Mecanismos de la fórmula 3 de Qu para mejorar la receptividad endometrial en SOP: una combinación de farmacología de redes y simulación de dinámica molecular

Resumen

Este protocolo pretende explorar el mecanismo por el cual QUF3 mejora la receptividad endometrial en el SOP mediante farmacología en red, acoplamiento y simulación de MD.

Resumen

La receptividad endometrial deteriorada es una de las principales causas de infertilidad en el síndrome de ovario poliquístico (SOP). La Fórmula 3 de Qu (QUF3) es una fórmula china de medicina herbal utilizada clínicamente para mejorar la receptividad endometrial en pacientes con SOP. Este estudio empleó farmacología de redes, acoplamiento molecular y simulaciones de dinámica molecular (MD) para investigar los mecanismos subyacentes. Se identificaron los componentes activos de QUF3 utilizando la base de datos TCMSP, y se extrajeron posibles objetivos relacionados con la receptividad endometrial y el SOP de DrugBank y otros recursos. Se construyeron una red de interacción compuesto-objetivo y una red de interacción proteína-proteína (PPI) mediante Cytoscape para identificar objetivos clave. Los objetivos principales fueron sometidos a análisis de enriquecimiento GO y KEGG. Se utilizaron acoplamientos moleculares, simulaciones MD, análisis de componentes principales (PCA), paisaje de energía libre (FEL) y matriz dinámica de correlación cruzada (DCCM) para evaluar las interacciones de enlace. De 91 ingredientes activos y 294 posibles objetivos farmacológicos, se identificaron 60 objetivos relacionados con enfermedades. La luteolina y la sesamin estuvieron entre los componentes farmacodinámicos clave. Se identificaron diez objetivos principales: AKT1, EGFR, TNF, TP53, IL6, BCL2, ESR1, IL1B, STAT3 y MMP9. El enriquecimiento KEGG reveló 132 vías de señalización, y el análisis GO identificó 678 entradas. Las simulaciones de MD indicaron que la unión entre los cinco principales componentes activos y sus respectivos objetivos era estable. PCA, FEL y DCCM demostraron además alta estabilidad termodinámica y rigidez estructural de estos complejos. En conclusión, QUF3 mejora la receptividad endometrial en SOP mediante interacciones multicomponentes, multiobjetivo y multivía. Este estudio proporciona una base teórica, desde una perspectiva de simulación computacional, para el desarrollo de terapias específicas de medicina herbal china para la infertilidad relacionada con el SOP, y podría tener implicaciones positivas para mejorar los resultados del embarazo en mujeres con SOP en el futuro.

Introducción

El síndrome de ovario poliquístico (SOP) es uno de los trastornos endocrinos más comunes en^{mujeres 1}. Sus principales características incluyen disfunción ovulatoria crónica persistente, hiperandrogenemia clínica o bioquímica y morfología ovárica poliquística, con manifestaciones clínicas como amenorrea, infertilidad, hirsutismo, acné y obesidad. En los últimos años, los avances en la inducción de la ovulación y la tecnología de reproducción asistida (TAR) han mejorado significativamente las tasas de embarazo en pacientes con SOP; sin embargo, los resultados del embarazo siguen siendo peores que en mujeres^{sanas 2,3}. La receptividad endometrial es un factor clave que influye en los resultados de la^TAR. La receptividad endometrial se refiere a la capacidad del endometrio para aceptar un embrión en una etapa fisiológica específica, lo que desempeña un papel decisivo en la implantación y el desarrollo posterior^{del embrión 5,6}. Las condiciones patológicas comúnmente observadas en el SOP, como la obesidad, la resistencia a la insulina y la inflamación crónica, pueden afectar la receptividad endometrial, dificultar la implantación de óvulos fertilizados y el desarrollo embrionario, y finalmente conducir a la infertilidad y al aborto^{espontáneo 7,8}. No obstante, los mecanismos reguladores que subyacen a la receptividad endometrial en el SOP siguen siendo en gran medida poco claros, y la red de interacción entre los distintos factores que influyen aún no ha sido aclarada. La Fórmula 3 de Qu (QUF3), una fórmula china de medicina herbal utilizada clínicamente para mejorar la receptividad endometrial en pacientes con SOP, está respaldada por sólidas teorías clásicas de la medicina tradicional china (MTC) en ginecología. La fórmula consta de Paeoniae Radix Alba (Baishao), Rehmanniae Radix Praeparata (Shudihuang), Cuscutae Semen (Tusizi), Fructus Ligustri Lucidi (Nvzhenzi), Herba Taxilli (Sangjisheng), Radix Salviae (Danshen) y Cornus Officinalis Sieb. et Zucc. (Shanzhuyu) en una proporción de 2:4:3:4:3:3:2:2, preparado por extracción de etanol. QUF3 ejerce efectos sinérgicos de múltiples hierbas, tonificando el riñón, enriqueciendo la esencia, nutriendo la sangre y promoviendo la circulación^{sanguínea 9}. Su eficacia clínica para mejorar la receptividad endometrial en pacientes con SOP ha sido bien validada, pero sus mecanismos farmacológicos principales aún están por investigarse.

La farmacología de redes es un enfoque analítico basado en biología de sistemas que construye redes multinivel "hierba-componente-objetivo-enfermedad" para revelar, desde una perspectiva holística, los efectos de intervención de los fármacos sobre las redes de enfermedades. A diferencia del modelo tradicional de "fármaco único-objetivo único", la farmacología de redes puede capturar de forma exhaustiva las características sinérgicas de las acciones "multicomponente, multiobjetivo y múltiples vías" de las fórmulas de MTC, lo que la hace especialmente adecuada para investigar los complejos mecanismos de la MTC. La simulación de dinámica molecular (MD), en cambio, es una técnica computacional basada en la mecánica newtoniana que simula, a nivel atómico, los cambios conformacionales y el comportamiento dinámico de los complejos proteína-ligando a lo largo del tiempo. En comparación con el acoplamiento molecular estático, la simulación MD puede evaluar parámetros dinámicos, como la estabilidad de la unión, los paisajes de energía libre y la rigidez estructural, proporcionando así una evaluación más realista de las interacciones entre moléculas de fármacos y proteínas objetivo. La farmacología de redes es adecuada para el cribado global de posibles objetivos y vías de fórmulas de MTC, mientras que la simulación de la MD puede evaluar dinámicamente la estabilidad de unión entre componentes clave y proteínas objetivo. La combinación de estos dos enfoques permite un análisis más fiable de los mecanismos sinérgicos multicomponente y multiobjetivo de las fórmulas de la MTC. Basándose en esta lógica, este estudio empleó un enfoque combinado de farmacología de redes y simulación de DM para explorar sistemáticamente los posibles mecanismos farmacológicos subyacentes a la mejora de la receptividad endometrial en QUF3 en pacientes con SOP.

Este flujo de trabajo computacional combinado es más adecuado para la exploración inicial de los mecanismos multicomponente y multiobjetivo de fórmulas herbales chinas o productos naturales, especialmente para sistemas complejos en los que los ingredientes activos y objetivos son en gran medida desconocidos. Los usuarios deben tener conocimientos básicos de bioinformática, incluyendo búsqueda en bases de datos y análisis de redes, así como la capacidad de realizar análisis fundamentales de biología computacional como acoplamiento molecular y simulaciones de dinámica molecular utilizando paquetes de software comunes. Se recomienda un entorno informático basado en Linux con al menos 16 GB de RAM, junto con acceso a bases de datos públicas relevantes como la Plataforma de Datos y Análisis de Sistemas de Farmacología de Medicina Tradicional China (TCMSP), PubChem y UniProt. Todo el software utilizado en este flujo de trabajo (por ejemplo, Cytoscape, AutoDockTools, GROMACS) es de código abierto o gratuito para uso académico, y los lectores pueden obtenerlo a partir de la información proporcionada en la Tabla de Materiales.

Protocolo

Cribado de constituyentes activos y posibles objetivos de QUF3
Los componentes químicos activos de Baishao, Shudihuang, Tusizi, Nvzhenzi, Sangjisheng, Danshen y Shanzhuyu en el medicamento QUF3 fueron identificados mediante el TCMSP el 1 de abril^{de 2025 10}. Los ingredientes activos fueron evaluados preliminarmente en función de las condiciones de biodisponibilidad oral (OB) ≥30% y semejanza con fármacos (DL) ≥ 0,18¹¹. Estos umbrales se eligieron como criterios empíricos estándar para asegurar una absorción suficiente y propiedades similares a las de los fármacos. La secuencia canónica SMILES de cada compuesto fue buscada en la base de datos PubChem, y la secuencia resultante se utilizó para predecir los compuestos objetivos en la base de datos en línea Swiss Target Prediction, seguida de la recopilación de nombres de genes de proteínas objetivo e IDs UniProt de la base^{de datos UniProt} 12,13,14. Como punto de control intermedio, se registró el número de objetivos únicos obtenidos tras la deduplicación.

Identificación de objetivos de acción para la receptividad endometrial en el SOP
Las palabras clave "síndrome de ovario poliquístico" y "receptividad endometrial" se utilizaron como términos de búsqueda en las bases de datos Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), DrugBank, Therapeutic Target Database (TTD) y GeneCards para identificar posibles objetivos 15,16,17,18. Para las GeneCards, solo se conservaron los objetivos con una puntuación de relevancia >5; para las demás bases de datos, se incluían todos los objetivos recuperados. Tras la fusión y eliminación de entradas duplicadas, el número de objetivos únicos asociados a la enfermedad se registró como una salida intermedia.

Construcción de componentes y objetivos en red
Los objetivos de intersección se generaron introduciendo los posibles objetivos para QUF3, SOP y receptividad endometrial en una herramienta online de diagrama de Venn. Estos objetivos de intersección se consideraron como los objetivos clave a través de los cuales QUF3 ejerce su eficacia para mejorar la receptividad endometrial en el SOP. Posteriormente, se creó una red "herba-constituyente-objetivo" (H-C-T) al emparejar estos objetivos de intersección con los datos activo de constituyente-objetivo de QUF3 utilizando Cytoscape¹⁹. La red se visualizó utilizando la herramienta "Network Analyzer".

Construcción de redes de interacción proteína-proteína (PPI)
Los genes objetivo potenciales de QUF3 para mejorar la receptividad endometrial en SOP fueron enviados como entrada a la plataforma de datos^{STRING 20}. La especie se estableció en "Homo sapiens" y el umbral de confianza en "confianza media (0,4)", lo que generó un archivo TSV con datos de interacción proteína-proteína. Este archivo se importaba luego al software de análisis de red para construir y analizar la red^{PPI 21}. La importancia del nodo en la red se indica con el valor de "Grado": un valor de Grado más alto indica un nodo más significativo. Posteriormente, los principales ingredientes activos se clasificaron por grado y los 10 principales objetivos principales se seleccionaron en función de la clasificación de grado.

Análisis de la ontología génica (GO) y la Enciclopedia de Enriquecimiento de Vías Genéticas y Genómicas de Kioto (KEGG)
Se realizaron análisis de enriquecimiento de las vías GO y KEGG utilizando la base de datos DAVID para explorar las vías biológicas y los mecanismos por los cuales QUF3 mejora la receptividad endometrial en el SOP²². La especie se estableció en "Homo sapiens" y el umbral de significación se fijó en P < 0,05. El análisis GO abarcó procesos biológicos (BP), componentes celulares (CC) y función molecular (MF)²³. Los resultados se ordenaron según el número de blancos enriquecidos. Luego se excluyeron las vías relacionadas con el metabolismo humano y las enfermedades, y se seleccionaron las 20 mejores vías KEGG para su visualización. Posteriormente se construyó una red multidimensional "vía componente-enfermedad-KEGG" utilizando software de análisis de red.

Análisis de acoplamiento molecular
Los 10 principales componentes activos y los 10 principales objetivos principales fueron seleccionados para el análisis de acoplamiento molecular utilizando AutoDockTools y el software^{PyMOL 24,25}. Los archivos PDB de los objetivos clave se descargaron de una base de datos de estructuras^{proteicas 26}, y los archivos SDF de los principales componentes activos se obtuvieron de una base de datos química²⁷. Las moléculas de proteína se preprocesaron después mediante software de acoplamiento molecular, que incluyó desenal, hidrogenación y cálculo de carga. El acoplamiento semi-flexible se realizó utilizando una caja de rejilla que cubría todo el sitio de unión a proteínas. El proceso de acoplamiento se consideraba exitoso cuando la energía de enlace era negativa y la desviación cuadrática media (RMSD) de la pose superior era ≤ 2,0 Å. Tras el acoplamiento, los resultados de los componentes activos principales de QUF3 con los objetivos centrales se visualizaron utilizando software de visualización molecular.

Simulaciones de dinámica molecular (MD)
Las simulaciones de MD del complejo proteína–ligando se realizaron utilizando el software GROMACS para explorar la interacción entre receptores y^{ligandos 28,29}. El campo de fuerzas ámbar99sb-ildn y el campo de fuerzas ámbar general (GAFF) se utilizaron para generar los parámetros y topologías de proteínas y ligandos, respectivamente. El tamaño de la caja de simulación se estableció de modo que la distancia entre cada átomo de proteína y el borde de la caja fuera mayor de 1,0 nm. La caja se llenó con un disolvente explícito usando el modelo simple de carga puntual (moléculas de agua SPC216), y las moléculas de agua se reemplazaron por contraiones Na⁺ y Cl⁻ para hacer que el sistema de simulación fuera eléctricamente neutro. Todo el sistema fue optimizado mediante el método de descenso más pronunciado para reducir contactos irrazonables o solapamientos átomos. Se logró suficiente pre-equilibrio del sistema de simulación realizando conjuntos NVT y NPT para 100 ps cada uno a 300 K y 1 bar, respectivamente. Posteriormente, se realizó una simulación MD de 100 ns bajo condiciones periódicas de frontera, con temperatura (300 K) y presión (1 bar) controladas por los métodos de reescala V y Parrinello-Rahman, respectivamente^{de 30}. Las ecuaciones newtonianas de movimiento se resolvieron usando el integrador leapfrog con un paso de tiempo de 2 fs. Las interacciones electrostáticas de largo alcance se calcularon usando el método Particle Mesh Ewald (PME) con un espaciamiento de Fourier de 0,16 nm, y todas las longitudes de enlace se restringieron mediante el método LINCS. El software VMD se utilizaba para mostrar, analizar y animar las trayectorias³¹. La energía libre de unión de cada compuesto se calculaba usando un script de cálculo de energía libre de enlace.

Análisis de componentes principales (PCA), paisaje de energía libre (FEL) y análisis de matriz dinámica de correlación cruzada (DCCM)
La PCA se realizó utilizando software de simulación MD para analizar los movimientos conformacionales dominantes de complejos apo y ligando-unidos. Se generaron matrices de covarianza de fluctuaciones atómicas Cα, a partir de las cuales se obtuvieron vectores propios (movimientos colectivos) y valores propios (magnitud del movimiento^{) 32}. A través de este análisis se identificaron regiones dinámicas clave y la flexibilidad estructural asociada a la unión de ligandos. Las trayectorias moleculares se proyectaron sobre los dos primeros componentes principales (PC1 y PC2) utilizando la herramienta GMX Anaeig, capturando así los movimientos^{esenciales 33}. Solo se utilizó los 100 ns finales equilibrados (fase estable RMSD) para los cálculos de PCA y FEL. FEL se derivó de los datos PCA usando el simulador GMX para calcular la energía^{libre de Gibbs 34}, revelando conformaciones estables y mínimos de energía que reflejan la diversidad conformacional y las transiciones de estado. Se realizó un análisis dinámico de matriz de correlación cruzada (DCCM) de átomos de Cα para evaluar la dinámica estructural y el acoplamiento de movimiento entre^{residuos 35}. Este análisis esclareció la estabilidad, las interacciones intermoleculares y los movimientos colectivos de los complejos proteína-ligando. El coeficiente de correlación cruzada Cij entre los residuos i y j se calculó como:

En la fórmula, las letras i y j representan los átomos de Cα de dos residuos. Cuando el valor de Cij es positivo y mayor que cero; los dos átomos que se mueven en la misma dirección se consideran en movimiento correlacionado. Cuando el valor de Cij es negativo y menor que cero, los dos átomos que se mueven en direcciones opuestas se consideran en movimiento anticorrelacionado. Un valor Cij de cero indica que no hay relación entre los movimientos de los dos átomos. Además, los valores de Cij superiores a 0,7 se interpretaron como movimientos fuertemente correlacionados (positivos) o fuertemente anticorrelacionados (negativos). Para verificar la convergencia, se examinaron los perfiles RMSD y Rg. Los perfiles estables confirmaron que los últimos 100 ns eran suficientes para el análisis DCCM. Estos patrones de movimiento revelaron cómo la unión de ligandos modula la comunicación intramolecular y los reordenamientos de dominios. Para asegurar la estabilidad dinámica y la convergencia, solo se analizaron los últimos 100 ns de trayectorias equilibradas y se visualizaron mapas de correlación para resaltar regiones con interacción dinámica significativa.

Para explicar mejor la energía de interacción entre proteínas y ligandos, se utilizó un guion de cálculo de energía libre de unión para calcular la energía de unión de todos los complejos proteína-ligando en equilibrio. En la aplicación del método de cálculo de energía libre^{de enlace 36}, la energía total de enlace se descomponía en cuatro partes independientes: interacción electrostática, interacción de van der Waals, solvatación polar e interacción de solvatación no polar. El término de solvtación no polar suele denominarse SASA.

Conclusión del punto final procedimental para la selección de objetivo y vía
Al final del flujo de trabajo, se seleccionaron los objetivos y rutas validados finales en función de los siguientes criterios: objetivos principales con los 10 primeros valores de grado en la red PPI, y constituyentes activos clave con los 10 primeros valores de grados en la red H-C-T. Para las vías KEGG, tras excluir aquellas relacionadas con el metabolismo humano y las enfermedades, las 20 principales vías se clasificaron y seleccionaron en función del número de dianas enriquecidas. Se utilizaron resultados de simulación de MD para confirmar la unión estable entre los componentes superiores y los objetivos principales. Estos pasos definían colectivamente la salida final del protocolo.

Resultados

Cribado de constituyentes activos y posibles objetivos de QUF3
Utilizando OB ≥ 30% y DL ≥ 0,18 como criterios de cribado, tras buscar en la base de datos TCMSP, QUF3 identificó 126 componentes químicos. Entre ellos, Paeoniae Radix Alba (Baishao) contenía 13 constituyentes activos, Rehmanniae Radix Praeparata (Shudihuang) 2, Cuscutae Semen (Tusizi) 13, Fructus Ligustri Lucidi (Nvzhenzi) 13, Herba Taxilli (Sangjisheng) 2, Radix Salviae (Danshen) 65, Cornus Officinalis Sieb. Et Zucc. (Shanzhuyu) contenía...

Discusión

Cada vez hay más evidencia de que el endometrio de pacientes con SOP presenta una función deteriorada, lo que puede correlacionarse con mayores tasas de fallo de implantación y resultados adversos en el embarazo⁴⁰. Las diferencias endometriales en mujeres con SOP se caracterizan principalmente por una disminución de la expresión de pinópodos, sistemas de canales nucleolares, receptores de estrógeno y receptores de progesterona durante la ventana de implantación (W...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (Version 2.3)	Lab of Systems Pharmacology	https://www.tcmsp-e.com/load_intro.php?id=43	Base de datos para el cribado de componentes activos
Swiss Target Prediction online database (2019 version)	Molecular Modelling Group, University of Lausanne & SIB Swiss Institute of Bioinformatics	http://www.swisstargetprediction.ch/	Base de datos de predicción de objetivos en línea
PubChem database	National Library of Medicine, NIH	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/	Base de datos química para la recuperación de SMILES/SDF de compuestos
UniProt database	NIH	https://www.uniprot.org/uniprotkb	Base de datos de proteínas para IDs UniProt y nombres de genes
Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM)	Johns Hopkins University	https://www.omim.org/	Base de datos de objetivos de enfermedades
DrugBank	University of Alberta	https://www.drugbank.ca/	Base de datos de objetivos de enfermedades
Therapeutic Target Database (TTD)	Zhejiang University	https://ttd.idrblab.cn/	Base de datos de objetivos de enfermedades
GeneCards (Version 5.26)	Weizmann Institute of Science, LifeMap Sciences	https://www.genecards.org/	Base de datos de objetivos de enfermedades (puntuación de relevancia >5)
Venny visualization platform (Version 2.1.0)	Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC)	https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/	Herramienta en línea de diagrama de Venn para la visualización de intersección de objetivos
Cytoscape (Version 3.10.3)	National Resource for Network Biology, NHGRI	https://cytoscape.org/	Software de análisis y visualización de redes para H-C-T, PPI y redes de vías
STRING database (Version 12.0)	STRING Consortium	https://string-db.org/	Base de datos de interacción proteína-proteína para la construcción de redes PPI
DAVID database (Version v2025-2)	U.S. Department of Health & Human Services, NIH	https://davidbioinformatics.nih.gov/	Base de datos de análisis de enriquecimiento genético para GO y KEGG
AutoDockTools (Version 1.5.7)	The Scripps Research Institute	https://autodock.scripps.edu/	Software de acoplamiento molecular para preprocesamiento y cálculo
PyMOL software (Version 3.0.3)	Schrödinger	https://pymol.org/	Software de visualización molecular para la visualización del acoplamiento
Protein Data Bank (PDB)	RCSB	https://www.rcsb.org/	Base de datos de estructura de proteínas para descargar archivos PDB de objetivos
GROMACS (Version 2023.2)	GROMACS development team	https://www.gromacs.org/	Software de simulación de dinámica molecular
VMD (Version 1.9.3)	University of Illinois	https://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/	Software de visualización molecular y análisis de trayectoria
gmx_MMPBSA	Open-source (GitHub)	https://github.com/Valdes-Tresanco-MS/gmx_MMPBSA	Herramienta de cálculo de energía libre de unión a partir de trayectorias MD
Science Data Bank	Chinese Academy of Sciences, Computer Network Information Center	https://www.scidb.cn/	Repositorio de datos científicos para la disponibilidad y depósito de datos