Imagen en tiempo real de dos fotones del metabolismo endotelial del NAD+ en ratones

Resumen

Este protocolo permite el monitoreo en tiempo real del metabolismo endotelial de la nicotinamida adenina dinucleótido cerebral en ratones vivos mediante expresión de biosensores dirigidos a endoteliales, preparación de ventanas craneales e imagen de dos fotones.

Resumen

Presentamos un flujo de trabajo reproducible para la visualización en tiempo real de las respuestas biosensoriales-canal de nicotinamida adenina dinucleótido (^NAD+) en células endoteliales microvasculares cerebrales en ratones vivos, utilizando microscopía de ventana craneal de dos fotones y un sensor fluorescente de ^NAD+ dirigido a endotelial. El protocolo incluye (1) expresión selectiva del sensor NAD⁺ mediada por virus adeno asociado (AAV) en endotelio cerebrovascular usando AAV-X1.1 bajo el promotor Cdh5 (cadherina endotelial vascular), (2) preparación quirúrgica de una ventana craneal cortical estable de 3 mm × 3 mm, y (3) imagen de dos fotones de doble longitud de onda para capturar simultáneamente la señal verde del canal sensor excitada a 920 nm y la tetrametilrodamina intravascular (TMR)–dextrán excitada a 1040 nm canal de referencia. El canal TMR–dextrano proporciona una referencia de luz vascular y apoya la selección de vasos, la evaluación de movimiento y la evaluación de integridad vascular. Como ejemplo de aplicación, describimos los cambios asociados a la nicotinamida mononucleótida en la fluorescencia del canal sensor endotelial tras la toma de agua potable, la vía oral o la administración intravenosa. Este protocolo enfatiza pasos críticos, consideraciones recomendadas de dosificación viral y título, resolución de problemas y estrategias de análisis cuantitativo, permitiendo a los laboratorios implementar monitorización in vivo de la dinámica cerebrovascular ^NAD+ biosensor-canal para estudios de neurometabolismo en salud y enfermedad. 

Introducción

El nicotinamida adenina dinucleótido (NAD⁺) es un cofactor central para el equilibrio redox, la actividad mitocondrial, la reparación del ADN y la señalización sensible al estrés. En la vasculatura cerebral, la homeostasis endotelial ^NAD+ se reconoce cada vez más como un regulador activo de la integridad de la barrera, el tono vascular y el acoplamiento neurovascular, en lugar de una lectura metabólica^{pasiva 1}. La alteración del metabolismo endotelial del ^NAD+ se ha relacionado con fugas de barrera hematoencefálica (BBB) asociadas al envejecimiento y con una homeostasis neurovascular deteriorada, lo que pone de manifiesto en la necesidad de métodos que puedan resolver directamente la dinámica metabólica endotelial en tejido cerebral^{vivo 2}.

La mayoría de los enfoques actualmente utilizados para cuantificar ^NAD+ se basan en mediciones bioquímicas de los puntos finales, tinción de tejido fijo o lecturas de sensores ex vivo. Aunque informativos, estos enfoques no preservan la arquitectura microvascular intacta, no pueden distinguir fácilmente los cambios rápidos dentro del animal a lo largo del tiempo y proporcionan una especificidad limitada de tipo celular cuando se aplican a tejido cerebral heterogéneo. En cambio, la imagen crónica de dos fotones con ventana craneal permite la visualización repetida de microvasos corticales en ratones vivos con alta resolución espacial y temporal, lo que la hace muy adecuada para monitorizar señales endoteliales metabólicamente sensibles bajo intervenciones fisiológicas o farmacológicas^{definidas 3,4,5}.

El objetivo general de este protocolo es proporcionar un flujo de trabajo integral para el monitoreo en tiempo real de la dinámica de NAD⁺ endotelial cerebral in vivo. El método combina la administración sistémica de un sensor ^NAD+ basado en proteína fluorescente verde mejorada (eGFP) dirigido a endotelial, empaquetado en el virus adenoasociado (AAV)-X1.1 y accionado por el promotor Cdh5, una ventana craneal estable de 3 mm × 3 mm para acceso óptico ^6,7,8, e imagen de dos fotones de doble longitud de onda con un canal de referencia intravascular tetrametilrodamina (TMR)–^{dextrán 1}. El mecanismo del sensor ha sido aclarado de la siguiente manera: Cambronne et al. El biosensor citoplasmático ^NAD+ LigA-cpVenus es un sensor basado en cpVenus de respuesta inversa. La unión a ^NAD+ reduce la fluorescencia similar a cpVenus/eGFP en la lectura estándar de excitación de 488 nm, mientras que un canal de excitación de 405 nm sirve como referencia para la normalización ratiométrica. Por lo tanto, la fluorescencia verde pura no debe interpretarse como una medida positiva directa de la concentración de NAD⁺. En esta implementación de dos fotones, se utiliza excitación de 920 nm para adquirir la señal verde del canal sensor, mientras que la excitación de 1040 nm se usa para el canal de referencia vascular TMR–dextrán; Por tanto, la adquisición actual de 920/1040 nm no es equivalente a una medición ratiométrica calibrada de 488/405 nm. El biosensor de Cambronne et al. fue seleccionado porque ha sido ampliamente validado para monitorizar la dinámica intracelular de ^NAD+ y es compatible con la configuración actual de imagen de doble longitud de onda. Aunque indicadores más recientes como FiNad ofrecen enfoques alternativos para monitorizar la dinámica de NAD⁺, su implementación requeriría modificar el canal de fluorescencia rojo actualmente utilizado para el marcaje de referencia vascular TMR–dextran. El sensor de Cambronne informa de cambios relativos en la disponibilidad de ^NAD+ dentro de un rango dinámico finito y ha sido validado en aplicaciones celulares y subcelulares; sin embargo, la interpretación de la señal puede estar influida por el nivel de expresión, el pH, el fotoblanqueo y la variabilidad del camino óptico, y la cuantificación absoluta de ^NAD+ requiere calibración o validación bioquímica ortogonal. Se seleccionó AAV-X1.1 porque se ha informado que variantes endoteliales-trópicas de AAV transducen eficazmente la vascularización del sistema nervioso^{central 6,7}. En nuestra comparación preliminar de varios serotipos AAV, incluyendo AAV9, AAV-BR1, AAV-ENT y AAV-X1.1, utilizando la expresión mejorada de proteínas fluorescentes verdes impulsadas por CAG o Cdh5 como reportero, AAV-X1.1 produjo el patrón de expresión asociado vascular más favorable entre los serotipos probados. El promotor Cdh5 se utilizó posteriormente para restringir aún más la expresión de transgenes a células endoteliales vasculares, coherente con informes previos que demostraban expresión de transgenes endoteliales selectivos in vivo⁶.

En comparación con los ensayos ex vivo con ^NAD+, este enfoque preserva la red vascular intacta, permite mediciones longitudinales en el mismo animal y permite la evaluación simultánea de señales metabólicas endoteliales y una referencia de luz vascular. El flujo de trabajo es especialmente útil para estudios sobre envejecimiento, estrés inflamatorio, disfunción de la BBB y respuestas rápidas a intervenciones metabólicas como la administración de mononucleótidos de nicotinamida (^NMN) 9,10,11,12,13. Este método es más adecuado cuando la pregunta experimental requiere la visualización repetida de microvasos corticales en ratones vivos y cambios relativos en la señal del canal sensor endotelial. Es menos adecuado para la cuantificación absoluta de ^NAD+ sin calibración ratiométrica adicional o validación bioquímica. Las limitaciones prácticas incluyen la accesibilidad óptica cortical, las limitaciones de profundidad de imagen, la dependencia de una transducción endotelial de AAV exitosa, la posible inflamación asociada a la ventana craneal y la necesidad de un microscopio de dos fotones de doble longitud de onda. La implantación crónica de la ventana craneal puede inducir inflamación local, reactividad vascular, gliosis, opacidad o remodelación tisular, todo lo cual puede influir en la fisiología endotelial y en las mediciones del canal^{sensorial 1,3,4}. Para minimizar estos factores de confusión, el protocolo requiere cirugía aséptica, perforación intermitente con enfriamiento frecuente, hemostasia cuidadosa, evitación del contacto adhesivo con la duramadremadre, analgesia postoperatoria, monitorización diaria y exclusión de animales con opacidad persistente, residuos inflamatorios, infecciones, morfología vascular inestable o baja estabilidad de la señal basal.

Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Ciencias de la Salud y la Rehabilitación bajo el proyecto titulado "Estudio mecanicista de la observación basada en sondas metabólicas de la integridad de la barrera hematoencefálica" (número de aprobación KFDX: NO. 2023-1023). Realizar todas las cirugías en condiciones asépticas y proporcionar analgesia perioperatoria y cuidados de apoyo según el protocolo animal aprobado. En el flujo de trabajo representativo, administrar buprenorfina cloruro (0,05–0,1 mg/kg, subcutáneo) antes o inmediatamente después de la cirugía y luego cada 8–12 horas durante 24–48 horas según sea necesario. Recupera ratones en una jaula calentada y vigílalos hasta que se restablezca la postura normal, el movimiento espontáneo y la respiración estable.

1. Visión general experimental

1. Utiliza ratones adultos C57BL/6J de entre 10 y 12 semanas y con un peso de 23 a 25 g para los experimentos representativos.
2. Mantener a los ratones bajo condiciones específicas libres de patógenos con un ciclo de luz y oscuridad de 12 horas, una temperatura ambiente de 22°C a 24°C, una humedad relativa del 40%–60% y acceso improvisado a alimentos y agua.
3. Aclimata a los animales al menos 7 días antes de los procedimientos.
4. Utiliza cualquiera de los dos sexos según corresponda al diseño experimental. Informa sobre el sexo, el número de animales y la asignación de grupos para cada experimento. El conjunto de datos representativo de imágenes mostrado aquí utilizó N = 3 ratones.
5. Administrar primero el VA sistémico y permitir un periodo de expresión de 3–4 semanas antes de la imagen.
6. Realizar cirugía de ventana craneal entre 3 y 5 días antes de la imagen.
7. Anestesiar ratones el día de la imagen, inyectar TMR–dextrano por vía intravenosa y realizar imágenes tras una circulación adecuada de trazadores.
8. Administrar NMN según el calendario de intervenciones seleccionado. Proporcionar suplementación con agua potable durante 5 días antes de la imagen, realizar la masa oral en el intervalo predeterminado antes de la imagen, o administrar NMN intravenoso durante la sesión de imagen tras la adquisición del punto basal.
   NOTA: Pausa el protocolo tras la administración de AAV durante el periodo de expresión de 3–4 semanas y mantén a los animales bajo monitorización rutinaria de la salud y condiciones estándar de alojamiento. Pausa el protocolo tras la cirugía de ventana craneal durante el periodo de recuperación de 3 a 5 días. Antes de proceder con la imagen, confirma un peso corporal estable, un cuidado y actividad normales, ausencia de infección o inflamación excesiva, y una ventana craneal clara.

2. Cirugía craneal de ventana para imagen cortical longitudinal

1. Preparación prequirúrgica
   1. Esteriliza todos los instrumentos quirúrgicos y establece un campo estéril antes de la inducción de la anestesia.
   2. Configura el sistema de calefacción homeotérmica para mantener la temperatura corporal entre 36,5°C y 37,5°C, preferiblemente utilizando un controlador de retroalimentación de sonda rectal.
   3. Preparar el equipo de monitorización respiratoria y confirmar la estabilidad de la operación antes de la cirugía.
   4. Prepara solución salina estéril, muestras absorbentes, materiales hemostáticos, una cubierta de cristal estéril No. 1.5, una placa metálica y cemento dental antes de comenzar el procedimiento.
   5. Utiliza una cubierta de cristal estéril No. 1.5 del tamaño para cubrir completamente la ventana craneal de 3 mm × 3 mm y acogerla bien sobre el borde del cráneo.
   6. Prepara un microtaladro de alta velocidad equipado con una muela de 0,5–1,0 mm.
   7. Operar la perforadora a aproximadamente la mitad de la velocidad máxima y confirmar que el riego estéril con solución salina puede aplicarse inmediatamente durante el adelgazamiento del cráneo.
   8. Aplica solución fisiológica estéril a temperatura ambiente con un hisopo de algodón o cuentagotas durante el taladro para enfriar el cráneo y eliminar el polvo óseo.
2. Anestesia, preparación del cuero cabelludo y exposición del cráneo
   1. Anestesiar ratones con una solución de trabajo de Avertin recién preparada (1,25%, 12,5 mg/mL) mediante inyección intraperitoneal a 200–250 mg/kg.
      1. Preparar la solución de trabajo de Avertin a partir de 2,2,2-tribromoetanol y 2-metil-2-butanol según los procedimientos operativos estándar institucionales, proteger la solución de la luz y descartar las preparaciones que muestren precipitación o decoloración.
   2. Confirmar un plano quirúrgico estable mediante la pérdida del reflejo de retirada del pedal y la respiración estable.
   3. Aplica pomada oftálmica en ambos ojos inmediatamente después de la inducción de la anestesia.
   4. Si se utiliza anestesia inhalada, inducir anestesia con isoflurano al 3%–4%.
   5. Mantener la anestesia con isoflurano al 1%–2% en oxígeno a 0,5–1,0 L/min y ajustarse según la respiración y los reflejos.
      PRECAUCIÓN: Manejar los agentes anestésicos según los procedimientos de seguridad institucionales y utilizar sistemas adecuados de recogida al administrar anestesia inhalada.
   6. Fija el ratón en un marco estererotáxico o un soporte para cabezas personalizado que proporcione acceso estable al cráneo dorsal.
   7. Mantener la temperatura corporal entre 36,5°C y 37,5°C utilizando una almohadilla térmica controlada por retroalimentación y una sonda rectal cuando esté disponible.
   8. Afeita el cuero cabelludo y elimina el pelo suelto del campo quirúrgico.
   9. Desinfecta el cuero cabelludo usando solución alterna de povidona-yodo o iodóforo y etanol al 70% durante tres ciclos.
   10. Evita permitir que el desinfectante entre en los ojos o en la abertura craneal.
   11. Haz una incisión en la línea media del cuero cabelludo y retrae suavemente la piel.
   12. Exponer el cráneo lo suficiente para permitir tanto la creación de la ventana craneal como la fijación de la placa frontal.
   13. Elimina el periosteo y el tejido conectivo residual usando pinzas finas o una hoja de bisturí.
   14. Seca el cráneo suavemente con hisopos de algodón estériles durante aproximadamente 10–20 segundos hasta que la superficie parezca mate en lugar de húmeda.
   15. Evita una deshidratación excesiva del tejido expuesto.
3. Marcando una craneotomía de 3 mm × 3 mm
   1. Identificar bregma y lambda bajo el microscopio quirúrgico.
   2. Utiliza estos puntos anatómicos para orientar la línea media y dirigir la región cortical.
   3. Marque un cuadrado de 3 mm × 3 mm sobre un hemisferio de la corteza somatosensorial dorsal.
   4. Colocar el borde anterior aproximadamente 0,5 mm posterior al bregma y el borde medial aproximadamente 1,0 mm lateral a la línea media.
   5. Evita suturas importantes de cráneo y vasos superficiales grandes siempre que sea posible.
4. Perforación y extracción de colgajo óseo
   1. Afina el cráneo a lo largo del perímetro marcado usando contacto intermitente con taladro en lugar de presión continua.
   2. Aplica solución salina estéril repetidamente durante la perforación para evitar lesiones térmicas.
   3. Administra aproximadamente entre 20 y 50 μL de solución salina estéril por aplicación, o suficiente para mantener la superficie del cráneo húmeda y fresca.
   4. Repita el riego cada 10–20 segundos o siempre que se acumule polvo óseo o se sospeche acumulación de calor.
   5. Sigue adelgazando hasta que el hueso se vuelve uniformemente translúcido y ligeramente flexible.
   6. Confirmar adelgazamiento adecuado observando vasos durales visibles, pulsación dural preservada y ausencia de compresión cortical o decoloración térmica.
   7. Deja de perforar inmediatamente si se produce una acumulación excesiva de calor, sangrado o disminución de la pulsación dural.
   8. Riega la zona y reevalúa antes de continuar.
   9. Levanta suavemente el colgajo óseo de una esquina usando pinzas finas o una punta de aguja.
   10. Vuelve a afinar el perímetro si queda resistencia.
   11. Conserva la dura madre intacta durante la extracción del colgajo ósea.
   12. Enjuaga el polvo de hueso usando solución salina estéril.
   13. Controla el sangrado leve usando riego suave con suero fisiológico y hisopos absorbentes.
   14. Considera aceptable el sangrado si se resuelve en 1–2 minutos tras la irrigación y el contacto con el hisopo absorbente.
   15. Excluye al animal o termina el procedimiento si el sangrado persiste más de aproximadamente 5 minutos.
   16. Excluir al animal o terminar el procedimiento si la duramadre está desgarrada, se produce compresión cortical o la sangre obstruye la zona de imagen.
       NOTA: El procedimiento puede pausarse temporalmente tras la hemostasia completa y antes de la colocación del abrigo de la cubierta. Mantenga la duramadre expuesta en estado húmedo utilizando solución salina estéril y reanude solo después de confirmar la ausencia de sangrado activo.
5. Sellado de ventanas y fijación de la placa frontal
   1. Confirma que la duramadre expuesta está limpia, húmeda y libre de sangrado activo.
   2. Coloca un abrigo estéril sobre la craneotomía.
   3. Coloca la cubierta en el borde del cráneo que rodea la craneotomía sin comprimir la duraduramadre.
   4. Verifica la posición correcta confirmando una superficie de cobertura al rasgón, la ausencia de burbujas de aire atrapadas, la preservación de la pulsación dural y un camino óptico claro.
   5. Prepara cemento dental o adhesivo tipo C&B Super-Bond según las instrucciones del fabricante.
      1. Para la preparación representativa Super-Bond C&B, mezcla 1 cuchara de polvo con 1 gota de catalizador y 4 gotas de monómero en una bandeja cerámica preenfriada mantenida a aproximadamente −20°C justo antes de la aplicación.
   6. Aplica adhesivo solo alrededor del borde exterior del cráneo que rodea la cubierta.
   7. Evita el contacto adhesivo con la duramadre y evita que la mecha capilar se recue bajo el cristal.
   8. Deja que el adhesivo se endurezca durante aproximadamente 5–10 minutos a temperatura ambiente.
      PRECAUCIÓN: El cemento dental y los componentes adhesivos pueden contener sustancias químicas volátiles o irritantes. Manejalos según los procedimientos de seguridad institucionales y utiliza una ventilación adecuada.
   9. Coloca una placa de titanio personalizada alrededor de la ventana craneal.
   10. Utiliza una placa frontal con una abertura central de aproximadamente 10 mm compatible con el soporte de la cabeza de imagen.
   11. Centra la ventana craneal dentro de la abertura de la placa frontal.
   12. Aplica cemento dental solo en las zonas de contacto con el cráneo fuera de la ventana óptica.
   13. Deja que el cemento se endurezca completamente durante aproximadamente 5–10 minutos antes de mover al animal.
6. Recuperación postoperatoria y control de calidad de ventanas
   1. Administrar analgesia postoperatoria según el protocolo animal aprobado.
   2. En el flujo de trabajo representativo, administrar buprenorfina cloruro a 0,05–0,1 mg/kg por vía subcutánea cada 8–12 horas durante 24–48 horas.
   3. Recuperar ratones en una jaula calentada.
   4. Controla la respiración, la postura, el movimiento, el acicalado y el peso corporal a diario.
   5. Aceptar ventanas craneales que presenten una superficie de vidrio transparente, vasculatura cortical visible, duramadre intacta, sangre residual mínima, sin adhesivo bajo la cubierta, sin infecciones y fijación estable de la placa frontal.
   6. Excluye a los animales con opacidad marcada, sangrado persistente, residuos inflamatorios, infecciones, desplazamiento de ventanas, pérdida de peso severa (>15%) o mala peluquería y actividad.
   7. Procede a la prueba de imagen tras 3–5 días de recuperación.
   8. Confirmar actividad normal, comportamiento normal de aseo, peso corporal estable, ausencia de dolor o infección, y una ventana craneal transparente con vasos claramente visibles antes de la imagen.
      NOTA: El protocolo puede pausarse durante el periodo de recuperación postoperatorio. Mantener a los ratones bajo condiciones estándar de alojamiento, monitorizar diariamente el peso corporal y la claridad de la ventana, y reanudar las imágenes solo después de que se hayan cumplido todos los criterios de recuperación.

3. Expresión del sensor endotelial ^NAD+ mediada por AAV

1. Construcción y preparación viral
   1. Utiliza un biosensor ^NAD+ codificado genéticamente basado en eGFP/cpVenus, impulsado por el promotor endotelial Cdh5.
   2. Usa el Cambronne y otros. Secuencia biosensorial citoplasmática NAD⁺ de LigA-cpVenus (por ejemplo, plásmido Addgene #186787 o un inserto verificado por secuencia equivalente).
   3. Clona el promotor Cdh5 aguas arriba de la secuencia de codificación ^de biosensores NAD+ usando la columna vertebral vectorial CV232.
   4. Empaqueta el casete de expresión en la cápside AAV-X1.1 como preparación viral personalizada.
      1. Registrar el proveedor de producción viral, el método de purificación, el método de cuantificación del genoma viral, el número de lote de producción y el certificado de análisis para cada preparación de AAV.
   5. Registrar el mapa de plásmidos, resultados de verificación de secuencias, información sobre la producción viral, información de purificación, título del genoma viral y certificado de análisis para cada preparación viral.
      1. Registrar el mapa constructo, el informe de verificación de secuencia, el número de lote de producción viral, el informe de título cuantitativo de reacción en cadena de la polimerasa (qPCR), la documentación de purificación y el certificado de análisis para cada preparación viral utilizada en el estudio.
   6. Consulte la Tabla de Materiales para todos los detalles de la construcción.
   7. Utiliza preparaciones AAV de alto título con títulos qPCR específicos de lote, típicamente superiores a 2 × 10^{a 13} vg/mL.
   8. Guarda las alicotas de un solo uso a −80°C.
   9. Evita ciclos repetidos de congelación y deshielo.
   10. Registrar el lote de producción, el título qPCR, la duración del almacenamiento y la variación aceptable de lote a lote antes de su uso.
2. Administración sistémica de AAV
   1. Descongelar una aliquota viral en hielo.
   2. Diluir el virus en solución salina estéril con fosfato tamponado (PBS) hasta un volumen final de inyección de 100–200 μL por ratón.
   3. Mantén una dosis final de 2 × 10¹² vg por ratón en todos los animales.
      1. Calcula el volumen de inyección a partir del título genómico viral específico del lote. Para la preparación representativa con un título qPCR de 1,39 × 10¹³ vg/mL, inyectar aproximadamente 144 μL para administrar una dosis de 2 ×^{10 12} vg por ratón.
   4. Administrar el virus mediante inyección retro-orbitaria en el seno venoso usando una jeringuilla estéril de insulina de 29 G.
   5. Inyecta la suspensión viral lentamente durante aproximadamente 10–20 segundos.
   6. Confirma el éxito del parto verificando la ausencia de fugas, sangrado excesivo y lesiones oculares.
   7. Valida y reporta cualquier vía alternativa de administración por separado.
   8. Observa al ratón hasta que se restablezca la postura normal y el movimiento espontáneo.
   9. Confirma la respiración estable y la ausencia de sangrado o malestar.
   10. Solo devuelva al animal a su jaula de origen después de una recuperación completa.
   11. Permite 21–28 días para la expresión del sensor antes de la imagen.
   12. Mantener un intervalo de expresión consistente dentro de cada conjunto de comparación.
   13. Validar por separado los intervalos de expresión fuera del rango de 21–28 días.
       NOTA: El protocolo puede estar pausado durante el periodo de expresión AAV. Mantener el cuidado rutinario y el seguimiento de la salud y proceder a la cirugía craneal solo después de que haya transcurrido el intervalo de expresión previsto y el animal permanezca sano.
3. Validación de la restricción endotelial
   1. Examina animales antes de la recogida formal de datos.
   2. Aceptar animales cuando la señal verde del canal sensor sea detectable y siga la red vascular.
   3. Confirme que la señal está enriquecida a lo largo de las paredes del recipiente adyacentes al lúmen TMR–dextran–positivo.
   4. Confirmar la ausencia de fluorescencia parenquimatosa difusa dominante.
   5. Aplicar criterios de aceptación idénticos en todos los grupos experimentales.
   6. Perfundir ratones con PBS seguido de un 4% de paraformaldehído cuando se requiera validación post hoc.
   7. Recoge el cerebro y prepara 30–40 μm de secciones coronales o sagitales.
   8. Secciones de tinción con marcadores endoteliales como lectina de tomate, CD31 o cadherina endotelial vascular (VE-cadherina).
      1. Registrar la fuente de anticuerpos, número de catálogo, número de lote, especie hospedadora, dilución, condiciones de incubación y método de detección para cada experimento de validación.
   9. Evalúa la expresión de nicotinamida fosforibosiltransferasa (NAMPT) y poli(ADP-ribosa) polimerasa 1 (PARP1) cuando sea necesario.
   10. Utiliza diluciones de anticuerpos primarios optimizadas para la preparación del tejido.
   11. Adquiere imágenes de fluorescencia o confocales usando los mismos ajustes de adquisición entre grupos.
   12. Cuantifique la colocalización como la fracción de señal positiva de sensores que se solapa con o está inmediatamente adyacente a las regiones positivas con marcadores vasculares.
   13. Excluye a los animales cuando la señal más detectable se encuentra fuera de las estructuras vasculares.
   14. Excluye a los animales cuando no haya enriquecimiento en la pared del recipiente.
   15. Excluir animales cuando la fluorescencia parenquimatosa fuera del objetivo impide una selección fiable de la región de interés.
   16. Excluir animales cuando la fluorescencia del canal sensorial esté saturada o sea inestable durante la adquisición basal.

4. Imagen de dos fotones y análisis cuantitativo

1. Preparación del día de imagen y etiquetado de referencia intravascular
   1. Anestesiar ratones con una solución de trabajo de Avertin recién preparada (1,25%, 12,5 mg/mL) mediante inyección intraperitoneal a 200–250 mg/kg, o utilizar el régimen anestésico aprobado por el protocolo animal institucional.
   2. Confirma un plano quirúrgico estable mediante pérdida de retirada de pedales y respiración estable.
   3. Aplica pomada oftálmica inmediatamente después de la inducción.
   4. Si se utiliza anestesia inhalada, inducir anestesia con isoflurano al 3%–4%.
   5. Mantener la anestesia con isoflurano al 1%–2% en oxígeno a 0,5–1,0 L/min y ajustarse según la respiración y los reflejos.
   6. Preparar 70 kDa TMR–dextrán en PBS estéril a 10–25 mg/mL.
   7. Proteger la solución TMR–dextrán de la luz y filtrar la solución si la práctica institucional lo requiere.
   8. Inyectar TMR–dextrán por vía intravenosa a 20 mg/kg.
   9. Ajusta el volumen de inyección según la concentración de stock. Para un ratón de 25 g, administra aproximadamente 0,5 mg de colorante total.
   10. Prepare el trazador fresco o guarde las alicuotas protegidas de la luz según las recomendaciones del fabricante.
   11. Deja que el TMR–dextrano circule durante 5–10 minutos antes de la adquisición de la imagen.
2. Configuración del microscopio
   1. Utilice un microscopio de dos fotones de doble longitud de onda configurado para excitación de 920 nm del canal sensor basado en eGFP.
   2. Utiliza un camino de excitación de 1040 nm para el canal de referencia vascular TMR–dextrán.
   3. La imagen representativa se realizó en un microscopio multifotónico Nikon A1 MP/A1R MP+ controlado por el software de análisis AR/AR NIS Elements (versión 5.42.06).
   4. Registrar las fuentes láser, parámetros de pulsos, configuración de combinación de haz, tipo de detector y versión del software para cada sistema de imagen.
   5. Configura los canales de detección para separar la señal del canal sensor de la señal TMR–dextrán.
   6. Utiliza detectores de tubos fotomultiplicadores no escaneados (PMT) o fosfuro de arseniuro de galio (GaAsP).
   7. Recoge la emisión verde del canal del sensor entre aproximadamente 500 y 550 nm.
   8. Recoger la emisión de TMR–dextrán entre aproximadamente 570 y 650 nm.
      1. En el conjunto de datos representativo, recoge la emisión verde del canal sensor usando un filtro de emisión de 525/50 nm y recoge la emisión TMR–dextrano usando un filtro de emisión de 575/25 nm o 610/75 nm.
   9. Minimizar el filtro espectral entre canales.
   10. Mantén constantes los ajustes de ganancia y desplazamiento del detector dentro de cada conjunto de comparación.
   11. Verifica la separación de canales usando controles de un solo canal cuando esté disponible.
   12. Utiliza un objetivo de inmersión en agua Nikon CFI75 Apochromat 25XC W 1300 o equivalente (25×, apertura numérica 1,10, distancia de trabajo 2,0 mm).
   13. Confirma la co-registro del canal usando puntos de referencia vasculares fijos como bifurcaciones y bordes de lúmenes.
   14. Repita la verificación de co-registro tras cualquier ajuste de la trayectoria óptica.
   15. Mide la potencia láser en el plano de la muestra antes de la imagen.
   16. Mantén una constante de potencia láser de 920 nm dentro de cada conjunto de comparación.
   17. Mantener una constante de potencia láser de 1040 nm dentro de cada conjunto de comparación.
   18. Utilizar aproximadamente 10–20 mW a 920 nm y 8–18 mW a 1040 nm como rangos de trabajo representativos.
   19. Ajusta la potencia láser según la profundidad de imagen y la calidad de la ventana craneal.
   20. Excluye los campos que muestran una pérdida de señal superior al 20% durante el periodo base de 120 s.
   21. Excluye los campos que muestran cambios fototóxicos visibles.
3. Entornos de adquisición
   1. Selecciona campos de visión con una ventana óptica clara, microvasos enfocados con precisión y movimiento mínimo.
   2. Aceptar ventanas con funda transparente, vasculatura cortical visible, duramadre intacta, sangre residual mínima, sin adhesivo bajo la funda, sin infección y fijación estable en la placa frontal.
   3. Excluye a los animales con opacidad marcada, sangrado persistente, residuos inflamatorios, infecciones, desplazamiento de ventanas, pérdida de peso severa (>15%) o mala peluquería/actividad.
   4. Adquiere imágenes en time-lapse a 512 × 512 píxeles.
   5. Adquiere imágenes fijas representativas a 1024 × 1024 píxeles cuando se requiera mayor detalle espacial.
   6. Mantén el tamaño del píxel, el zoom, la velocidad de escaneo y el campo de visión constantes dentro de cada conjunto de comparación.
   7. Adquirir pilas z usando un tamaño de paso de 1–3 μm.
   8. Fotografía de microvasos corticales a profundidades aproximadas de 200–250 μm bajo la superficie pial.
   9. Extender la profundidad de imagen a aproximadamente 400 μm cuando la calidad de las ventanas lo permita.
   10. Mantén la profundidad de imagen constante para comparaciones emparejadas.
   11. Adquirir una línea base de 120 s en intervalos de 1 s antes de intervenciones agudas.
   12. Continúa la adquisición durante el periodo predefinido posterior a la intervención.
   13. Registrar respuestas de NMN intravenosa durante aproximadamente 10–30 minutos después de la inyección.
   14. Adquirir conjuntos de datos de agua potable y de gavage oral en puntos experimentales predefinidos.
   15. Mantén la misma configuración de adquisición en todos los grupos de comparación.
4. Intervención NMN (ejemplo de aplicación)
   1. Disuelve NMN en agua potable estéril.
   2. Ajusta la concentración de NMN para administrar aproximadamente 100 mg/kg/día.
   3. Protege la botella de la luz.
   4. Sustituye el agua potable que contenga NMN cada 24–48 horas.
   5. Controla el consumo de agua usando mediciones de peso de botella.
   6. Calcula la ingesta estimada de NMN utilizando el consumo de agua y el peso corporal.
   7. Continúa con la suplementación durante 5 días antes de la imagen.
   8. Prepara NMN a 1 mg/mL para la masa oral.
   9. Administra 200 μL por ratón usando una aguja de punta redondeada de 20G y 38 mm.
   10. Realiza imágenes de 30 a 60 minutos después de la gavage.
   11. Prepara NMN a 1 mg/mL para el parto intravenoso.
   12. Inyecta 100 μL por ratón a través del seno venoso retroorbitario o vena caudal.
   13. Administra la inyección lentamente durante 10–20 segundos.
   14. Comienza la imagen inmediatamente o en un plazo de 5 minutos tras la inyección.
   15. Obtén conjuntos de datos de agua potable tras 5 días de suplementación.
   16. Adquiere conjuntos de datos de gavage oral en un punto temporal fijo posterior al gavage.
   17. Obtén una referencia inicial justo antes de la inyección intravenosa.
   18. Registrar respuestas agudas durante aproximadamente 10–30 minutos tras la inyección intravenosa.
5. Procesamiento de imagen y extracción de señales
   1. Realiza corrección de movimiento cuando haya artefactos de movimiento presentes.
   2. Utiliza Fiji/ImageJ (versión 1.8.0 o posterior) con StackReg, TurboReg o un algoritmo equivalente de registro de cuerpo rígido.
   3. Utiliza puntos de referencia vasculares en el canal TMR–dextrán para guiar el registro.
   4. Aceptar conjuntos de datos solo cuando el desplazamiento residual sea inferior a aproximadamente 1–2 píxeles tras la corrección.
   5. Confirmar que los límites de la región vascular de interés (ROI) se mantienen estables durante toda la adquisición.
   6. Utiliza el canal TMR–dextrán para segmentar los lúmenes de los recipientes.
   7. Define los ROI endoteliales inmediatamente adyacentes al lumen.
   8. Selecciona microvasos con marcaje de lúmen estable, movimiento mínimo y señal visible en el canal del sensor.
   9. Analizar diámetros de vasos de aproximadamente 5–80 μm.
   10. Definan los ROI endoteliales como regiones asociadas a la pared vascular de aproximadamente 2–5 μm de ancho.
   11. Analizar de 3 a 5 embarcaciones por campo de visión cuando esté disponible.
   12. Analizar de 1 a 3 campos de visión por ratón cuando esté disponible.
   13. Definir los retornos de inversión de fondo en regiones tisulares que carecen de señal trazadora y de sensor.
   14. Coloca los ROI de fondo al menos 20 μm de los recipientes analizados y de los artefactos de imagen.
   15. Resta la intensidad media de fondo de cada canal antes de la normalización.
   16. Aplica la misma estrategia de resta de fondos a todas las muestras.
   17. Extrae valores medios de intensidad de series temporales para F_sensor(t).
   18. Extrae valores medios de intensidad de series temporales para F_ref(t).
   19. Realizar mediciones utilizando el análisis AR/AR de elementos NIS o Fiji/ImageJ.
   20. Exporta archivos de imagen en bruto como archivos ND2.
   21. Exporta copias de análisis como pilas TIFF de 16 bits cuando es posible.
   22. Exportar datos de series temporales del ROI como archivos CSV.
   23. Calcular los valores de fluorescencia substraitos de fondo antes de normalizar.
   24. Calcular ΔF/_{F 0} usando ΔF/_{F 0} = (F(t) − F₀)/F₀.
   25. Defina F₀ como la señal media durante el periodo base de 120 s.
   26. Calcular la normalización de referencia vascular como F_sensor(t)/F_ref(t).
   27. Informa del cambio máximo, tiempo hasta el pico, área bajo la curva y cinética de recuperación cuando la duración de la adquisición lo permita.
   28. No interpretes la señal del canal del sensor de 920 nm como una concentración calibrada de ^NAD+ .
   29. Realizar calibración ratiométrica adicional o validación bioquímica cuando se requieran mediciones cuantitativas de ^NAD+ .
6. Estadísticas e informes
   1. Define al ratón como la unidad experimental biológica.
   2. Mediciones a nivel de vaso en cada ratón antes de analizar a nivel de grupo o aplicar un modelo estadístico anidado.
   3. Utiliza pruebas t de dos colas emparejadas para comparaciones dentro del ratón distribuidas normalmente.
   4. Utiliza pruebas de Wilcoxon con pares emparejados y rango con signos cuando no se cumplan las suposiciones de normalidad.
   5. Utiliza modelos ANOVA de medidas repetidas o de efectos mixtos para análisis que involucren más de dos condiciones relacionadas.
   6. Aplicar correcciones de comparación múltiple adecuadas.
   7. Realizar análisis estadísticos utilizando GraphPad Prism o software equivalente.
   8. Define la significación estadística como p < 0,05.
   9. Informa la prueba estadística exacta en cada leyenda de figura.
   10. Codifica los archivos de imagen antes de la selección y cuantificación del ROI siempre que sea posible.
   11. Mantener la detección de los analistas hasta que se completen las mediciones de ROI y las decisiones de control de calidad.
   12. Utiliza N = 3 ratones como unidad experimental biológica en el conjunto de datos representativo.
       NOTA: No pause la adquisición de imagen durante la imagen activa en time-lapse. El procesamiento de imágenes y el análisis cuantitativo pueden pausarse tras la exportación de datos en bruto. Almacena archivos ND2, archivos de análisis TIFF, archivos de retorno de inversión, metadatos y tablas de medición CSV en un archivo respaldado. Registrar la potencia del láser, la configuración del detector, la profundidad de imagen, la identificación del animal, la asignación del tratamiento y las decisiones de exclusión para cada sesión de imagen.

Resultados

Una preparación exitosa produce una ventana craneal transparente y mecánicamente estable, adecuada para la imagen longitudinal. La Figura 1A resume el flujo de trabajo procedural, desde la anestesia y exposición del cráneo hasta la craneotomía, colocación del coverslip, fijación de la placa frontal y recuperación postoperatoria. La Figura 1B presenta fotografías representativas en serie de los principales pasos quirúrgicos. Las ...

Discusión

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo integral para monitorizar in vivo ^{el metabolismo} del NAD+ endotelial cerebral. Los determinantes clave del éxito incluyen: (i) claridad y estabilidad de las ventanas, incluyendo la minimización del daño térmico y el control de la purga durante la perforación; (ii) especificidad endotelial y expresión adecuada del sensor logradas mediante la selección adecuada del cápside, promotor, dosis e intervalo de expresión del VAA; ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2,2,2-Tribromoetanol (Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402	PRECAUCIÓN: Químico tóxico/nocivo. Se utiliza para preparar la solución de anestesia Avertin para cirugía de ventana craneal. Solución de trabajo típica: 1,25% (12,5 mg/mL), administrada intraperitonealmente a 200–250 mg/kg.
2-Metil-2-butanol	Sigma-Aldrich	152463	PRECAUCIÓN: Químico tóxico/nocivo. Solvente utilizado para la preparación de la solución concentrada de Avertin. Proteger de la luz y desechar las preparaciones que muestren precipitación o decoloración.
Hisopos absorbentes	Winner Medical	Hisopos de algodón médico estériles	Utilizado para hemostasia, secado del cráneo, irrigación y mantenimiento del campo quirúrgico.
AAV-X1.1-Cdh5-citoplasmático NAD+ biosensor-SV40 pA	Shanghai GeneChem Co., Ltd.; fuentes Addgene para plásmidos	Construcción GeneChem GCPV5052075; Addgene #186787; Addgene #196836	Biosensor NAD+ dirigido a endotelio empaquetado en AAV-X1.1. Casete de expresión: promotor Cdh5–biosensor citoplasmático NAD+–poli(A) SV40. Dosis de inyección representativa: 2 × 10¹² vg/ratón. Almacenar alícuotas a −80 °C y evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación. Registrar el título qPCR específico del lote, número de lote, mapa del plásmido, verificación de secuencia y certificado de análisis.
Agente analgésico (clorhidrato de buprenorfina)	MCE	HY-B0071	Analgesia perioperatoria y postoperatoria. Dosis representativa: 0,05–0,1 mg/kg subcutáneamente cada 8–12 h durante 24–48 h.
Sistema de administración de anestesia	RWD Life Science	R500 con vaporizador R580	Utilizado para la administración de isoflurano durante la obtención de imágenes. Flujo de oxígeno típico: 0,5–1,0 L/min.
Agente anestésico (isoflurano)	RWD Life Science	Serie R510-22	Utilizado para anestesia de imágenes. Configuraciones típicas: inducción del 3–4% y mantenimiento del 1–2%.
Portaobjetos	Hecho a medida	Sin número de catálogo	Portaobjetos de vidrio estéril No. 1,5 de 3 × 3 mm de tamaño adecuado para cubrir completamente una ventana craneal y sentarse uniformemente en el borde del cráneo.
Cimento/adhesivo dental	Sun Medical	Super-Bond C&B; VZB/JAP8147	Utilizado para el sellado de la ventana craneal y la fijación de la placa de titanio en la cabeza. Preparación representativa: 1 cucharada de polvo, 1 gota de catalizador y 4 gotas de monómero. Endurecer aproximadamente 5–10 min a temperatura ambiente.
Taladro dental	RWD Life Science	Microtaladro 78001	Taladro de alta velocidad utilizado para el adelgazamiento del cráneo y la craneotomía. Usar aproximadamente la mitad de la velocidad máxima con frecuente enfriamiento con solución salina.
Solución desinfectante	Winner Medical	Povidona yodada/iodóforo y etanol al 70%	Utilizado para la preparación del cuero cabelludo antes de la cirugía. Aplicar desinfectantes alternos durante tres ciclos.
Fórceps finos	Marca JZ	JD1050/JD1070	Utilizado para la eliminación del periostio, manipulación de tejidos y elevación del colgajo óseo.
Agujas de sonda	RWD Life Science	20G, 38 mm, punta esférica	Utilizado para la administración oral de NMN.
Placa de cabeza	Hecho a medida	Sin número de catálogo	Placa de titanio con una abertura central de aproximadamente 10 mm compatible con el soporte de imagen.
Almohadilla de calentamiento/controlador homeotérmico	RWD Life Science	69020 con almohadilla 69023	Utilizado para mantener la temperatura corporal aproximadamente en 36,5–37,5 °C durante la cirugía y la obtención de imágenes.
Software de adquisición de imágenes	Nikon	NIS-Elements AR/AR Analysis v5.42.06	Utilizado para el control del microscopio y la adquisición de imágenes. Las configuraciones representativas incluyen 512 × 512 o 1024 × 1024 píxeles, 1–3 µm de paso z y un intervalo de lapso de tiempo de 1 s.
Software de análisis de imágenes	NIH	Fiji/ImageJ v1.8.0 o posterior	Utilizado para la corrección de movimiento, selección de ROI, resta de fondo, extracción de intensidad y exportación CSV.
Suministros de inyección intravenosa	BD	329461	Jeringa de insulina estéril de 1 mL con aguja de 29G para inyecciones de AAV, TMR–dextrán y NMN.
NMN (mononucleótido de nicotinamida)	Selleck Chemicals	S5259	Precursor de NAD+ utilizado para experimentos de administración en agua potable, por sonda oral e intravenosa.
Pomada oftálmica	Farmacia certificada local	No aplicable	Utilizado para prevenir el secado de la córnea durante la anestesia.
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Servicebio	G4202-100ML o G4202-500ML	PBS estéril 1× utilizado para la dilución viral, preparación de trazadores, enjuague de tejidos y preparación de reactivos.
Sistema de monitoreo respiratorio	RWD Life Science	Módulo de monitoreo integrado	Utilizado para monitorear la respiración y la profundidad de la anestesia durante la cirugía y la obtención de imágenes.
Solución salina (NaCl al 0,9%, estéril)	Servicebio	G4702-500ML	Utilizado para el enfriamiento del cráneo, irrigación, humectación de tejidos y preparación de soluciones.
Marco estereotáxico/soporte de cabeza	Hecho a medida	Sin número de catálogo	Utilizado para el posicionamiento estable durante la cirugía de ventana craneal y la obtención de imágenes.
Microscopio quirúrgico	Olympus	SZ61	Utilizado durante la cirugía de ventana craneal para el adelgazamiento del cráneo, craneotomía y colocación de portaobjetos.
TMR–dextrán (70 kDa)	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	D1818	Tracador fluorescente intravascular utilizado para el etiquetado de referencia vascular. Concentración típica: 10–25 mg/mL. Inyectar a 20 mg/kg y permitir una circulación de 5–10 min antes de la obtención de imágenes.
Lectina de tomate (