In Vitro Análisis funcional de células T reguladoras: enfoque en la proliferación y diferenciación

Resumen

Este protocolo proporciona una estrategia de cocultivo in vitro para investigar los efectos de las células T reguladoras sobre la proliferación y diferenciación de las células T efectoras.

Resumen

Las células T reguladoras (Treg) desempeñan un papel clave en el mantenimiento de la homeostasis inmune. Las anomalías en la función de las células Treg están asociadas a diversas enfermedades, incluyendo enfermedades autoinmunes, rechazo de trasplantes de órganos, infecciones y cáncer. La manipulación de células Treg se considera una estrategia terapéutica potencial para tratar enfermedades inflamatorias, incluyendo trastornos autoinmunes, rechazo de trasplantes de órganos sólidos, enfermedad de injerto contra huésped y enfermedades alérgicas. Los ensayos clásicos de supresión de células Treg in vitro evalúan principalmente el efecto inhibitorio de las células Treg sobre la proliferación de células efectoras T (Teff). Sin embargo, además de la proliferación, la diferenciación de células T es importante para que las células T desempeñen sus funciones inmunitarias. Por ello, este protocolo proporciona un ensayo modificado in vitro de supresión de células Treg para investigar los efectos de las células Treg en la proliferación y diferenciación de las células Teff. En este protocolo, primero se introduce la preparación de células Treg de ratón y células T naïf, seguida de la estrategia de cocultivo para estudiar los efectos regulatorios de las células Treg en la proliferación y diferenciación de células Teff, incluidas las células Th1 y Th17, y finalmente se presenta la estrategia de tinción para citometría de flujo tras cocultivo. Este análisis funcional in vitro de las células Treg puede utilizarse para investigar los efectos de las células Treg en la proliferación y polarización de las células T.

Introducción

Las células T reguladoras CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ son mediadores importantes de la homeostasis^{inmune 1}. Las células Treg suprimen activamente respuestas inmunitarias excesivas y mantienen tolerancia a la autoinmunidad, evitando así que las reacciones inmunitarias dañen tejidos y órganos^{normales 2}. La manipulación de células Treg se considera una estrategia terapéutica potencial para tratar enfermedades inflamatorias como trastornos autoinmunes, rechazo de trasplantes de órganos sólidos, enfermedad del injerto contra huésped y enfermedades^{alérgicas 3,4,5}. Mientras tanto, inhibir la función de las células Treg se considera una estrategia eficaz para activar la inmunidad^{antitumoral 6,7}. Estudios clínicos han investigado la terapia adoptiva con células T reguladoras o el tratamiento con baja dosis de IL-2 para trastornos autoinmunes, trasplantes de órganos sólidos y enfermedad injerto contra huésped ^8,9,10. Además, los estudios sobre células Treg modificadas, incluyendo las células Treg del receptor de antígenos quiméricos (CAR) y las células Treg del receptor de células T (TCR), también están ganando cada vez más atención^.

Hasta la fecha, la terapia con células Treg no se ha establecido ampliamente en el tratamiento clínico rutinario. Para apoyar la aplicación clínica de la terapia con células Treg, la investigación sistemática y la evaluación de sus funciones son importantes. Una estrategia común para evaluar las funciones de las células T reguladoras in vitro es el ensayo de supresión Treg in ^{vitro 13}, que puede detectar la función supresora de las células Treg en la proliferación de células efectoras T (Teff). Sin embargo, el ensayo estándar de supresión Treg in vitro no evalúa la diferenciación de las células Teff. Si la proliferación y diferenciación de las células T efectoras pueden evaluarse simultáneamente, se puede obtener más información sobre la función de las células T reguladoras.

Aquí presentamos un ensayo modificado de supresión de células Treg in vitro, denominado "análisis funcional in vitro de células Treg" (Figura 1). Este protocolo proporciona una estrategia de cocultivo in vitro para investigar los efectos de las células Treg en la proliferación y diferenciación de las células Teff.

Protocolo

Todos los experimentos con ratones fueron autorizados por el Comité de Ética Animal del Hospital de China Occidental, Universidad de Sichuan (Aprobación Nº 20250814006, 20211212A). Todos los ratones utilizados en este experimento tenían un fondo genético C57BL/6.

1. Preparación de soluciones

1. Preparar el tampón de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS): 1× PBS que contenga 0,5% de albúmina sérica bovina (BSA).
2. Preparar el tampón de clasificación celular activado magnéticamente (MACS): 1× PBS que contenga 0,5% de BSA y 2 mM de ácido tetraacético etilenediamina (EDTA).
3. Preparar el medio de cultivo celular: medio RPMI 1640 que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS), 1 mM de piruvato sódico, 2 mM de L-glutamina, 10 mM de HEPES, 55 μM β-mercaptoetanol, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina.

2. Preparación de linfocitos de ratón C57BL/6

1. Toma el bazo y los ganglios linfáticos periféricos (LN) de un ratón C57BL/6 de 6–8 semanas (ya sea macho o hembra) en condiciones estériles y colócalos en un tubo centrífugo de 50 mL con 5 mL de tampón FACS.
   NOTA: La disección del bazo y las LN debe realizarse según los procedimientos estándar.
2. Coloca un colador de celda de 70 μm sobre un tubo centrífugo de 50 mL, luego coloca el bazo y las LN sobre el colador, y usa un pistón de jeringuilla de 5 mL para moler suavemente el tejido durante 1 minuto. Durante el moliendo, enjuaga el colador 3 veces con el buffer FACS. Asegúrate de triturar todo el tejido completamente y enjuagar las células en el tubo de la centrífuga. Después de moler, quita el colador.
3. Centrifugar a 4 °C, 350 × g durante 7 minutos.
4. Retira el sobrenadante, vuelve a suspender el pellet celular en 3 mL de tampón de lisis de glóbulos rojos y deja la suspensión a temperatura ambiente durante 3–5 minutos.
5. Inmediatamente añadir buffer FACS al tubo de la centrifugadora a un volumen de 15–20 mL para terminar la lisis, y centrifugar a 4 °C, 350 × g durante 7 minutos.
6. Retira el sobrenadante, añade 10 mL de buffer FACS y vuelve a suspender suavemente el pellet de celda.
7. Toma 10 μL de suspensión celular y utiliza tinción con azul tripánico para contar el total de linfocitos vivos.
   NOTA: Estas células son linfocitos CD45.2⁺ .

3. Preparación de linfocitos de ratón CD45.1

1. Toma el bazo y las LN de un ratón CD45.1 de 6–8 semanas (ya sea macho o hembra) en condiciones estériles y colócalos en un tubo centrífugo de 50 mL con 5 mL de tampón FACS.
2. Prepara los linfocitos del ratón CD45.1 siguiendo los mismos pasos descritos anteriormente.
   NOTA: Estas células son linfocitos CD45.1⁺ .

4. Preparación de células T naïves CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺

NOTA: Todo el proceso utiliza el Kit de Aislamiento de Células T CD4⁺CD62L⁺ para MACS. El buffer MACS está preenfriado a 4 °C, y todas las condiciones de centrifugación son de 4 °C, 350 × g durante 7 minutos.

1. Recoger la suspensión celular de ratones C57BL/6, centrifugar y descartar el sobrenadante, añadir 400 μL de buffer MACS y 100 μL de cóctel de biotina y anticuerpos de células T CD4⁺ al tubo de la centrífuga por cada 1 ×^{10 8} células iniciales totales. Mezcla suavemente y deja incubar a 4 °C durante 5 minutos en la oscuridad.
2. Añadir 300 μL de buffer MACS y 200 μL de microperlas de antibiotina al tubo de la centrifugadora desde el paso 4.1 por 1 ×^{10 8} celdas iniciales totales. Mezcla suavemente y incuba a 4 °C durante 10 minutos en la oscuridad.
3. Añade 10 mL de buffer MACS, centrifuga y desecha el sobrenadante. Resuspende el pellet de celda en 2 mL de búfer MACS.
4. Coloca la columna LS sobre el separador magnético MACS correspondiente. Usa 3 mL de buffer MACS para enjuagar la columna. Espera a que el buffer de la columna se vacíe completamente antes de pasar al siguiente paso.
   NOTA: La capacidad máxima de carga de celdas de la columna LS es de 2 × 10⁹ celdas, incluyendo tanto las celdas positivas como las negativas, y el número máximo de celdas positivas que puede capturar es de 1 × 10⁸. Normalmente, un solo ratón solo requiere una columna de LS aquí.
5. Carga la suspensión de la celda del paso 4.3 sobre la columna LS. Cuando la suspensión de la celda fluye completamente hacia la columna, utiliza 3 mL de buffer MACS para lavar la columna. Recoge todo el líquido de flujo en un tubo centrifugador nuevo de 15 mL.
   NOTA: Estos son el total de células CD4⁺CD25^– T.
6. Centrifugar el total de células CD4⁺CD25^– T obtenidas en el paso 4.5, descartar el sobrenadante y obtener la pastilla celular.
7. Añadir 800 μL de buffer MACS y 200 μL de microperlas CD62L al pellet celular por cada 1 ×^{10 8} células iniciales totales. Mezcla suavemente y incuba a 4 °C durante 10 minutos en la oscuridad.
8. Añadir 10 mL de buffer MACS al tubo de la centrifugadora, centrifugar y descartar el sobrenadante, y volver a suspender el pellet de celda en 500 μL de buffer MACS.
9. Coloca la columna MS sobre el separador magnético MACS correspondiente y usa un buffer MACS de 1 mL para enjuagar la columna.
10. Carga la suspensión de la celda en la columna MS. Cuando la suspensión fluye completamente hacia la columna, utiliza 1 mL de buffer MACS para lavar la columna 2x.
11. Retira la columna MS del separador magnético y colócala sobre un tubo centrifugador nuevo de 15 mL. Añade 1 mL de buffer MACS a la columna y empuja inmediatamente el émbolo con firmeza para eluir las celdas etiquetadas con perlas magnéticas.
12. Cuenta las células, centrifuga y descarta el sobrenadante, vuelve a suspender las células en un volumen adecuado de medio de cultivo y mantén el tubo en hielo.
    NOTA: Estas células son células T naïves CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺ . Normalmente, aproximadamente 8 × 10⁶ a 1 × 10⁷ células T ingenuas CD4⁺CD25^–CD62L⁺ pueden purificarse de un solo ratón; La inclusión de ganglios linfáticos periféricos puede aumentar el rendimiento.
13. Determinar la pureza de las células aisladas: tomar 5 × 10^{células T aisladas CD4+}CD62L⁺ y resuspenderlas en 50 μL de solución de anticuerpos en un tubo centrífuga de 1,5 mL.
    NOTA: Prepara la solución de anticuerpos añadiendo el anticuerpo anti-ratón CD4 PerCP-Cy5.5, el anticuerpo anti-ratón CD62L FITC y el anticuerpo anti-ratón CD25 PE en el buffer FACS en una proporción 1:100.
14. Tras la incubación de 20 minutos a 4 °C en la oscuridad, añade 1 mL de tampón FACS para lavar las células. Centrifugar las celdas, retirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 200 μL de tampón FACS.
15. Detectar la pureza de las muestras mediante citometría de flujo.
    NOTA: Para detalles sobre el análisis del citómetro de flujo, consulte el manual de usuario del instrumento o el protocolo¹⁴ previamente reportado. La pureza de las células T naïves CD4⁺CD25^–CD62L⁺ debería ser superior al 95% en la muestra aislada de células T (Figura 2).

5. Preparación de células enriquecidas con Treg CD45.1^+CD4+CD25⁺ y células no CD4⁺ enriquecidas con antígenos

NOTA: Todo el proceso utiliza el Kit de Aislamiento Regulatorio de Células T CD4⁺CD25⁺ para MACS, y las instrucciones del kit han sido optimizadas para obtener simultáneamente células presentadoras de antígenos (APC) enriquecidas con células no CD4⁺ y células enriquecidas ^{con Treg} CD4⁺CD25+. El buffer MACS está preenfriado a 4 °C, y todas las condiciones de centrifugación son 4 °C, 350 × g durante 7 minutos.

1. Recoger la suspensión de células de ratones CD45.1, centrifugar y descartar el sobrenadante, añadir 400 μL de buffer MACS preenfriado y 100 μL de cóctel regulador de biotina-anticuerpos CD4⁺CD25⁺ al tubo de la centrífuga por cada 1 × 10⁸ células iniciales totales. Mezcla suavemente y incuba a 4 °C durante 10 minutos en la oscuridad.
2. Sin lavado, añadir directamente 380 μL de buffer MACS preenfriado, 200 μL de microperlas de antibiotina y 20 μL de anticuerpo CD25-PE por cada 1 ×^10.8 células iniciales al tubo de la centrífuga del paso 5.1. Mezcla suavemente y incuba a 4 °C durante 15 minutos a oscuras.
3. Añadir 10 mL de buffer MACS al tubo de la centrífuga, centrifugar y descartar el sobrenadante, luego volver a suspender el pellet de celda en 500 μL de buffer MACS por cada 1 ×^{10 8} celdas iniciales totales.
4. Coloca la columna LD sobre el separador magnético MACS correspondiente y enjuaga la columna con 2 mL de buffer MACS. Espera a que el buffer de la columna se vacíe completamente antes de pasar al siguiente paso.
5. Carga lentamente la suspensión de la celda del paso 5.3 sobre la columna LD. Cuando la suspensión de la celda fluya completamente hacia la columna, lava la columna dos veces con un buffer MACS de 2 mL. Recoge todo el líquido de flujo en un tubo centrifugador nuevo de 15 mL.
6. Quita la columna LD del separador magnético y colócala sobre un tubo centrifugador nuevo de 15 mL. Añade 3 mL de buffer MACS a la columna de LD, empuja inmediatamente el émbolo firmemente para expulsar ^{las celdas} no CD4+ marcadas como Microperlas. Cuenta las células, centrifuga, vuelve a suspender las células en un volumen adecuado de medio de cultivo celular para alcanzar una concentración celular de 1 × 10⁷ células/mL, y mantén el tubo en hielo.
   NOTA: Estas células no CD4⁺ consisten principalmente en CPA como macrófagos, células dendríticas y células B. En este protocolo, estas células se utilizan ^{como una} fracción no CD4+ enriquecida con APC.
7. Centrifugar el total de células T CD4⁺ recogidas del paso 5.5, descartar el sobrenadante y obtener la pelota celular.
8. Añadir 900 μL de buffer MACS y 100 μL de microperlas anti-PE al pellet celular por cada 1 ×^{10 8} células iniciales totales. Mezcla suavemente y incuba a 4 °C durante 15 minutos a oscuras.
9. Coloque la columna MS sobre el separador magnético MACS correspondiente y enjuage la columna con 500 μL de buffer MACS preenfriado. Espera a que el buffer de la columna se vacíe completamente antes de pasar al siguiente paso.
10. Carga lentamente la suspensión de la celda desde el paso 5.8 sobre la columna MS. Cuando la suspensión de la celda fluye completamente hacia la columna, lava la columna dos veces con un buffer MACS de 1 mL. Recoge el líquido de flujo en un tubo centrifugador nuevo de 15 mL.
    NOTA: Las células del líquido de flujo en este momento son ^CD4+CD25^– células T.
11. Desconecta la columna MS del separador magnético y colócala sobre un tubo centrifugador nuevo de 15 mL. Añade 1 mL de buffer MACS a la columna y luego presiona rápidamente el émbolo para recuperar las pilas enriquecidas con Treg CD4⁺CD25⁺ marcadas con perlas magnéticas.
12. Después de contar las celdas, centrifugar la suspensión y retirar el sobrenadante. Resuspende el pellet en suficiente medio de cultivo para obtener una concentración final de 2 × 10⁶ células/mL, y mantén el tubo en hielo.
    NOTA: Estas células son células enriquecidas con Treg CD45.1⁺CD4^+CD25+. Normalmente, aproximadamente 8 × 10⁵ a 1 × 10 6 celdas^CD4+CD25⁺ pueden purificarse de un solo ratón; La inclusión de ganglios linfáticos periféricos puede aumentar el rendimiento.
13. Determinar la pureza de las células aisladas enriquecidas con Treg ^CD4+CD25+: tomar 5 × 10⁴ células aisladas CD4⁺CD25⁺ enriquecidas con Treg y 5 ×^{10 4} células no CD4⁺ enriquecidas con APC aisladas, respectivamente, y resuspenderlas en 50 μL de solución de anticuerpos.
    NOTA: Prepara la solución de anticuerpos añadiendo el anticuerpo anti-ratón CD4 PerCP-Cy5.5 y el anticuerpo anti-ratón CD25 PE en el buffer FACS en una proporción 1:100. Utiliza el mismo anticuerpo anti-ratón CD25 PE aquí para confirmar que las células CD4⁺CD25⁺ están adecuadamente marcadas y que no hay células T CD4⁺CD25⁺ en la fracción no CD4⁺ . Para una identificación más estricta de las células Treg, también se puede realizar tinción intracelular con un anticuerpo anti-ratón Foxp3 PB.
14. Tras la incubación de 20 minutos a 4 °C en la oscuridad, añade 2 mL de tampón FACS para lavar las células. Centrifugar las celdas, retirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 200 μL de tampón FACS.
15. Detectar la pureza de las muestras mediante citometría de flujo.
    NOTA: La frecuencia de las células CD4⁺CD25⁺ debe ser ≥ 95% para asegurar que la pureza de la población celular enriquecida con Treg cumpla con los requisitos experimentales (Figura 2). Las células no CD4⁺ utilizadas como fracción enriquecida con APC no deben contener más del 5% de células T CD4⁺ (Figura 2).

6. Marcado de células T CD4⁺ naïves con tinte de proliferación celular

NOTA: Todas las condiciones de centrifugación son 4 °C, 350 × g durante 7 minutos. El buffer PBS se preequilibra a temperatura ambiente antes de su uso. El proceso de etiquetado se realiza bajo protección ligera para evitar el temple con tinte.

1. Toma la ingenua suspensión de células T CD4⁺ , centrifuga, descarta el sobrenadante y obtén la pastilla de celdas.
2. Diluir el tinte de proliferación celular eFluor 450 en PBS para obtener una concentración de 20 μM a temperatura ambiente.
3. Añade 0,5 mL de PBS por cada 1 × 10⁷ celdas. Mantén el tubo inclinado aproximadamente a 45° y vuelve a suspender suavemente las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo 50 veces.
4. Añade rápidamente un volumen igual de solución de colorante de proliferación celular en la suspensión celular, de modo que la concentración final del tinte de proliferación sea de 10 μM. Mantén el tubo inclinado aproximadamente a 45° y mezcla las células pipeteando arriba y abajo 50 veces para asegurar el contacto completo entre las células y el tinte de proliferación celular.
5. Envuelve inmediatamente el tubo de la centrífuga con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz. Incuba a temperatura ambiente durante 20 minutos. Haz un vórtice suave entre las células cada 5 minutos para evitar la agregación celular.
6. Añade 10 mL de medio de cultivo celular preenfriado al tubo de la centrífuga, haz un vórtice suave para terminar la tinción, luego centrifuga y descarta el sobrenadante.
7. Añade 5 mL de medio de cultivo celular preenfriado al pellet celular, centrifuga y descarta el sobrenadante para lavar las células.
8. Añade 5 mL de medio de cultivo celular preenfriado al pellet celular y vuelve a suspender las celdas.
9. Contar las células, centrifugar y descartar el sobrenadante, volver a suspender las células en un volumen adecuado de medio de cultivo para alcanzar una concentración celular de 2 × 10⁶ células/mL, y mantener el tubo en hielo.

7. Establecimiento del análisis funcional in vitro de células Treg

1. Calcular el número de muestras necesarias para el cultivo celular, preparar una cantidad adecuada de medio de cultivo celular que contenga 2,5 μg/mL anticuerpo anti-ratón CD3 o las citocinas de inducción indicadas, y vórtice suavemente las células T naïves CD45,2⁺CD4⁺CD62L⁺ preparadas, las células T CD45,1^+CD4+CD25⁺ enriquecidas con Treg y las células no CD4⁺ enriquecidas con APC.
   NOTA: Utilizar células T naïves CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺ como células T respondedoras (Tresp). Este experimento de ejemplo estudia el efecto de las células Treg en la diferenciación y proliferación de las células Th1 y Th17. Por lo tanto, hay un total de cuatro muestras para el cultivo celular: células Tresp cultivadas bajo condiciones de inducción Th1 o Th17, en ausencia o presencia de células enriquecidas con Treg.
2. Añadir 100 μL de CD45.2⁺CD4⁺ células T naïves (2 × 10 celdas^{de 5} por pozo) a la placa de 48 pozos.
3. Añadir 100 μL ^{de celdas} no CD4+ enriquecidas ^{con APC} CD45.1+ (1 × 10⁶ celdas por pozo) a la placa de 48 pozos.
4. Añadir 100 μL de células enriquecidas con Treg CD45,1⁺CD4⁺CD25⁺ (2 × 10 celdas^{de 5} por pozo) a los pozos experimentales y añadir 100 μL de medio de cultivo celular a los pozos de control. La relación célula enriquecida con Treg:Tresp en las muestras experimentales es de 1:1.
   NOTA: La proporción de celdas Treg a celdas Tresp puede establecerse según sea necesario, o diseñar un panel de múltiples proporciones. El número de células Tresp está fijado en el cocultivo, mientras que el número de células Treg puede cambiarse según sea necesario. Normalmente, las proporciones de Treg a Tresp en las muestras experimentales incluyen 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 y 0:1. Además, cada condición experimental puede prepararse en triplicado para minimizar el error experimental aleatorio. Aquí, para mayor claridad, basándose en la experiencia previa^{de investigación 15,16}, se utiliza una proporción 1:1 como ejemplo.
5. Añadir 100 μL de medio de cultivo celular que contenga 2,5 μg/mL de anticuerpo anti-ratón CD3 a cada pozo.
   NOTA: La concentración final de anticuerpo anti-ratón CD3 es de 0,5 μg/mL. Además de las muestras experimentales, se coloca una muestra de control en blanco sin anticuerpo anti-ratón CD3. En esta muestra, añade 100 μL de medio de cultivo de células T sin anticuerpo anti-ratón CD3 para determinar la intensidad de fluorescencia de las células T no proliferadas, o la intensidad del pico 0. Esto permite calibrar con precisión la distribución de proliferación.
6. Añadir 100 μL de medio de cultivo celular que contiene las citocinas indicadas a cada pozo para que el volumen final de cada pozo sea de 500 μL.
   NOTA: En este experimento, se utiliza IL-12 recombinante de ratón p70 a una concentración final de 10 ng/mL para inducir células Th1, y TGF-β1 humano recombinante a una concentración final de 2 ng/mL y IL-6 recombinante de ratón a 50 ng/mL se utilizan para inducir células Th17.
7. Añadir PBS a los pozos vacíos restantes (500 μL/pozo) para mantener la humedad de la placa y reducir los efectos de borde.
8. Incubar la placa de 48 pozos en una incubadora al 5% de CO₂ a 37 °C durante 3 días.
   NOTA: En este sistema de cocultivo, el anticuerpo soluble anti-ratón CD3 proporciona la señal primaria del receptor de células T (TCR) para la activación de las células T, y las células no CD4⁺ enriquecidas con APC proporcionan señales coestimulatorias para activar completamente las células T. Las señales TCR y coestimuladoras también pueden ser activadas por anticuerpos anti-ratón recubiertos en placa CD3 y anticuerpo soluble anti-ratón CD28. Los investigadores pueden elegir el método de estimulación según sea necesario.

8. Análisis funcional in vitro de células Treg

NOTA: Todas las condiciones de centrifugación son 4 °C, 350 × g durante 7 minutos.

1. Pipete suavemente las células cultivadas para resuspenderlas y transfiere la suspensión a un tubo centrífugo de 1,5 mL. Centrifuga las células y elimina el sobrenadante.
2. Añadir 500 μL de medio de cultivo celular que contiene 5 ng/mL de PMA, 1 μg/mL ionomicina y un inhibidor de transporte proteico GolgiPlug diluido 1:1.000 a cada tubo, hacer un vórtice suave para resuspender las células e incubarlas en una incubadora de 5% de_CO2 a 37 °C durante 3 horas.
3. Centrifugar, descartar el sobrenadante, añadir 50 μL de PBS que contenga una prueba de tinte Zombie Yellow y anticuerpo anti-ratón diluido 1:100 CD16/32 a cada muestra, vórtice e incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 15 minutos para marcar las células muertas y bloquear los receptores Fc.
4. Centrifugar, descartar el sobrenadante, añadir 50 μL de cóctel de anticuerpos superficiales, vórtice e incubar a 4 °C en la oscuridad durante 20 minutos.
   NOTA: Añadir anticuerpo anti-CD4 PerCP-Cy5.5, anticuerpo anti-CD45.1 FITC y anticuerpo anti-CD45.2 APC-eFluor 780 al buffer FACS en una proporción 1:200 para preparar el cóctel de anticuerpos superficial.
5. Añade 1 mL de buffer FACS a cada tubo de centrífuga, centrífuga y descarta el sobrenadante.
6. Añadir 300 μL de solución de fijación y permeabilización a cada tubo de centrifugadora, vórtice e incubar a 4 °C en la oscuridad durante 20 minutos.
7. Añadir 1 mL de 1× de tampón de permeabilización/lavado (Perm/Wash) a cada tubo de centrífuga, centrífuga y descartar el sobrenadante; Luego repite este paso de lavado una vez para asegurar la eliminación completa del fijador residual.
8. Añade 50 μL de cóctel de anticuerpos de citocinas, vórtice e incuba a 4 °C en la oscuridad durante 40 minutos.
   NOTA: Añadir anticuerpo anti-IFN-γ PE y anticuerpo anti-IL-17A PE-Cy7 al tampón Perm/Wash en una proporción 1:100 para preparar el cóctel de anticuerpos citoquinas.
9. Lava cada muestra con 1 mL de tampón de Perm/Wash, centrifuga las celdas y elimina el sobrenadante. Resuspende el pellet en 300 μL de tampón FACS.
10. Mide la proliferación y diferenciación de las células Tresp mediante citometría de flujo. Utilizar la siguiente estrategia de control (Figura 3): primero, bloquear la población de linfocitos entre las células totales y excluir los residuos celulares e impurezas; segundo, bloquear la población unicelular entre los linfocitos basándose en señales de dispersión; tercero, limitar la población de células vivas entre las células individuales; cuarto, encerrar la población de células T CD4⁺ entre las células vivas; en quinto lugar, controlar la población celular enriquecida con Treg en CD45.1⁺ y la población de células Teff CD45.2⁺ entre las células T CD4⁺ ; sexto, las células CD45.2⁺CD4⁺IFN-γ⁺ Th1, las células CD45.2⁺CD4⁺IL-17A⁺ Th17 y las células T CD45.2⁺CD4⁺ no proliferadas entre las células T CD45.2⁺ .
11. Realizar la adquisición de datos de citometría de flujo y analizar los datos de citometría de flujo.
    1. Utiliza linfocitos T cultivados marcados con el tinte de proliferación celular eFluor 450 como el tinte de proliferación celular con un solo colorante. Prepara el tinte Zombie Yellow con control de tinción única con células T cultivadas que no hayan sido marcadas con tinte de proliferación celular. Prepara los otros controles de tinción única con perlas de compensación para cada fluoróforo utilizado.
    2. Utiliza células T marcadas con el colorante de proliferación celular eFluor 450 y cultivadas sin anticuerpo anti-ratón CD3 para definir la compuerta de las células no proliferadas.
    3. Utiliza células T cultivadas marcadas con tinte de proliferación celular y teñidas con tinte Zombie Yellow, anticuerpos de superficie celular y controles isotípicos del anticuerpo anti-ratón IFN-γ PE y anticuerpo anti-ratón IL-17A PE-Cy7 para definir compuertas de las células T IFN-γ⁺CD4⁺ e IL-17A⁺CD4⁺ .

Resultados

En el experimento representativo, se utilizaron células T naïves como células Tresp para investigar los efectos de las células enriquecidas con Treg en la proliferación y diferenciación de células Th1 y Th17. En este experimento, las células Tresp fueron activadas por células CD3 anti-ratón y células no CD4⁺ enriquecidas con APC, y luego se diferenciaron en células Th1 bajo inducción de IL-12 p70 o en células Th17 bajo inducción TGF-β1 e IL-6. Bajo estas dos condiciones de inducción, se estudiaron cambios en l...

Discusión

En este estudio, los resultados del cocultivo bajo condiciones de inducción Th1 son consistentes con informes previos que indican que las células Treg pueden suprimir la proliferación y diferenciación de células^{Th1 17,18}. Las células enriquecidas con Treg también inhibieron la proliferación de células Tresp bajo condiciones de inducción Th17. Sin embargo, bajo las condiciones polarizadoras Th17 utilizadas aquí, la frecuencia de l...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1.5 mL centrifuge tube	Thermo Fisher Scientific	3457IW	o equivalente
12.5 μL Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94420043	o equivalente
1250 μL Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94420813	o equivalente
15 mL Conical Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339650	o equivalente
200 μL Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94420318	o equivalente
48-well plates	Corning Incorporated	3548	o equivalente
5 mL syringe piston	Shifeng Medical	SB2-061(A)	o equivalente
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339652	o equivalente
50 μL Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94420258	o equivalente
70 μm cell strainer	Biosharp Life Sciences	BS-70-CS	o equivalente
Anti-mouse CD28 antibody	BioXcell	BE0015-1	o equivalente
Anti-mouse CD3 antibody	BioXcell	BE0001-1	o equivalente
Anti-mouse CD4 PerCP-Cy5.5 (RM4-5)	Thermo Fisher Scientific	45-0042-82	o equivalente
Anti-mouse Foxp3 PB (FJK-16s)	Thermo Fisher Scientific	48-5773-82	o equivalente
Anti-mouse IFN-gamma PE (XMG1.2)	BioLegend	505808	o equivalente
Anti-mouse IL-17A PE-Cy7 (eBio17B7)	Thermo Fisher Scientific	25-7177-82	o equivalente
Beckman CytoFLEX S Flow Cytometer	Beckman Coulter	N/A	para adquisición de datos citometria de flujo de muestras de células inmunes
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	B2064	o equivalente
C57BL/6 mice	Shanghai Model Organisms Center, Inc	SM-001	para el aislamiento de linfocitos primarios y subconjuntos de células T
CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE	Thermo Fisher Scientific	12-0251-83	o equivalente
CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse	Miltenyi Biotec	130-091-041	para clasificación celular
CD4+CD62L+ T Cell Isolation Kit, mouse	Miltenyi Biotec	130-106-643	para clasificación celular
CD45.1 mice	Shanghai Model Organisms Center, Inc	NM-KI-210226	para el aislamiento de linfocitos primarios y subconjuntos de células T
CD45.1 Monoclonal Antibody (A20), FITC	Thermo Fisher Scientific	11-0453-85	o equivalente
CD45.2 Monoclonal Antibody (104), APC-eFluor 780	Thermo Fisher Scientific	47-0454-82	o equivalente
CD62L (L-Selectin) Monoclonal Antibody (MEL-14), FITC	Thermo Fisher Scientific	11-0621-85	o equivalente
Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit	BD Biosciences	554714	o equivalente
eBioscience Cell Proliferation Dye eFluor 450	Thermo Fisher Scientific	65-0842-90	o equivalente
ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)	Solarbio Life Sciences	E1170	o equivalente
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	A5669701	o equivalente
FlowJo 10.6.2	BD Biosciences	N/A	software para análisis de datos citometria de flujo
Golgi-Plug Protein Transport Inhibitor	BD Biosciences	555029	o equivalente
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	15630080	o equivalente
Human TGF-beta1	PEPROTECH	100-21C	o equivalente
Ionomycin calcium salt	Millipore Sigma	I3909	o equivalente
LD Columns	Miltenyi Biotec	130-042-901	para clasificación celular
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Fisher Scientific	25030081	o equivalente
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	para clasificación celular
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	para clasificación celular
MS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-201	para clasificación celular
OctoMACS Separators	Miltenyi Biotec	130-042-109	para clasificación celular
PBS, pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010049	o equivalente
PE Rat IgG1, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400408	o equivalente
PE/Cyanine7 Rat IgG2a kappa Isotype Control Antibody	Thermo Fisher Scientific	25-4321-82	o equivalente
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	o equivalente
PMA	Millipore Sigma	P8139	o equivalente
Purified anti-mouse CD16/32 Antibody	BioLegend	101302	o equivalente
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976	para clasificación celular
Recombinant mouse IL-12 p70	PEPROTECH	210-12	o equivalente
Recombinant Mouse IL-6	R&D Systems	406-ML	o equivalente
Red Blood Cell Lysis Buffer (ACK Lysing Buffer)	Thermo Fisher Scientific	A1049201	o equivalente
RPMI 1640 medium	Thermo Fisher Scientific	11875093	o equivalente
Sodium Pyruvate (100 mM)	Thermo Fisher Scientific	11360070	o equivalente
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250061	o equivalente
UltraComp eBeads Compensation Beads	Thermo Fisher Scientific	01-2222-42	o equivalente
Zombie Yellow Fixable Viability Kit	BioLegend	423104	o equivalente
β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148	o equivalente