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Artículo de investigación
Este estudio integra farmacología en red y experimentos in vivo para investigar los posibles efectos de la píldora de Yougui en el tratamiento de la prostatitis. El análisis de farmacología de redes y el tratamiento con YGP en un modelo de prostatitis de rata sugirieron que los efectos terapéuticos de YGP pueden estar asociados con la regulación de las respuestas inflamatorias, indicando que YGP ejerce efectos antiinflamatorios en la prostatitis.
La prostatitis es un trastorno urológico común con opciones de tratamiento limitadas. La Píldora Yougui (YGP) ha demostrado un potencial valor terapéutico, especialmente en condiciones relacionadas con la inflamación. Este estudio tenía como objetivo evaluar sus efectos y explorar posibles mecanismos subyacentes. Los componentes activos del YGP se examinaron a partir de TCMSP utilizando criterios de biodisponibilidad oral (OB ≥ 30%) y de semejanza del fármaco (DL ≥ 0,18), y se recogieron objetivos correspondientes. Se obtuvieron objetivos relacionados con la prostatitis a partir de GeneCards, y los objetivos superpuestos se analizaron utilizando redes de interacción proteína-proteína (IBP) y el enriquecimiento de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kyoto (KEGG). Se identificaron un total de 126 compuestos activos y 208 objetivos potenciales, con 180 objetivos solapados asociados a prostatitis. El análisis de IBP identificó TP53, IL6, AKT1, TNF e IL1B como genes clave del núcleo. El enriquecimiento KEGG sugirió la implicación de vías relacionadas con la inflamación, incluyendo las vías de señalización IL-17, TNF, MACK y PI3K-Akt. Se estableció un modelo de prostatitis en ratas mediante la inyección intraprostática de carragenina. Se realizaron exámenes histológicos y la medición del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) e interleucina-6 (IL-6) para evaluar los efectos terapéuticos. El tratamiento con YGP mejoró la histopatología prostática y redujo los niveles de TNF-α e IL-6 tanto en proteínas como en ARNm. Estos hallazgos sugieren que el YGP ejerce efectos antiinflamatorios en la prostatitis, mientras que los mecanismos moleculares específicos aún están por validarse.
La prostatitis es una afección en la que la glándula prostática se inflama con hinchazón eirritación 1. Representa aproximadamente el 25% de los encuentros clínicos urológicosglobales 2. Los Institutos Nacionales de Salud (NIH) estratificaron la prostatitis en cuatro clasificaciones: bacteriana aguda, bacteriana crónica, prostatitis crónica/síndrome de dolor pélvico crónico (PC/CPPS) y prostatitisasintomática 3. Entre ellas, la PC/CPPS es la forma más prevalente y está estrechamente asociada con inflamación persistente y desregulación inmunitaria. A pesar de los avances en la comprensión de la naturaleza inflamatoria de la prostatitis, las estrategias terapéuticas actuales siguen siendo limitadas, especialmente para los subtipos nobacterianos 4,5. Los antibióticos se utilizan comúnmente en la práctica clínica; sin embargo, su eficacia en la prostatitis no bacteriana es muycontrovertida 6. Otros tratamientos, que van desde bloqueadores de α hasta antiinflamatorios no esteroideos (AINEs), se dirigen principalmente al alivio de los síntomas pero a menudo muestran resultados subóptimos, con riesgos no despreciables de alteraciones gastrointestinales, hipotensión ortostática, etc. 7,8,9,10. Estas limitaciones ponen de manifiesto la necesidad de enfoques terapéuticos alternativos que puedan modular eficazmente la inflamación en la prostatitis.
La medicina tradicional china (MTC) puede ofrecer una gama más amplia de beneficios terapéuticos con un perfil de seguridad y tolerabilidad másfavorable 11. La píldora Yougui (YGP), una fórmula clásica documentada en Jingyue Quanshu, se ha utilizado empíricamente durante siglos para reponer el yang renal y aliviar trastornos relacionados12. Estudios previos han informado que algunos de sus componentes poseen actividadesantiinflamatorias 13,14,15,16. La evidencia clínica sugiere que la YGP puede aliviar eficazmente los síntomas de la prostatitis, aunque el mecanismo subyacente sigue sin estar claro17. La farmacología de redes sirve como un enfoque poderoso e integrador que combina biología de sistemas y farmacología para descubrir los complejos mecanismos de la medicina tradicional18. Se planteó la hipótesis de que la YGP podría ejercer efectos antiinflamatorios al modular múltiples dianas y vías relacionadas con la inflamación. Estas predicciones se evaluaron posteriormente utilizando un modelo in vivo de prostatitis, en el que la prostatitis se indujo mediante inyección de carragenina. Tras el establecimiento del modelo, los animales fueron tratados con YGP. Se recogieron tejidos prostáticos para examen histopatológico mediante tinción de hematoxilina y eosina (HE), así como para la evaluación cuantitativa de marcadores inflamatorios mediante ensayo inmunoenzimático ligado a enzimas (ELISA) y reacción en cadena cuantitativa en tiempo real de la polimerasa (qRT-PCR).
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Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal de la Universidad de Medicina China de Pekín (BUCM-2024110107-4103).
Colección de constituyentes activos y objetivos
YGP está formado por Rehmannia glutinosa, Aconitum carmichaelii, Cinnamomum cassia, Dioscorea opposita, Cornus officinalis, Cuscuta chinensis, Angelica sinensis, Eucommia ulmoides, Cervi Cornus Colla y Lycium barbarum. Estos nombres de hierbas se introdujeron en la base de datos y plataforma de análisis de sistemas de medicina tradicional china (TCMSP) para recuperar sus compuestos. Los compuestos activos se examinaron utilizando los criterios de biodisponibilidad oral (OB ≥ 30%) y de similitud de fármaco (DL ≥ 0,18) 19,20,21. Los objetivos correspondientes de cada compuesto se obtuvieron a partir de TCMSP y se estandarizaron a símbolos génicos utilizando la base de datos UniProt. Se recuperaron objetivos relacionados con la prostatitis de la base de datos GeneCards usando "prostatitis" como palabra clave, y se seleccionaron genes con una puntuación de relevancia superior a la media para su inclusión en el estudio.
Construcción de la red reguladora de YGP contra la prostatitis
Se identificó y definió la intersección entre objetivos relacionados con YGP y prostatitis como un conjunto de posibles objetivos terapéuticos. Estos objetivos se importaron a Cytoscape (versión 3.9.1) para construir una red compuesto-objetivo-enfermedad. El análisis topológico de la red se realizó utilizando el plugin CytoHubba, y se identificaron componentes clave en función de los valores de centralidad máxima de la clique (MCC) 22.
Análisis de redes de interacción proteína-proteína (IBP)
Los objetivos superpuestos se importaron a la base de datos STRING (versión 11.5), con el organismo configurado como Homo sapiens. La puntuación mínima requerida de interacción se estableció en ≥ 0,7, y los nodos desconectados quedaronocultos en 23. Los datos de interacción se exportaron en formato TSV y se visualizaron en Cytoscape. Los genes hub se identificaron además utilizando el plugin CytoHubba en función de la centralidad de grados.
Análisis de enriquecimiento de la vía KEGG y GO
Los objetivos compartidos se subieron a la plataforma Metascape para el análisis de vías de la enciclopedia de genes y genomas de Kioto (KEGG). Las especies de entrada y análisis se ajustaron a Homo sapiens. Se realizó un análisis de enriquecimiento de vías KEGG. Las vías se filtraron aún más según su relevancia para la prostatitis, según la literatura publicada y las anotaciones de bases de datos. Las vías restantes se clasificaron según sus valores de Log P. Las vías de KEGG enriquecidas por encima se visualizaron usando diagramas de burbujas.
Acoplamiento molecular
Los objetivos clave se seleccionaron de la red PPI en función de la centralidad del grado, y los compuestos activos se identificaron a partir de la red reguladora YGP-prostatitis basándose en los valores MCC para análisis posteriores de acoplamiento. Las estructuras proteicas se obtuvieron de la Base de Datos de Estructuras de Proteínas AlphaFold en formato PDB, y las estructuras de ligandos se descargaron de TCMSP en formatomol2 24. El acoplamiento molecular se realizó utilizando la plataforma online25 de CB-Dock2. Antes del acoplamiento, las estructuras proteicas se preprocesaban automáticamente eliminando moléculas de agua, añadiendo átomos de hidrógeno y completando los residuos faltantes. Se registraron afinidades de enlace y se generaron mapas de calor usando GraphPad Prism (versión 10.1.2). Las estructuras tridimensionales de los complejos ligando-proteína con las puntuaciones más bajas de Vina se visualizaron usando ChimeraX, y se generaron diagramas de interacción bidimensionales con LigPlus.
Preparación del extracto acuoso YGP
Los componentes herbales de YGP se prepararon según la proporción tradicional de formulación, incluyendo 24 g de raíz procesada de Rehmannia glutinosa (Shudihuang), 6 g de raíz lateral procesada de Aconitum carmichaelii (Fuzi), 6 g de corteza de Cinnamomum cassia (Rougui), 12 g del rizoma de Dioscorea opuesto (Shanyao), 9 g del fruto de Cornus officinalis (Shanzhuyu), 12 g de la semilla de Cuscuta chinensis (Tusizi), 12 g de la gelatina procesada de astas de Cervi Cornus Colla (Lujiaojiao), 12 g del fruto de Lycium barbarum (Gouqi), 9 g de la raíz de Angelica sinensis (Danggui) y 12 g de la corteza de Eucommia ulmoides (Duzhong). Todas las hierbas, excepto Aconitum carmichaelii y Cervi Cornus Colla , se remojaron en 6 veces su peso total de agua destilada durante 30 minutos, mientras que Aconitum carmichaelii se remojó por separado en 6 veces su peso de agua destilada. Aconitum carmichaelii se decocció primero usando un dispositivo eléctrico de calefacción durante 1 hora, tras lo cual se añadieron y decoccionaron las hierbas restantes, excluyendo Cervi Cornus Colla, dos veces durante 1 hora cada ciclo. Posteriormente, Cervi Cornus Colla se fundía en un baño maria a 60–70 °C hasta que se disolvía completamente e incorporaba al extracto. Tras el enfriamiento, la decocción se filtraba a través de gasa de doble capa, se alicutaba, se congelaba a -20 °C durante 48 horas y se liofilizaba para obtener un extracto en polvo.
Modelo animal y diseño experimental
Los machos de rata Sprague-Dawley (8 semanas, 200–220 g) fueron alojados bajo condiciones específicas libres de patógenos, con un ciclo de 12 horas luz/oscuridad y libre acceso a comida y agua. Tras una semana de aclimatación, las ratas se dividieron aleatoriamente en tres grupos (n = 6 por grupo): grupos, grupo modelo y YGP. La prostatitis crónica fue inducida por inyección intraprostática de disolución26 de carragenina al 3%. Brevemente, las ratas fueron anestesiadas con isoflurano (3–4% para inducción y 1,5–2% para mantenimiento), y se realizó una incisión abdominal en la línea media para exponer la próstata. Se inyectó un total de 25 μL de disolución de carragenina al 3% en cada lóbulo ventral de la próstata. El grupo de control recibió solo una inyección intraprostática de solución fisiológica salina normal. Se administró penicilina postoperatoria (2,5 × 105 U/kg) por vía intramuscular durante 3 días.
Se preparó extracto liofilizado YGP a partir de la decocción y se reconstituyó en solución fisiológica normal estéril al 0,9% para obtener una suspensión uniforme para la gavage oral (10,54 g/kg/día). Las ratas del grupo YGP recibieron la administración oral de extracto YGP (10 mL/kg), mientras que los grupos control y modelo recibieron un volumen equivalente de 0,9% de solución fisiológica normal estéril. Tras 4 semanas, las ratas fueron anestesiadas con pentobarbital sódico (50 mg/kg, inyección intraperitoneal), y se recogieron tejidos prostáticos tras ser sacrificadas conforme a las directrices éticas.
Examen histopatológico
Los tejidos prostáticos se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 24 horas, deshidratados mediante etanol graduado (75% alcohol durante 4 horas, 85% alcohol durante 2 horas, 90% alcohol durante 2 horas, 95% alcohol durante 1 hora, etanol absoluto durante 1 hora), eliminados en xileno e incorporados en parafina. Las secciones (4–5 μm) fueron sometidas a tinción con HE según los procedimientosestándar 27. Brevemente, las secciones se desparafinizaron, rehidrataron, tiñeron con hematoxilina, se diferenciaron y contra-tintizaron con eosina. Tras la deshidratación y el montaje, las secciones se observaron bajo un microscopio óptico para su evaluación histopatológica.
La inflamación histopatológica se evaluó utilizando un sistema de puntuación semicuantitativa basado en la infiltración de células inflamatorias, la proliferación de fibroblastos, la morfología acinar y el estado de secreción. La infiltración inflamatoria de células se puntuó como 0 (sin infiltración), 2 (infiltración leve), 4 (infiltración moderada) y 6 (infiltración grave). La proliferación de fibroblastos se clasificó como 0 (ausente), 1 (leve), 2 (moderada) y 3 (grave). La morfología acinar se evaluó como 0 (luz acinar grande), 1 (tamaño de luz moderadamente reducido), 2 (tamaño de luz marcadamente reducido) y 3 (oclusión o desaparición de luz acinar). El estado de secreción se puntuó como 0 (secreción abundante), 1 (secreción moderada), 2 (secreción escasa) y 3 (secreción ausente). La puntuación histopatológica total se calculó como la suma de los cuatro parámetros, con puntuaciones más altas indicando una lesión y inflamación del tejido prostáticomás graves 28.
ELISA
Los tejidos prostáticos (100 mg) se enjuagaron con solución fisiológica tamponada (PBS) y se homogeneizaron en tampón de lisis suplementado con inhibidores de proteasa. Los homogenados se incubaron a 4 °C durante 30–120 minutos y se centrifugaron a 5000 × g durante 15 minutos a 4 °C para recoger los sobrenacionantes. Los niveles de proteínas de TNF-α e IL-6 se midieron utilizando kits ELISA según las instrucciones del fabricante. Se añadieron estandartes y muestras a placas de 96 pozos e incubadas a 37 °C, seguidas de incubación secuencial con anticuerpos biotinilados y conjugados enzimáticos. Tras el lavado, se añadió la solución de sustrato para el desarrollo del color y la reacción terminó con la solución de parada. La absorbancia se midió a 450 nm usando un lector de microplacas. Las concentraciones de citocinas se calcularon basándose en curvas estándar.
qRT-PCR
El ARN total se extrajo de los tejidos prostáticos mediante un método basado en columnas y se cuantificó midiendo la absorbancia a 260 y 280 nm para evaluar la pureza. Las muestras de ARN se transcribieron inversamente en ADNc a 42 °C durante 15 minutos utilizando un kit de transcripción inversa. qRT-PCR se realizó utilizando un termociclador bajo las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 95 °C durante 3 minutos, seguida de 40 ciclos de 95 °C durante 10 s y 60 °C durante 30 s. Las secuencias de cebadores utilizadas en este estudio se enumeran en la Tabla Suplementaria 1. Las señales de fluorescencia se recogieron durante la etapa de recocido/extensión. Los niveles de expresión de TNF-α e IL-6 se normalizaron al gen de referencia interno GAPDH. La expresión génica relativa se calculó utilizando el método 2−ΔΔCt .
Análisis estadístico
Todos los datos se presentan como media ± desviación estándar (DS). Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism (versión 10.1.2). La distribución de los datos se evaluó para verificar la normalidad antes del análisis. Las diferencias entre múltiples grupos se analizaron mediante análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) seguido por la prueba post hoc de Tukey para comparaciones múltiples. Se consideró estadísticamente significativo un valor de p < 0,05.
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Identificación de componentes bioactivos y genes objetivo
Se identificaron un total de 126 componentes bioactivos en YGP que cumplen los criterios (OB ≥ 30% y DL ≥ 0,18). correspondiente a 208 genes objetivo predichos. La base de datos GeneCards arrojó 9.845 genes asociados a la prostatitis. El análisis de Venn reveló 180 genes superpuestos entre los objetivos predichos del YGP y los genes relacionados con la prostatitis, lo que sugiere que estos objetivos compartidos...
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La prostatitis se define patológicamente por una mayor presencia de células inflamatorias dentro del parénquima prostático omesénquima 28,29. En un estudio con más de 5 millones de hombres coreanos seguidos durante nueve años, Kim et al. confirmaron mediante análisis multivariantes que la prostatitis aumenta significativamente el riesgo de desarrollar cáncer depróstata 30. Sin embargo, el manejo clínico ac...
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Los autores no reportan conflictos de interés en esta obra.
Los autores agradecen con gratitud el apoyo financiero de los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales (2022-JYB-JBZR-037).
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 4% paraformaldehído | Beyotime | P0099-3L | |
| Base de Datos de Estructura de Proteínas AlphaFold | Base de Datos de Estructura de Proteínas AlphaFold | https://alphafold.ebi.ac.uk/ | |
| BeyoFast SYBR Mezcla verde qPCR (2X) | Beyotime | D7260 | |
| Plataforma en línea de bioinformática | Plataforma en línea de bioinformática | http://www.bioinformatics.com.cn/ | |
| Carragenino | OriLeaf | S30559 | |
| CB-DOCK2 | CB-DOCK2 | http://183.56.231.194:8001/cb-dock2/php/blinddock.php | |
| Cytoscape | Cytoscape | https://cytoscape.org/ | |
| GeneCards | GeneCards | https://www.genecards.org/ | |
| Hematoxilina y eosina (H&; E) Kit de tinte | Beyotime | C0105S | |
| Metascape | Metascape | https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1 | |
| Neutral Balsam | Servicebio | WG10004160 | |
| Cera de parafina (para incrustación) | Servicebio | RP-15 | |
| Cóctel inhibidor de proteasas (100X) | Epizima | GRF101 | |
| Kit IL-6 ELISA de ratas | Beyotime | PI328 | |
| Rat TNF-& alpha; Equipamiento | Pekín y Bolsa de Invierno; 4A Biotech Co., Ltd | CRE0003 | |
| Kit de aislamiento de ARN largo para animales RNAeasy con columna de spin | Beyotime | R0026 | |
| STRING | STRING | https://string-db.org/ | |
| TCMSP | TCMSP | https://www.tcmsp-e.com/#/database | |
| Uniprot | Uniprot | https://www.uniprot.org/ |