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Artículo de investigación
La lactona sesquiterpeno XTT atenúa eficazmente las respuestas inflamatorias inducidas por lipopolisacáridos (LPS) en macrófagos. XTT actúa en IKKα/β para inhibir la señalización de NF-κB sin afectar la activación de MAPK, ejerciendo así potentes efectos antiinflamatorios in vitro.
La desregulación de la cascada del factor nuclear κB (NF-κB) está estrechamente vinculada a la progresión de trastornos inflamatorios. Las quinasas IκB (IKKs) están bien establecidas como moduladoras centrales de la actividad de NF-κB, lo que las convierte en candidatas terapéuticas atractivas para tratar patologías inflamatorias. Se ha documentado que el sesquiterpeno lactona 1β-hidroxil-5α-cloro-8-epi-xantatina (XTT) ejerce potentes efectos anticancerígenos. Sin embargo, su actividad antiinflamatoria y sus mecanismos moleculares subyacentes siguen siendo poco claros. En este trabajo, XTT suprimió notablemente la síntesis de óxido nítrico (NO) y prostaglandina E2 (PGE2) en los macrófagos RAW264.7 activados por lipopolisacáridos (LPS). La XTT también redujo sustancialmente los niveles de ARNm inducible de óxido nítrico sintasa (iNOS), ciclooxigenasa-2 (COX2), factor de necrosis tumoral α (TNF-α), interleucina-1β (IL-1β) e interleucina-6 (IL-6). Además, XTT reguló a la baja los niveles de proteínas de iNOS y COX2 provocados por el tratamiento con LPS. A nivel mecanicista, la XTT no alteró notablemente la actividad de la cascada de proteínas quinasa activada por mitógenos (MAPK). Por el contrario, XTT bloqueó fuertemente la fosforilación y la descomposición de κBα inhibitorio (IκBα) desencadenadas por LPS al interactuar con IKKα/β, perjudicando así la translocación nuclear NF-κB. En conjunto, estos datos muestran que XTT provoca efectos antiinflamatorios robustos in vitro al dirigirse a IKKα/β y bloquear la señalización de NF-κB. Estos resultados sugieren que el XTT podría servir como un prometedor compuesto principal para el desarrollo de agentes antiinflamatorios. Se requieren más estudios bioquímicos e in vivo para validar la inhibición directa de IKKα/β y el potencial terapéutico.
La inflamación es un proceso biológico fuertemente regulado que permite a los organismos responder a infecciones, lesiones tisulares y otros desafíosambientales 1. Aunque las respuestas inflamatorias agudas suelen ser protectoras, la activación persistente de las vías inflamatorias puede alterar la homeostasis tisular y contribuir al inicio y progresión de trastornos crónicos, incluyendo la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) y la artritis reumatoide (AR)2. Numerosas redes de señalización intracelular participan en la regulación inflamatoria, entre las cuales la vía del factor nuclear-κB (NF-κB) es una de las más ampliamenteestudiadas 3.
Los miembros de la familia NF-κB, incluyendo p50, p52, p65 (RelA), RelB y c-Rel, funcionan como factores de transcripción diméricos que regulan la expresión de genes implicados en la inmunidad y lainflamación 4,5. En condiciones basales, los dímeros NF-κB permanecen inactivos en el citoplasma mediante la asociación con inhibidores de proteínas κB (IκB). Tras la estimulación por mediadores inflamatorios como el lipopolisacárido (LPS) o el factor de necrosis tumoral-α (TNF-α), el complejo IκB quinasa (IKK) se activa y fosforila IκBα, lo que provoca su ubiquitinación y degradación. Este proceso permite que los complejos NF-κB se acumulen en el núcleo e inicien la transcripción de mediadores inflamatorios ycitocinas 6. Dado que la activación excesiva o sostenida de NF-κB está estrechamente asociada con una variedad de enfermedades inflamatorias y autoinmunes, la intervención farmacológica a nivel de señalización IKK ha atraído un interésconsiderable 7,8,9.
Los productos naturales han sido durante mucho tiempo fuentes vitales para el desarrollo de fármacos, incluyendo las terapiasantiinflamatorias 10. El 1β-hidroxilo-5α-cloro-8-epi-xantaina (XTT) es una lactona sesquiterpeno aislada de Xanthium sibiricum11,12. Investigaciones previas han demostrado que la XTT suprime la proliferación celular y desencadena la apoptosis en células hepatocelulares humanas mediante la activación de ERK/p38 de MAPK mediada por ROS y la inhibición de JAK2/STAT3 causada por la depleción deglutatión 13. Sin embargo, el potencial antiinflamatorio de la XTT y sus mecanismos moleculares asociados aún se comprenden poco.
Los hallazgos actuales indican que el XTT presenta efectos antiinflamatorios sustanciales in vitro. Las investigaciones mecanicistas indican que la XTT interactúa con IKKα/β y suprime la señalización de NF-κB, inhibiendo así las respuestas inflamatorias en macrófagos activados. Estos hallazgos sugieren que el XTT podría representar un compuesto líder prometedor para el desarrollo de agentes antiinflamatorios.
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Este estudio solo involucró líneas celulares comerciales establecidas y no incluyó participantes humanos, muestras clínicas ni experimentos con animales. Por tanto, no se requería la aprobación ética institucional ni el consentimiento informado. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices de seguridad del laboratorio institucional. Los reactivos peligrosos se manipulaban en campanas extractoras designadas, utilizando el equipo de protección individual (EPP) adecuado. Los residuos químicos y biológicos se eliminaban conforme a la normativa institucional. Los productos químicos, kits y reactivos utilizados en el protocolo se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Cultivo celular
Los macrófagos murinos RAW264.7, las células de carcinoma cervical humano HeLa y HEK293T células embrionarias de riñón humano fueron adquiridas al Banco Celular de la Academia China de Ciencias (Shanghái, China). Todas las células se mantuvieron en el Medio Águila Modificado (DMEM) de Dulbecco, que contenía un 10% de suero bovino fetal (FBS) y un 1% de penicilina-estreptomicina. El ambiente de cultivo se estableció en 37 °C con un 5% de CO₂ y humedad saturada.
2. Ensayo de viabilidad celular
La viabilidad celular se evaluó mediante un ensayo de Kit de Conteo Celular-8 (CCK-8). RAW264,7 células (2,5 × 104 celdas/pozo) se emplacaron en placas de 96 pozos y se cultivaron durante la noche a 37 °C. Las células fueron luego tratadas con concentraciones variables de XTT durante 24 horas, con o sin LPS (0,5 μg/mL). La concentración de LPS y la duración del tratamiento se optimizaron en experimentos preliminares para inducir respuestas inflamatorias moderadas sin causar citotoxicidad significativa. Posteriormente, se añadieron 10 μL de reactivo CCK-8 a cada pozo, y la placa se mantuvo a 37 °C durante 2 horas. La absorbancia se midió a 540 nm usando un lector de microplacas.
3. Determinación de los niveles de NO y PGE₂ en el medio de cultivo celular
Las células RAW264,7 se emplacaron en placas de 24 pozos a una densidad de 2,5 ×10 5 células por pozo y se cultivaron durante la noche a 37 °C. Las células fueron pretratadas con XTT durante 2 horas antes de la estimulación LPS o TNF-α (15 ng/mL) durante otras 24 horas. El periodo previo al tratamiento de 2 horas se eligió para permitir una interacción adecuada entre XTT y los blancos celulares antes del desafío inflamatorio. Los niveles de óxido nítrico (NO) y prostaglandina E₂ (PGE₂) en el medio de cultivo se cuantificaron siguiendo los protocolos del fabricante.
4. Reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa en tiempo real (qRT-PCR)
Las 264,7 células RAW (2 × 106 células) se colocaron en placas de 6 pozos durante la noche y se pretrataron con diversas dosis de XTT durante 2 horas antes del desafío LPS (0,5 μg/mL) durante 24 horas. El ARN total se aisló usando reactivo TRIzol según las instrucciones del fabricante. La concentración y pureza del ARN se evaluaron utilizando un espectrofotómetro, y se utilizaron muestras con relaciones A260/A280 >1,8 para análisis posteriores.
El ARN total (2 μg) se transcribió inversamente en ADNc en un volumen de reacción final de 20 μL utilizando un kit de síntesis de ADNc. La PCR cuantitativa en tiempo real se realizó utilizando la química verde SYBR en un sistema de detección de PCR en tiempo real. Las secuencias de cebadores fueron las siguientes:
iNOS adelante: 5′-GGA TCT TCC CAG GCA ACC A-3′
Reversa iNOS: 5′-AAT CCA CAA CTC GCT CCA AGA TT-3′
COX2 hacia adelante: 5′-CAA CAC CTG AGC GGT TAC-3′
COX2 reversa: 5′-GTT CCA GGA GGA TGG AGT-3′
IL-1β adelante: 5′-GCC TTG GGC CTC AAA GGA AAG AAT C-3′
IL-1β reversa: 5′-GGA AGA CAC AGA TTC CAT GGT GAA G-3′
IL-6 delantero: 5′-TGG AGT CAC AGA AGG AGT GGC TAA G-3′
IL-6 reversa: 5′-TCT GAC CAC AGT GAG GAA TGT CCA C-3′
TNF-α delantero: 5′-CAC CAC GCT CTT CTG TCT-3′
TNF-α reverso: 5′-GGC TAC AGG CTT GTC ACT C-3′
GAPDH delantero: 5′-TGC ACC AAC TGC TTA GC-3′
GAPDH reversa: 5′-GGC ATG GAC TGT GGT GATO GAG-3′
El procedimiento de amplificación por PCR se realizó como: desnaturalización inicial a 95 °C durante 5 minutos, seguida de 39 ciclos de 95 °C durante 15 s y 60 °C durante 30 s. Los niveles relativos de expresión génica se calcularon utilizando el método 2−ΔΔCt con GAPDH como control interno.
5. Manchado occidental
Tras el tratamiento, las células RAW264.7 se homogeneizaron en un tampón RIPA que contenía inhibidores de proteasa e fosfatasa. Estos inhibidores se preparaban frescos inmediatamente antes de su uso para evitar la degradación y desfosforilación de proteínas. Los niveles totales de proteínas se cuantificaron utilizando un kit de ensayo BCA. Cantidades iguales de proteína se separaron mediante electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio y poliacrilamida al 10% y se transfirieron a las membranas de nitrocelulosa. Tras la transferencia, las membranas se incubaron con leche desnatada al 5% preparada en TBST que contenía Tween-20 (TBST) para bloquear, y luego se sondearon con anticuerpos primarios (dilución 1:1.000) durante la noche a 4 °C. A continuación, se sondó las membranas con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (dilución 1:5.000) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las bandas proteicas se detectaron mediante un sistema de detección de quimiluminiscencia y las intensidades de las bandas se analizaron mediante cuantificación densitométrica.
6. Ensayo de inmunofluorescencia
Las células HeLa se sembraron en placas de 6 pozos y se pretrataron con XTT (8 μM) durante 4 horas antes de la estimulación de TNF-α (15 ng/mL) durante 30 minutos. Este periodo de preincubación de 4 horas se eligió para maximizar el compromiso del objetivo antes de la activación de NF-κB. Las células se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 15 minutos y permeabilizaron con 0,25% de Triton X-100 durante 15 minutos a temperatura ambiente. Tras el bloqueo con albúmina sérica bovina al 2% (BSA) y suero de cabra al 10% diluido en solución salina tamponada con fosfato (PBS), las células se incubaron con un anticuerpo primario anti-p65 (dilución 1:250) durante la noche a 4 °C, seguidas de una sondeación con un anticuerpo secundario conjugado con TRITC (dilución 1:1.000) durante 1 hora a temperatura ambiente. Los núcleos fueron contrateñidos con DAPI (0,5 μg/mL) durante 5 minutos en la oscuridad. Las imágenes de fluorescencia se capturaron utilizando un microscopio de fluorescencia. Las células HeLa fueron seleccionadas porque su gran proporción citoplasma-núcleo facilita la visualización de la translocación nuclear p65.
7. Fracionamiento citoplasmático y nuclear
Las células HeLa fueron preincubadas con XTT durante 4 horas y luego estimuladas con TNF-α (15 ng/mL) durante 30 minutos. Las células se recogieron, enjuagaron con PBS frío y se procesaron para la extracción de proteínas citoplasmáticas y nucleares utilizando un kit comercial de extracción de proteínas nucleares y citoplasmáticas según las instrucciones del fabricante. Todos los procedimientos se realizaron sobre hielo para preservar la integridad de las proteínas.
8. Ensayo de desplazamiento térmico celular (CETSA)
CETSA se llevó a cabo como se describióanteriormente el 14. Se recogieron aproximadamente 1 × 107 células HeLa y se resuspendieron en 500 μL de inhibidores de proteasas que contienen PBS en frío, y luego se lisaron mediante tres ciclos de congelación-deshielo en nitrógeno líquido. Los lisados celulares se centrifugaron a 20.000 × g durante 15 minutos a 4 °C. Los supernadantes resultantes se alicotizaron por igual en dos grupos y se trataron con XTT (100 μM) o DMSO durante 1 hora a temperatura ambiente. XTT (100 μM) se aplicó para mejorar la sensibilidad a la detección en experimentos CETSA. Las muestras se alicitaron en siete tubos y se calentaron a las temperaturas indicadas durante 3 minutos, seguido de incubación a temperatura ambiente durante otros 3 minutos. Se recogieron fracciones de proteínas solubles para el análisis de inmunoabsorbente.
9. Acoplamiento molecular
Se realizó el análisis de acoplamiento molecular como se describióanteriormente 14. Las estructuras cristalinas de IKKβ (IDs PDB: 3BRT y 4KIK) fueron recuperadas del Banco de Datos de Proteínas (PDB). Las estructuras proteicas se preprocesaron con PyMOL (versión 2.3.4) para eliminar moléculas de agua, ligandos originales e impurezas, seguido de la adición de átomos de hidrógeno. Se calcularon cargas de Gasteiger y se identificaron bolsas activas usando AutoDock Tools (versión 1.5.6). Las estructuras proteicas se almacenaron entonces en formato PDBQT.
La estructura XTT se generó en Chem3D (versión 15.1) y se optimizó mediante minimización de energía. El acoplamiento semi-flexible se realizaba usando AutoDock Vina (versión 1.1.2). Las cajas de cuadrícula se construyeron para cubrir completamente los bolsillos activos, mientras que todos los demás parámetros permanecieron en los ajustes predeterminados. Se seleccionaron para su análisis las poses de acoplamiento con las energías de enlace más bajas y las conformaciones más estables. Las energías de unión por debajo de −5 kcal/mol se consideraron indicativas de una fuerte afinidad de unión según los criterios publicados. PyMOL se empleó además para visualizar modos de unión y evaluar enlaces de hidrógeno, interacciones hidrofóbicas, interacciones de van der Waals y posibles sitios de unión.
10. Análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism 5.0. Los datos se presentan como la media ± el error estándar de la media (SEM) de tres experimentos independientes. La significación estadística se evaluó mediante análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) seguido de la prueba post hoc de Dunnett. Se consideró estadísticamente significativo un valor de p < 0,05.
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XTT inhibía la producción de NO y PGE₂ en macrófagos RAW264.7 estimulados por LPS o TNF-α
Para determinar si los efectos antiinflamatorios de la XTT eran independientes de la citotoxicidad, se evaluó la viabilidad celular de RAW264.7 tras el tratamiento con XTT en presencia o ausencia de LPS. No se detectó una reducción apreciable en la viabilidad celular en concentraciones que oscilaban entre 0,5 y 8 μM, lo que indica que el compuesto fue bien tolerado bajo las condi...
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Las lactonas sesquiterpenas son una clase de productos naturales con diversas actividades farmacológicas, incluyendo efectos antisépticos, antiinflamatorios, antipiréticos ydesintoxicantes 15. Estudios previos han demostrado que XTT, una lactona sesquiterpeno tipo xantanolido aislada de Xanthium sibiricum, muestra potentes efectos antiproliferativos y proapoptóticos en células carcinomáticas hepatocelulareshumanas 13. Este trabajo ...
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Los autores no declaran intereses en competencia.
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 82004031), el Proyecto de Investigación de la Administración Provincial de Medicina Tradicional China de Sichuan (Nº 2024MS566) y el Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (Nº 2023YFC3504402).
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Enhanced chemiluminescence reagent D20A2:D21A2:D22A2:D23A2: D24A2:D25A2:D26A2:D27A2:D28A2: D29A2:D30A2:D29 | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P90720 | detección de señal luminiscente |
| Anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano (HRP) | Signalway Antibody (Nanjing) | L30118 | se une específicamente al anticuerpo primario |
| Anticuerpo primario p65 | Bioworld | BS4139 | reconoce específicamente la proteína subunidad NF-κB p65 |
| Espectrofotómetro | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | SCR_018042 |
| Membrana de fluoruro de polímero 0,45 μM | Millipore | PR05509 | adsorbe moléculas de proteínas |
| 1β-hidroxil-5α-cloro-8-epi-xantatina | Chengdu Institute of Biology | compuestos monoméricos naturales | |
| All-in-One cDNA Synthesis SuperMix | Bimake (Shanghai) | B24408 | reverse-transcribe |
| BAY11-7082 | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | SF0011 | IκB/IKK inhibitor |
| Anticuerpo Bcl2 | Signalway Antibody (Nanjing) | 32012 | AB_3751037 |
| Kit de ácido bicinconínico (BCA) | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0010S | cuantificación de proteínas totales |
| Agente CCK-8 | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | C0038 | medición de viabilidad celular |
| Sistema de detección de quimioluminiscencia | Millipore, Bedford, USA | P90720 | adquisición y procesamiento de señales de luminiscencia |
| Anticuerpo COX-2 | Signalway Antibody (Nanjing) | 33345 | AB_3676692 |
| DMSO | Sangon Biotech(Shanghai)Co.,Ltd. | A100231-0500 | solubiliza compuestos |
| Anticuerpo GAPDH | Signalway Antibody (Nanjing) | 41549 | AB_3751036 |
| Instrumento de imagen de gel | E-BLOT | Touch Imager Pro | adquisición y análisis de imágenes |
| Instrumento de PCR de gradiente | Biometra TADVANCED | Biometra Tadvanced 96SG | temperatura de anillado en gradiente |
| Agente Griess | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | S0021S | cuantificación de NO |
| Células HeLa de carcinoma cervical humano | The Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | SCSP-504 | Células de origen humano |
| TNF-α humano | Novus Biologicals | 210-TA | citocinas pro-inflamatorias |
| Anticuerpo iNOS | Signalway Antibody (Nanjing) | 48309 | AB_2943634 |
| Microscopio confocal invertido láser | Olympus | FV1000 | SCR_016840 |
| LPS ( E.coli 055:B5) | Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd | L6529 | establecer modelos inflamatorios |
| Células de macrófagos murinos RAW264.7 | The Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | SCSP-5036 | Células de origen murino |
| Kit de extracción de proteínas nucleares y citoplasmáticas | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0027 | separar proteínas citoplasmáticas y nucleares |
| PD98059 | Selleck Chemicals (Shanghai) | S1177 | inhibidor de MEK |
| Anticuerpo P-ERK (Thr202/Thr185) | Signalway Antibody (Nanjing) | 12548 | detectar el nivel de fosforilación de la proteína ERK |
| Anticuerpo p-IKKα/β (Ser176/Ser177) | Signalway Antibody (Nanjing) | 11931 | AB_3751034 |
| Anticuerpo p-IκBα (phospho-Ser32) | Signalway Antibody (Nanjing) | 13776 | AB_3751033 |
| Anticuerpo p-JNK (T183/T221) | Signalway Antibody (Nanjing) | 13371 | AB_3718662 |
| Anticuerpo p-p38 MAPK (Thr180) | Signalway Antibody (Nanjing) | 11581 | AB_3751032 |
| Kit de ensayo de parámetros de prostaglandina E2 | R&D Systems | KGE004B | AB_2894942 |
| PS1145 | Selleck Chemicals (Shanghai) | S7691 | inhibidor IKK específico |
| Kit de preparación de gel de SDS-PAGE rápido | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0018S | separación de proteínas |
| Sistema de PCR en tiempo real | Bio-Rad | CFX96 | SCR_018064 |
| Tampon RIPA | Bimake (Shanghai) | P0013C | lisis celular |
| SB203580 | Selleck Chemicals (Shanghai) | S1076 | inhibidor de p38 MAPK |
| SP600125 | Selleck Chemicals (Shanghai) | S1460 | inhibidor de JNK |
| SYBR Green | Bimake (Shanghai) | B21202 | Para cuantificación en tiempo real |
| IgG anti-ratón conjugado TRITC | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | A0568 | AB_2893016 |
| Anticuerpo secundario conjugado TRITC | Beijing Baiao Leibo Technology Co., Ltd. | ZN1992 | AB_3751143 |
| Reactivo TRIzol | Invitrogen | 15596026 | aislamiento de ARN total |
| Anticuerpo Vinculina | Signalway Antibody (Nanjing) | 41534 | AB_3751035 |