Un estudio de farmacología en red y acoplamiento molecular de la fórmula TongBi para la osteoartritis

Resumen

Este protocolo predice posibles objetivos terapéuticos y mecanismos moleculares de la Fórmula TongBi contra la osteoartritis mediante farmacología en red y acoplamiento molecular.

Resumen

Este estudio aplicó la farmacología de redes combinada con acoplamiento molecular para predecir los posibles objetivos terapéuticos y mecanismos moleculares de la Fórmula TongBi (TBF) en la osteoartritis (OA). Los componentes activos y los objetivos correspondientes de TBF se recuperaron de la Base de Datos y Plataforma de Análisis de Sistemas de Farmacología de la Medicina China Tradicional, mientras que los objetivos relacionados con la AA se recogieron de la Herencia Mendeliana en Línea en el Hombre, GeneCards, DrugBank y la Base de Datos de Objetivos Terapéuticos. Se utilizó un software de visualización y análisis de redes para construir redes de interacción composto–objetivo y proteína–proteína (IBP). Se realizaron análisis de enriquecimiento de vías de la Enciclopedia de Genes y Genomas de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto utilizando la plataforma Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery. El análisis de acoplamiento molecular se realizó utilizando un software de acoplamiento molecular para evaluar la afinidad de unión prevista entre compuestos activos clave y proteínas objetivo centrales. Se identificaron un total de 47 objetivos superpuestos entre TBF y OA. El análisis de redes PPI destacó JUN, RELA, IL6, MAPK1 e IL10 como posibles objetivos centrales. El análisis de enriquecimiento sugirió que la TBF puede regular la inflamación, el metabolismo lipídico y múltiples vías de señalización intracelular asociadas a la progresión de la OA. Los resultados del acoplamiento molecular demostraron afinidades de unión predichas favorables entre compuestos activos centrales y dianas proteicas clave relacionadas con la OA. Estos hallazgos proporcionan un marco computacional para comprender los posibles mecanismos de la TBF frente a la OA y apoyan una validación experimental adicional.

Introducción

La artrosis (OA) es una enfermedad inflamatoria degenerativa del cartílago^{articular 1}. Actualmente, aproximadamente 58 millones de adultos se ven afectados por la OA, y se prevé que esta cifra aumente a 78,4 millones para 2040². La artrosis es una causa común de dolor articular y deterioro funcional en^{todo el mundo 3}. Debido al dolor intenso asociado a la artrosis, los pacientes suelen experimentar una discapacidad considerable en su vida^{diaria 4}. La edad, el sexo femenino, la obesidad y los daños en las articulaciones son los principales factores de riesgo para la^AO5. Aunque la prevalencia de la artrosis es extremadamente alta y tiene un impacto significativo en los sistemas sanitarios, las opciones de tratamiento disponibles siguen siendo^{limitadas 6}. La medicina moderna suele adoptar tratamientos sintomáticos como antiinflamatorios no esteroideos y protectores del cartílago. Sin embargo, la administración prolongada suele causar reacciones adversas, incluyendo daños gastrointestinales y función hepática y renal^anormal. Por ello, es urgente desarrollar nuevos métodos de tratamiento o terapias alternativas para la artrosis.

La Medicina Tradicional China (MTC) ha acumulado una amplia experiencia en el tratamiento de la artrosis, con énfasis en la diferenciación del síndrome y la regulación holística. La Fórmula TongBi (TBF) es una prescripción clásica que consiste principalmente en Danggui, Danshen, Jixueteng, Haifengteng, Tougucao, Duhuo, Weilingxian y Xiangfu. Desde la perspectiva de la MTC, la naturaleza patológica de la AO se origina principalmente en la invasión del viento, el frío y la humedad y la estancación del qi y la sangre⁸. La compatibilidad herbal de la TBF está diseñada para ajustarse a este mecanismo patológico central, con todos los componentes medicinales actuando en sinergia para disipar el viento y la humedad, dragar meridianos y promover la circulación sanguínea, correspondiendo así a las características típicas del síndrome de la MTC en la OA. Cada vez más investigaciones clínicas sugieren que la TBF modificada puede aliviar el dolor articular y mejorar la función motora de las extremidades en pacientes con^{OA 9}. Observaciones clínicas adicionales también han demostrado su potencial para regular las respuestas inflamatorias en los casos¹⁰ de la AO, mientras que un reciente metaanálisis apoyó aún más su aplicabilidad clínica para la intervención en la^{AO 11}.

Tradicionalmente, la TBF se utiliza para disipar el viento, desobstruir canales, dispersar el frío, eliminar la humedad y promover la circulación y nutrición sanguínea. Sin embargo, los mecanismos específicos por los cuales la TBF ejerce posibles efectos terapéuticos contra la artrosi siguen sin estar claros, y sus componentes activos y objetivos clave aún están por determinarse. Para investigar estos mecanismos de manera más sistemática y completa, empleamos un enfoque de farmacología de redes para construir un mapa de redes que ilustre las relaciones entre fármacos, objetivos y^{enfermedades 12}. Además, se realizaron análisis de enriquecimiento de la Ontología Génica (GO) y la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) para explorar los posibles mecanismos moleculares y vías de señalización implicados en la acción farmacológica de^{TBF 13}. Para investigar sistemáticamente los mecanismos farmacológicos de las prescripciones de MTC, este estudio estableció un flujo de trabajo analítico completo que cubre el cribado de ingredientes activos, la predicción de objetivos, la construcción de redes, el análisis de enriquecimiento funcional y el acoplamiento molecular. Este marco de investigación ha sido reconocido como un paradigma estandarizado y reproducible para explorar los mecanismos moleculares de las fórmulas de la MTC frente a la^{OA 14}. Los estudios metodológicos existentes han respaldado además la racionalidad científica y la aplicabilidad práctica de esta estrategia^{de investigación 15}. Más allá de la estandarización metodológica, el presente estudio ayuda a definir la base material y los objetivos regulatorios centrales de la TBF en la OA. Además, proporciona referencias teóricas para la aplicación clínica y la futura validación experimental de TBF, al tiempo que ofrece un marco metodológico factible para la exploración mecanicista de otras prescripciones de MTC.

En este estudio, utilizamos un enfoque de farmacología en red para detectar componentes activos y construir una red compuesto-objetivo combinada con genes blanco relacionados con la OA. Posteriormente se realizaron análisis de enriquecimiento funcional y acoplamiento molecular para la exploración mecanicista. La farmacología de redes integra información biológica y farmacológica para investigar las relaciones fármaco–objetivo–enfermedad desde una perspectiva integral y^{multifacética 16}. Creemos que este enfoque puede ayudar a clarificar los posibles mecanismos farmacológicos de la TBF y proporcionar una base teórica para investigaciones experimentales posteriores. El flujo de trabajo del estudio se presenta en la Figura 1.

Figura 1. Flujo de trabajo del estudio de farmacología en red y diseño de acoplamiento molecular. Visión esquemática del flujo de trabajo analítico utilizado para investigar los posibles mecanismos de la Fórmula TongBi (TBF) frente a la osteoartritis (OA). El flujo de trabajo incluyó cribado de compuestos activos, predicción de objetivos, recogida de blancos relacionada con OA, análisis de intersecciones, construcción de redes, análisis de interacción proteína-proteína (PPI), análisis de enriquecimiento de la Ontología Génica (GO) y de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kyoto (KEGG), así como validación de acoplamiento molecular. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Protocolo

No participaron en este estudio participantes humanos, animales vertebrados ni muestras de tejido. Todos los análisis se realizaron utilizando bases de datos de bioinformática de acceso público y enfoques de acoplamiento molecular; por lo tanto, no se requería aprobación ética.

Cribado de componentes y objetivos correspondientes de TBF
Todos los ingredientes herbales de TBF, incluyendo Danggui, Danshen, Jixueteng, Haifengteng, Tougucao, Duhuo, Weilingxian y Xiangfu, fueron buscados en la Plataforma de Datos y Análisis de Sistemas de Farmacología de Sistemas de la MTC (TCMSP) (consultado en enero de 2026). Los términos exactos de búsqueda correspondían a los nombres latinos estandarizados de cada medicina herbal: Angelicae Sinensis Radix (Danggui), Radix Salviae (Danshen), Spatholobus suberectus Dunn (Jixueteng), Caulis Piperis Kadsurae (Haifengteng), Impatiens balsamina (Tougucao), Radix Angelicae Biseratae (Duhuo), Radix Clematidis (Weilingxian) y Cyperi Rhizoma (Xiangfu). Los componentes químicos se examinaron según los umbrales fijos de biodisponibilidad oral (OB) ≥ 30% y semejanza de fármacos (DL) ≥ 0,18. Estos valores de corte se utilizan ampliamente en estudios de farmacología de redes de MTC para identificar compuestos activos biodisponibles y similares a fármacos con potencial actividad in vivo. Se excluyeron los compuestos que carecían de valores explícitos de OB o DL en la base de datos para mantener la fiabilidad y consistencia del cribado activo de compuestos.

Los objetivos proteicos correspondientes de los compuestos activos cribados fueron posteriormente recuperados de la base de datos de farmacología de la MTC. La estandarización de genes objetivo se realizó utilizando la base de datos de anotación de proteínas Universal Protein Resource (UniProt), restringiendo la especie a Homo sapiens (consultado en enero de 2026). Los nombres originales de proteínas se convirtieron en símbolos oficiales de genes humanos, mientras que las entradas redundantes y no humanas de objetivos fueron excluidas manualmente. Los objetivos duplicados se eliminaron mediante comparación manual y recopilación para generar el conjunto de datos final de objetivos TBF.

Identificación de dianas relacionadas con la AO y posibles dianas terapéuticas de TBF para la AO
Se recuperaron objetivos relacionados con la artrosis usando el término de búsqueda exacto "Osteoartritis" en las bases de datos Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), GeneCards, DrugBank y Therapeutic Target Database (TTD) (consultado en enero de 2026). Los objetivos duplicados obtenidos de diferentes bases de datos se eliminaban manualmente mediante la recopilación y comparación de datos para generar el conjunto de datos objetivo relacionado con OA. Para las GeneCards, solo se conservaban los objetivos con puntuación de relevancia ≥ 3. Los objetivos recuperados de OMIM, DrugBank y TTD usando la palabra clave "Osteoartritis" no fueron sometidos a criterios de filtrado adicionales. Los objetivos superpuestos entre los objetivos activos relacionados con compuestos y los objetivos relacionados con la OA se identificaron utilizando la herramienta de análisis online Venn 2.1.0. El análisis de intersección se realizó para determinar los posibles objetivos terapéuticos de la TBF frente a la OA.

Construcción de la red TBF–Componente–Objetivo
Los datos de interacción componente–objetivo se importaron al software de visualización y análisis de redes Cytoscape 3.10.2 para construir la red TBF–Componente–Objetivo (consultado en enero de 2026). En la red construida, los nodos representaban compuestos herbales y genes objetivo, mientras que los bordes representaban las interacciones entre compuestos activos y objetivos correspondientes. Para evitar análisis redundantes, compuestos duplicados compartidos entre varias hierbas se fusionaron en un único nodo. Posteriormente se realizó un análisis topológico de redes utilizando el valor de grado como parámetro principal de evaluación. Los compuestos activos centrales fueron identificados según el grado de clasificación y seleccionados como candidatos a ligandos para un posterior análisis de acoplamiento molecular.

Construcción de redes PPI
Los posibles objetivos terapéuticos se importaron a la base de datos STRING de PPI para su análisis de IBP (consultado en enero de 2026). El parámetro de especie se restringió a Homo sapiens, y la puntuación mínima requerida de confianza en la interacción se estableció en 0,9, mientras que todos los parámetros restantes se mantuvieron en la configuración predeterminada. Los datos de interacción generados se exportaron y visualizaron posteriormente utilizando el software de visualización y análisis de red. El análisis topológico de la red PPI se realizó utilizando el plugin de análisis de topología de redes CytoHubba. Se calcularon el grado, la centralidad intermedia y la centralidad de proximidad para evaluar la importancia de los nodos dentro de la red de interacción. Las proteínas objetivo principales se identificaron basándose en características topológicas integradas y se seleccionaron para el posterior análisis de acoplamiento molecular. Se adoptó el algoritmo de Centralidad de Máxima Clique para filtrar objetivos de centros. Se excluyeron los nodos sin socios interactuantes, lo que resultó en un menor número de nodos en la red final que en el conjunto de datos objetivo importado original.

GO y KEGG
Se realizaron análisis de enriquecimiento funcional GO y análisis de enriquecimiento de vías KEGG para investigar las posibles funciones biológicas y vías de señalización asociadas con los objetivos terapéuticos identificados de TBF frente a la OA. El análisis GO incluyó las tres categorías estándar de ontologías: proceso biológico (BP), componente celular (CC) y función molecular (MF), designando el proceso biológico como foco principal de interpretación.

El análisis de enriquecimiento funcional se realizó utilizando la Base de Datos para Anotación, Visualización e Descubrimiento Integrado (DAVID) en combinación con el software de análisis estadístico R (versión 4.3.1; consultada en enero de 2026). Los resultados de enriquecimiento se procesaron y visualizaron usando el paquete clusterProfer, utilizando las funciones de dotplot y barplot para generar diagramas de enriquecimiento. Todos los genes objetivo fueron anotados en relación con el trasfondo de Homo sapiens . Se aplicó el método de Benjamini–Hochberg para la corrección de pruebas múltiples, y se consideró estadísticamente significativo un valor P ajustado < 0,05.

La visualización de los resultados de enriquecimiento de GO y KEGG se realizó utilizando la plataforma de análisis online MicrobiomeAnalyst/MicrobiomeNet (consultado en enero de 2026). Se generaron gráficos de barras y diagramas de burbujas para mostrar los términos GO y las rutas KEGG más enriquecidos.

Acoplamiento molecular
Los nombres oficiales de los genes y los correspondientes identificadores del Banco de Datos de Proteínas (PDB) de los principales objetivos centrales fueron recuperados de la base de datos de anotación de proteínas17, y sus estructuras cristalinas tridimensionales se descargaron del PDB del RCSB (consultado en febrero de 2026). Para cada proteína objetivo, la cadena A se mantuvo como estructura receptora, mientras que las cadenas proteicas redundantes, heteroátomos y fragmentos estructurales no relacionados fueron eliminados durante la preparación del receptor. Las estructuras tridimensionales de los compuestos activos principales fueron recuperadas de la base de datos PubChem (consultado en febrero de 2026). En este estudio, la quercetina fue seleccionada como ligando de acoplamiento representativo porque presentaba la mayor centralidad topológica en la red componente-objetivo y es un flavonoide bien caracterizado con efectos protectores reportados contra la patogénesis de la OA.

El preprocesamiento de receptores y ligandos se realizó utilizando software de preparación de acoplamiento molecular, incluyendo la eliminación de moléculas de agua, adición de átomos de hidrógeno, tratamiento por protonación y asignación de carga de Gasteiger. Posteriormente, el análisis de acoplamiento molecular se realizó utilizando el software de acoplamiento molecular versión 1.5.7. Las dimensiones de las cajas de la cuadrícula se ajustaron para abarcar las regiones de unión previstas de cada proteína objetivo. La cuadrícula estaba centrada en el bolsillo nativo de unión de ligandos de cada proteína objetivo, con un tamaño uniforme de 40 Å × 40 Å × 40 Å y un espaciado de 0,375 Å. Los cálculos de acoplamiento se realizaron con un parámetro de exhaustividad de 8, y se generaron nueve conformaciones de enlace candidato para cada par ligando–objetivo. Se seleccionó la conformación de acoplamiento con la menor energía de enlace predicha como la pose representativa de unión para su posterior interpretación estructural. No se realizaron validaciones de reacoplamiento ni comparación de ligandos positivo-control en este estudio. Todos los procedimientos de acoplamiento y ajustes de parámetros seguían protocolos estándar comúnmente adoptados en la investigación en farmacología de redes para apoyar la fiabilidad de los modos de unión predichos. Las conformaciones de acoplamiento se visualizaron utilizando la versión 2.5.4 del software de visualización molecular. Se consideró que una energía de enlace de ≤−5,0 kcal/mol indicaba una unión estable entre ligando-receptor.

Resultados

Composición química y cribado objetivo de TBF
Tras el cribado se identificaron un total de 2 componentes activos de Danggui, 65 de Danshen, 24 de Jixueteng, 21 de Haifengteng, 6 de Tougucao, 9 de Duhuo, 7 de Weilingxian y 18 de Xiangfu. La información detallada sobre los compuestos activos evaluados se proporciona en la Tabla Suplementaria 1. Inicialmente se recuperaron un total de 2.672 objetivos potenciales, incluyendo 266 para Danggui, 689 para Danshen, 236 para Duhuo, 188 para Haifengteng, 545 para Jixueteng, 192 para Tougucao, 102 para Weilingxian y 454 para Xiangfu. La información detallada sobre objetivos se presenta en la Tabla Suplementaria 2. Tras la eliminación de entradas duplicadas, se obtuvieron 258 objetivos no redundantes asociados con TBF.

La red TBF–Componente–Objetivo
La red TBF–Componente–Objetivo se construyó utilizando datos obtenidos de la base de datos de farmacología de la MTC, incluyendo 152 compuestos activos, 258 dianas no redundantes y 8 nodos de medicina herbal. Estos datos se organizaron en dos archivos, designados como "red" y "Tipo" (Tabla Suplementaria 3). Tras importar los archivos al software de visualización y análisis de red, se estableció una red completa que contenía 578 nodos y 3022 aristas (Figura 2). En la red construida, los nodos representaban medicinas herbales, compuestos bioactivos y proteínas objetivo correspondientes, mientras que los bordes representaban las interacciones previstas entre compuestos y objetivos. Un tamaño de nodo mayor y una intensidad de color más oscura indicaban valores de grado más altos y una mayor conectividad de red. Según la clasificación de grado obtenida mediante análisis topológico de redes, se identificaron los cinco compuestos activos principales como quercetina (A7-MOL000098), beta-sitosterol (B8-MOL000358), luteolina (A1-MOL000006), kaempferol (C1-MOL000422) y estigmasterol (C2-MOL000449).

Figura 2. TBF–Red de interacción Componente–Objetivo. Visualización en red de las interacciones entre TBF, compuestos activos y genes objetivo predichos. Los nodos representan medicinas herbales, compuestos activos o proteínas objetivo, mientras que los bordes representan interacciones predichas entre compuestos y objetivos. Un tamaño de nodo mayor y una intensidad de color más oscura indican valores de grado más altos y una mayor conectividad de red. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Información de los objetivos relacionados con la OA y posibles objetivos terapéuticos de la TBF
La palabra clave "Osteoartritis" se buscó en cuatro bases de datos, arrojando 428 posibles objetivos relacionados con enfermedades, incluyendo 9 de OMIM, 349 de GeneCards, 32 de DrugBank y 38 de TTD. Un diagrama de Venn que ilustra la distribución objetivo entre las cuatro bases de datos se presenta en la Figura 3. Tras fusionar y eliminar entradas duplicadas, se obtuvieron 398 objetivos únicos relacionados con la OA. El análisis de intersección entre objetivos relacionados con la AO y objetivos relacionados con compuestos activos con TBF identificó 47 objetivos superpuestos, que se consideraron posibles objetivos terapéuticos de TBF frente a OA. El diagrama de Venn correspondiente generado utilizando la herramienta de análisis de Venn en línea se muestra en la Figura 4.

Figura 3. Diagrama de Venn de objetivos relacionados con la OA recuperado de múltiples bases de datos. Diagrama de Venn que muestra la superposición entre objetivos relacionados con la AO identificados a partir de las bases de datos OMIM, GeneCards, DrugBank y Therapeutic Target Database (TTD). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4. Identificación de objetivos superpuestos entre TBF y OA. Diagrama de Venn que muestra la intersección entre objetivos activos relacionados con compuestos de TBF y objetivos relacionados con OA. Los objetivos superpuestos se consideraron posibles objetivos terapéuticos de la TBF contra la OA. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Construcción y análisis de la red PPI
El análisis de redes PPI de los 47 objetivos superpuestos se realizó utilizando la base de datos PPI (Figura 5) y posteriormente se visualizó mediante software de visualización y análisis de red. Durante la construcción de la red, se eliminaron nodos desconectados que representaban objetivos aislados sin interacciones proteína-proteína (IBP) según procedimientos estándar de topología de red, resultando en una red refinada que contenía 39 nodos y 108 aristas (Figura 6). El tamaño del nodo y la intensidad del color reflejaban los valores de grado, indicando la importancia relativa de los objetivos dentro de la red.

Figura 5. STRING PPI de objetivos superpuestos. Red PPI generada utilizando la base de datos STRING para los objetivos superpuestos entre TBF y OA. Los nodos representan proteínas objetivo y las aristas representan los IBP predichos. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 6. Análisis de redes principales de PPI. Red PPI refinada tras la eliminación de nodos desconectados. El tamaño del nodo y la intensidad del color representan los valores de grado e indican la importancia relativa de los objetivos dentro de la red. Los objetivos principales como JUN, RELA, IL6, MAPK1 e IL10 demostraron alta conectividad de red. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

El análisis topológico de la red PPI se realizó utilizando el plugin de análisis de topología de redes con el algoritmo Degree para calcular las características topológicas de los nodos. Los 10 principales objetivos clasificados por valor de grado se presentan en la Tabla 1. Los cinco objetivos mejor clasificados, incluyendo JUN, RELA, IL6, MAPK1 e IL10, fueron seleccionados como objetivos principales para el posterior análisis de acoplamiento molecular basado en el valor de grado, la centralidad de la cercanía y la centralidad entre medias.

Función biológica GO y análisis de la vía KEGG de TBF en la OA
El análisis de enriquecimiento GO identificó varias funciones biológicas relacionadas con la OA, incluyendo la actividad de las citocinas, la unión de factores de transcripción y la actividad de factores de crecimiento, lo que sugiere la posible implicación de TBF en la regulación de la inflamación, la actividad transcripcional y la homeostasis del cartílago. Los 20 términos GO enriquecidos más destacados se clasificaron según los valores de recuento y se visualizaron mediante un gráfico de barras (Figura 7). El análisis de enriquecimiento de la vía KEGG se centró en las vías de señalización relacionadas con la OA, incluyendo los productos finales de glicación avanzados: la vía de señalización del receptor para productos finales avanzados de glicación, la vía de señalización de la interleucina-17 (IL-17), la vía de señalización del factor de necrosis tumoral (TNF) y la vía de señalización del receptor de células T, que están asociadas con la regulación inflamatoria, el catabólico de condrocitos y las respuestas inmunitarias en la OA. Las vías relacionadas con enfermedades infecciosas identificadas durante el análisis de enriquecimiento no se interpretaron como mecanismos directos de la AA en el presente estudio. El análisis de vías KEGG se realizó utilizando el software de análisis estadístico para generar una visualización de diagrama de burbujas (Figura 8). Se identificaron un total de 20 vías de señalización significativamente enriquecidas. Estos resultados sugirieron que la TBF puede regular los procesos biológicos y las vías de señalización relacionados con la OA mediante un mecanismo farmacológico multiobjetivo.

Figura 7. Análisis de enriquecimiento GO de posibles objetivos terapéuticos. Gráfico de barras que muestra los 20 términos GO enriquecidos más asociados con los posibles objetivos terapéuticos de TBF frente a la OA. Los términos enriquecidos incluyen procesos biológicos, funciones moleculares y componentes celulares relacionados con la inflamación, la regulación transcripcional y la homeostasis del cartílago. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 8. Análisis de enriquecimiento de vías KEGG de posibles objetivos terapéuticos. Visualización de diagramas de burbujas de las vías de señalización KEGG enriquecidas en la parte superior asociadas con los posibles objetivos terapéuticos de TBF contra la OA. El tamaño de la burbuja representa el número de genes enriquecidos, mientras que la intensidad del color refleja el nivel de significación del enriquecimiento. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Verificación de acoplamiento molecular
Para investigar más a fondo las posibles interacciones de unión entre el compuesto activo principal de TBF y los objetivos principales identificados en la red de PPI, se realizó un análisis de acoplamiento molecular entre la quercetina, el compuesto activo mejor valorado en la red componente–objetivo, y los cinco objetivos principales JUN, RELA, IL6, MAPK1 e IL10 (Tabla 2). La quercetina demostró la mayor importancia topológica en la red componente-objetivo y ha sido ampliamente reportada como un compuesto bioactivo representativo asociado a la actividad antiinflamatoria y la regulación del metabolismo del^{cartílago 18,19}. Las energías de unión previstas fueron −8,4 kcal/mol para JUN, −7,6 kcal/mol para RELA, −6,9 kcal/mol para IL6 y −6,7 kcal/mol tanto para MAPK1 como para IL10, indicando afinidades de unión favorables predichas entre la quercetina y los objetivos centrales seleccionados. La visualización de las conformaciones de unión ligando-receptor facilitó la interpretación de posibles interacciones moleculares. Se utilizó la versión 2.5.4 del software de visualización molecular para visualizar las conformaciones óptimas de acoplamiento entre la quercetina y los cinco objetivos principales (Figuras 9–13).

Figura 9. Modelo de acoplamiento molecular de quercetina con jun (id pdb: 1JNM). Conformación de acoplamiento molecular tridimensional de la quercetina unida a JUN. Se predijo que la quercetina se uniría dentro del dominio bZIP de JUN y encajaría en la cavidad de unión hidrofóbica con complementariedad estructural. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 10. Modelo de acoplamiento molecular de quercetina con RELA (ID PDB: 7LEU). Conformación de acoplamiento molecular tridimensional de quercetina unida a RELA. Se predijo que la quercetina interactuaría con la región activa del dominio de homología de Rel RELA mediante interacciones no covalentes. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 11. Modelo de acoplamiento molecular de quercetina con IL6 (PDB ID: 1ALU). Conformación de acoplamiento molecular tridimensional de quercetina unida a IL6. Se predijo que la quercetina ocuparía el surco conservado de unión a receptores de IL6. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 12. Modelo de acoplamiento molecular de quercetina con MAPK1 (ID PDB: 6D5Y). Conformación de acoplamiento molecular tridimensional de quercetina unida a MAPK1. Se predijo que la quercetina ocuparía el bolsillo de unión a ATP de MAPK1, lo que sugiere posibles interacciones relacionadas con quinasas. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 13. Modelo de acoplamiento molecular de quercetina con IL10 (PDB ID: 1ILK). Conformación de acoplamiento molecular tridimensional de quercetina unida a IL10. Se predijo que la quercetina interactuaría cerca de la región de interfaz dímera de IL10 y podría contribuir a la estabilización del complejo proteico. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Disponibilidad de datos:
Todos los datos que respaldan los hallazgos de este estudio se incluyen en el manuscrito, tablas, figuras y materiales complementarios. La Tabla Suplementaria 1 contiene los compuestos activos filtrados de la Fórmula TongBi (TBF), la Tabla Suplementaria 2 proporciona la información correspondiente predicha del objetivo, y la Tabla Suplementaria 3 contiene los datos de codificación de redes e interacción utilizados para la construcción de redes y el análisis topológico.

Gen	Nombre de la proteína	Título	Centralidad de la cercanía	Centralidad de la intermediedad
JUNIO	Factor de transcripción AP-1	18	0.58	0.22
RELA	Factor de transcripción p65	15	0.56	0.15
IL6	Interleucina 6	14	0.59	0.33
MAPK1	Proteína quinasa 1 activada por mitógenos	13	0.54	0.16
IL10	Interleucina 10	10	0.47	0.12
ESR1	Receptor de estrógenos	10	0.44	0.03
IL2	Interleucina 2	9	0.53	0.05
AKT1	RAC-alfa serina/treonina-proteína quinasa	9	0.44	0.04
MMP1	Metalopeptidasa matricial 1	8	0.44	0.03
MMP2	Metalopeptidasa matricial 2	8	0.44	0.03

Tabla 1: Parámetros topológicos de los objetivos centrales en la red PPI. Parámetros topológicos de los principales objetivos identificados en el análisis de redes PPI. Se calcularon el grado, la centralidad de proximidad y la centralidad entre los nodulos para evaluar la importancia de los nodos e identificar los objetivos terapéuticos principales asociados con TBF frente a la OA. Se consideraron que los objetivos con valores de grado y centralidad más altos dentro de la red de interacción.

Objetivo	PDB ID	Coordenadas del sitio activo (X, Y, Z)	Ligando	Afinidad de Enlace (kcal/mol)
JUNIO	1JNM	X = 10,201; Y = 0,493; Z = 19,492	Quercetina	−8,4
RELA	7LEU	X = 1,717; Y = 23,889; Z = −0,778		−7.6
IL6	1ALU	X = 2,599; Y = −20,016; Z = 8,749		−6,9
MAPK1	6D5Y	X = 7,052; Y = 12.800; Z = 20,749		−6.7
IL10	1ilk	X = 17,836; Y = 46,443; Z = 38,685		−6.7

Tabla 2: Parámetros de acoplamiento molecular y afinidades de unión entre la quercetina y las proteínas objetivo centrales. El acoplamiento molecular resulta entre la quercetina y las proteínas objetivo centrales seleccionadas JUN, RELA, IL6, MAPK1 e IL10. La tabla presenta identificadores del Banco de Datos de Proteínas (PDB), coordenadas del centro de cuadrícula del sitio activo utilizadas para cálculos de acoplamiento y valores predichos de afinidad de unión obtenidos mediante análisis de acoplamiento molecular. Valores más bajos de energía de unión indican una afinidad de unión ligando-receptor más fuerte.

Tabla suplementaria 1: Compuestos activos identificados a partir de TBF. Información detallada sobre los compuestos activos filtrados en TBF, incluyendo nombres de compuestos, identificadores moleculares, valores OB, valores DL y fuentes herbales correspondientes. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 2: Objetivos predichos correspondientes a compuestos activos de TBF. Lista completa de dianas proteicas predichas correspondientes a los compuestos activos cribados de TBF, incluyendo símbolos estandarizados de genes humanos obtenidos tras la normalización y deduplicación del objetivo. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 3: Información de codificación de red para la red TBF–Componente–Objetivo. Información detallada de codificación utilizada para la construcción de la red de interacción componente–objetivo TBF, incluyendo identificadores moleculares, información de objetivos, relaciones de red y datos de clasificación de nodos utilizados para el análisis de topología de la red. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Este estudio empleó enfoques de farmacología de redes y acoplamiento molecular para investigar los posibles mecanismos de la TBF frente a la OA. Las medicinas herbales principales analizadas incluían Danggui, Danshen, Jixueteng, Haifengteng, Tougucao, Duhuo, Weilingxian y Xiangfu. Estudios previos han demostrado que Danggui (Angelica sinensis Radix) puede aliviar cambios patológicos relacionados con la OA, incluyendo degeneración del cartílago, esclerosis ósea subcondral, marcha anormal e inflamación de la rodilla en la desestabilización de los modelos de menisco^{medial 20}. En modelos de células OA inducidas por IL-1β, Danggui redujo la acumulación de especies reactivas de oxígeno y aumentó la actividad de enzimas antioxidantes, incluyendo la superóxida dismutasa y el^{glutatión 21}. Se ha informado que la danshenindiona IIA, un componente activo de Salvia miltiorrhiza, alivia la degeneración del cartílago, restaura la homeostasis de la remodelación ósea subcondral, y suprime la angiogénesis anormal en los modelos murinos de^{OA 22}. Además, los componentes derivados de S. miltiorrhiza pueden regular el estrés oxidativo y el metabolismo óseo^23,24. Spatholobus suberectus Se ha informado que Dunn regula las vías de señalización PI3K/Akt/mTOR y Ras/Raf/^{MAPK 25}, que están asociadas con el metabolismo del cartílago y la progresión de la OA. Los extractos de S. suberectus Dunn también inhiben la producción de quimiocinas^{proinflamatorias 26}. Además, las actividades antiinflamatorias y antioxidantes reportadas para Impatiens balsamina pueden ser relevantes para la patogénesis de la OA porque la inflamación crónica y el estrés oxidativo contribuyen a la degeneración del cartílago²⁷. Radix Angelicae Biseratae también se ha asociado con una mejora de la circulación sanguínea y el alivio de síntomas relacionados con la^{artritis 28,29}. Estudios limitados han investigado los posibles efectos terapéuticos de Jixueteng (Spatholobus suberectus Dunn), Haifengteng (Caulis Piperis Kadsurae) y Xiangfu (Cyperi Rhizoma) en la OA.

La predicción computacional basada en la red de IBP sugirió que la TBF puede ejercer efectos terapéuticos contra la OA mediante la regulación de las respuestas inflamatorias y la protección del cartílago articular, aunque estas predicciones requieren una validación experimental adicional. Los objetivos centrales con valores de grado relativamente altos en la red PPI incluían JUN, RELA, IL6, MAPK1 e IL10. Estudios previos han demostrado que JUN está asociada con el envejecimiento de los condrocitos y la progresión de la OA. Los ratones dobles mutantes JunB/Jun presentan infiltración inflamatoria en los tejidos articulares acompañada de destrucción ósea y periotitis³⁰. Los análisis transcriptómicos del cartílago osteoartrítico y la sinovio también han mostrado una reducción en la expresión^{de JUN 31}. Además, se ha observado una disminución en la expresión de la proteína JUN en modelos de rata OA inducidos por transección del ligamento cruzado anterior y en condrocitos^{senescentes 32}. Estudios previos sugirieron además que la señalización relacionada con JUN podría regular la degeneración del cartílago, la apoptosis, la autofagia y el metabolismo de la matriz extracelular en los condrocitos de la^{OA 33}. Estudios previos también han demostrado que los fragmentos derivados del ARN de transferencia regulan la proliferación y supervivencia de los condrocitos articulares a través de las vías de señalización asociadas a^{RELA 34}. Además, la regulación alcista del gen Sox9, combinada con la inhibición de la expresión de RELA en células estromales mesenquimales, aumentó las capacidades condrogénicas e inmunomoduladoras y ralentizó la progresión de la OA en modelos^{experimentales 35}. Estos hallazgos apoyan la posible relevancia de las vías de señalización relacionadas con JUN y RELA identificadas en el presente análisis computacional.

La IL6 es un mediador inflamatorio clave en la artrosis y desempeña un papel importante en el metabolismo del cartílago al influir tanto en la degradación como en los procesos de reparación. En condiciones inflamatorias crónicas de bajo grado, los niveles elevados de IL6 contribuyen a la senescencia de los condrocitos, a la reducción de la síntesis de la matriz cartilágica y a la alteración de la homeostasis del^{cartílago 36}. Estudios previos han demostrado que la señalización del receptor IL6/JAK2 participa en la regulación de la apoptosis celular senescente, y la eliminación dirigida de células senescentes puede atenuar la progresión de la^{OA 37}. Además, Li Q y colegas informaron que la regulación al alza de miR-186-5p regulaba las respuestas inflamatorias en los condrocitos estimulados por IL-1β, mientras que la inhibición de miR-186-5p aliviaba la progresión de la OA mediante la mejora de la expresión de^{MAPK1 38}. Estos hallazgos apoyan la posible implicación de las vías de señalización relacionadas con IL6 y MAPK1 identificadas en el presente análisis computacional.

IL10 desempeña un papel protector en la homeostasis del cartílago y puede contribuir al mantenimiento del microambiente del cartílago. Estudios previos han demostrado que IL10 inhibe la apoptosis condrocítica mediante la regulación de las vías apoptóticas mitocondriales, la reducción de la actividad de caspasas y la modulación de la relación Bax/^{Bcl-2 39}. Además, la IL10 se ha asociado con una reducción de la degradación de la matriz extracelular y una disminución de la expresión de factores relacionados con la degradación de la matriz, incluyendo MMP3, MMP13, ADAMTS4 y la sintasa inducible de óxido nítrico, en modelos⁴⁰ de cartílago articular comprimido. El análisis de enriquecimiento de vías KEGG en el presente estudio sugirió que las vías de señalización IL-17, TNF y factor-1 inducible por hipoxia (HIF-1) podrían estar asociadas con los efectos terapéuticos predichos de TBF contra la OA, aunque estas predicciones computacionales requieren confirmación experimental. Estudios previos han demostrado que la IL-17 contribuye a la progresión de la OA mediante la regulación de las respuestas inflamatorias y la actividad de las células^{sinoviales 41,42}. El aumento de la expresión de IL-17 también se ha correlacionado positivamente con la gravedad de la enfermedad en la^{OA 43} de la rodilla. El TNF-α es otro mediador inflamatorio importante asociado a la inflamación, dolor y degeneración del cartílago relacionados con la OA, y la inhibición de la señalización del TNF-α puede aliviar la progresión de la^{enfermedad 44}. Además, HIF-1α desempeña un papel importante en el metabolismo hipóxico de los condrocitos, la regulación de la matriz extracelular, la inflamación sinovial y la remodelación ósea subcondral en^{OA 45}. Estudios previos también han sugerido que la inhibición de la señalización relacionada con HIF-1α puede proteger la función de los condrocitos y reducir la degeneración^{del cartílago 46}. Estos hallazgos son coherentes con las vías de señalización identificadas mediante el presente análisis de enriquecimiento computacional.

Este estudio in silico tiene varias limitaciones importantes. En primer lugar, el análisis se basó en bases de datos públicas, que pueden contener información incompleta o sesgada sobre compuestos herbales y anotaciones de objetivos. Además, los métodos computacionales de predicción de objetivos implican una incertidumbre inherente, y las interacciones predichas identificadas en este estudio requieren verificación experimental. El análisis de acoplamiento molecular refleja un potencial teórico de unión más que una actividad fisiológica o farmacológica directa. Además, no se realizaron experimentos in vitro ni in vivo para validar las predicciones computacionales. Tampoco se evaluaron factores como la dosis de hierbas, la farmacocinética y la biodisponibilidad global de la fórmula combinada. Por lo tanto, todas las conclusiones derivadas del presente estudio deben considerarse predictivas y requerir confirmación experimental adicional.

El presente estudio, basado en la farmacología de redes y análisis de acoplamiento molecular, proporciona un marco predictivo para investigar los posibles mecanismos de la TBF frente a la OA. Los resultados sugirieron que la TBF puede regular múltiples objetivos relacionados con la OA mediante interacciones entre compuestos activos derivados de sus ocho hierbas constituyentes. Los objetivos identificados se enriquecieron en procesos biológicos y vías de señalización asociadas con la regulación inflamatoria, el metabolismo lipídico y la señalización relacionada con la hipoxia, incluyendo las vías IL-17, TNF y HIF-1. El análisis de acoplamiento molecular demostró además afinidades de unión favorables predichas entre la quercetina y los objetivos principales JUN, RELA, IL6, MAPK1 e IL10. En conjunto, estos hallazgos sugieren que la TBF puede ejercer efectos regulatorios multicomponentes y multi-objetivo contra la OA. Este estudio también proporciona una estrategia teórica y un marco metodológico para futuros estudios mecanicistas y validación experimental de fórmulas de MTC en la investigación de la AO.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
AutoDockTools	Software	Versión 1.5.7; The Scripps Research Institute	https://autodock.scripps.edu/
AutoDock Vina	Software	Versión 1.5.7; The Scripps Research Institute	https://autodock.scripps.edu/
función barplot	Función de visualización R	Paquete clusterProfiler	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/
clusterProfiler	Paquete R	Paquete Bioconductor para análisis de enriquecimiento	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/
CytoHubba	Plugin	Compatible con Cytoscape 3.10.2	https://apps.cytoscape.org/apps/cytohubba
Cytoscape	Software	Versión 3.10.2; Cytoscape Consortium	https://cytoscape.org/
DAVID	Base de datos	Base de datos para anotación, visualización y descubrimiento integrado	https://david.ncifcrf.gov/
función dotplot	Función de visualización R	Paquete clusterProfiler	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/
DrugBank	Base de datos	Universidad de Alberta	https://go.drugbank.com/
GeneCards	Base de datos	GeneCards Suite	https://www.genecards.org/
MicrobiomeAnalyst / MicrobiomeNet	Plataforma en línea	Plataforma de visualización de enriquecimiento en línea	https://microbiomenet.com/
OMIM	Base de datos	Herencia Mendeliana en línea en el hombre	https://www.omim.org/
PDB	Base de datos	Banco de Datos de Proteínas RCSB	https://www.rcsb.org/
PubChem	Base de datos	Centro Nacional de Información Biotecnológica	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/
PyMOL	Software	Versión 2.5.4	https://pymol.org/
R	Software	Versión 4.3.1; R Foundation for Statistical Computing	https://www.r-project.org/
STRING	Base de datos	Herramienta de búsqueda para la recuperación de genes/proteínas interactuantes	https://cn.string-db.org/
TCMSP	Base de datos	Base de datos de farmacología de sistemas de medicina tradicional china y plataforma de análisis	http://tcmspw.com/tcmsp.php
TTD	Base de datos	Base de datos de objetivos terapéuticos	https://db.idrblab.net/ttd/
UniProt	Base de datos	Recurso de proteínas universal	https://www.uniprot.org/
Venny	Software	Versión 2.1.0	https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html