohadilla de algodón cargada con el péptido y GDC, una solución potenciadora de permeación. Este enfoque de administración aseguró un contacto íntimo y reproducible entre la mezcla y la superficie mucosa. Se observó un aumento significativo en la permeación de GLP-1RA con una proporción 1:1 de GDC en insertos 3D que imitan los transpozos. Este es un dispositivo de cribado muy útil para demostrar el concepto de que la presentación de un péptido a partir de películas con un potenciador de permeación puede ser posible en un diseño construido adaptado de monocapas cultivadas de células epiteliales a mucosas tisulares. La integridad de la barrera del epitelio bucal porcino puede monitorizarse durante el experimento mediante medición TEER y fuga FD4.

En general, las evaluaciones de permeación ex vivo e histológicas demuestran que la evaluación fiable del transporte bucal y sublingual de péptidos en presencia de un potenciador de permeación depende de la preparación tisular, los protocolos de flujo y la sensibilidad analítica. Entre los enfoques de aislamiento examinados, la separación del epitelio bucal y sublingual porcino recién obtenido mediante el método de calor proporcionó un buen equilibrio entre mantener la integridad epitelial y la reproducibilidad por disección tisular, como lo demuestra un TEER basal estable, una fuga mínima de FD4 y la preservación de estructuras celulares tisulares. Es importante destacar que el inserto impreso en 3D mejoró notablemente la fiabilidad experimental al reducir la dilución del compartimento receptor, permitiendo cuantificar flujos péptidos bajos que eran indetectables en las FDC. En conjunto, estos hallazgos apoyan el uso de mucosas epiteliales bucales porcinas aisladas en una cámara de inserción tisular como plataforma ex vivo para evaluar la administración bucal de péptidos terapéuticos para la administración sistémica.

Divulgaciones

Los autores no tienen implicaciones financieras ni conflictos de interés que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Ben Shovlin (Escuela de Medicina Veterinaria de UCD) por su asistencia técnica. También agradecemos al Dr. Hans Eckhardt (Escuela de Química de UCD) por su apoyo con el análisis de uHPLC. Este proyecto ha recibido financiación del programa de investigación e innovación Horizon Europe de la Unión Europea bajo la subvención número 101071054. También agradecemos el apoyo financiero adicional de la Subvención Número 13/RC/2073_P2, el Centro CURAM de Research Ireland para Dispositivos Médicos y el Fondo Europeo de Desarrollo. Los autores quieren agradecer a Kenneth McNamara de Rosderra Irish Meats por la provisión de mejillas de cerdo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Computer / LaptopGenéricoCualquier sistema estándar≥8 GB RAM recomendado
Script de adquisición de datosPersonalizadocollect.pyScript de adquisición basado en Python
Electrodos de gel desechablesGenéricoElectrodos Ag/AgCl pre-gelificadosDe un solo uso, adhesivo
Módulo de adquisición de EEGUpside Down LabsBioAmp EXG PillFrente analógica para señales biopotenciales
Gel para electrodos (si se utilizan electrodos reutilizables)GenéricoGel conductorMejora la conductividad de la señal
Aplicación interactiva (juego)GenéricoCualquier juego simple (por ejemplo, carreras)Interfaz controlada por teclado
Cables puenteGenéricoConectores macho-hembraCables de breadboard estándar
Matplotlib / SeabornCódigo abiertoÚltimas versionesBibliotecas de visualización
Placa de microcontroladorArduinoUno / Maker UnoADC de 10 bits, interfaz USB
Entorno de programación PythonPython Software FoundationPython ≥3.8Lenguaje de programación de código abierto
Biblioteca PyTorchMeta AIVersión ≥1.12Marco de trabajo de aprendizaje profundo
Scikit-learnCódigo abiertoÚltima versión estableUtilidades de ML
Bibliotecas de procesamiento de señalesSciPyÚltima versiónFiltrado, STFT
Cable USBGenéricoUSB Tipo-A a BCable de transferencia de datos

Referencias

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