Este protocolo proporciona un flujo de trabajo estandarizado y reproducible para evaluar la capacidad proliferativa y la diferenciación osteogénica y odontogénica de células madre dentales humanas cultivadas sobre andamios de nanomateriales, utilizando ensayos estandarizados (actividad de fosfatasa alcalina, inmunofluorescencia de RANKL [osteogénica] e inmunofluorescencia de DMP-1 [odontogénica]) y estrategias de normalización para garantizar la comparabilidad entre estudios.
Artículo de método
Un protocolo in vitro estandarizado para evaluar la diferenciación y proliferación de células madre de la pulpa dental humana sobre andamios de nanomateriales
En este artículo
Resumen
Resumen
La evaluación confiable de la diferenciación osteogénica y odontogénica, así como de la proliferación de células madre, es fundamental para analizar el desempeño biológico de las estrategias regenerativas basadas en andamiajes. Sin embargo, la variabilidad en los protocolos experimentales, la selección de ensayos y la interpretación de los datos a menudo limita la reproducibilidad y la comparación entre estudios. El protocolo descrito en este artículo presenta un flujo de trabajo estandarizado y reproducible para la evaluación in vitro de la diferenciación osteogénica y odontogénica, así como de la capacidad proliferativa, de células madre cultivadas sobre andamiajes de biomateriales. La diferenciación osteogénica se evalúa mediante la actividad enzimática de fosfatasa alcalina (ALP) y la inmunofluorescencia del ligando del activador del receptor del factor nuclear κB (RANKL), mientras que la diferenciación odontogénica se evalúa mediante inmunofluorescencia de la proteína 1 de la matriz dentinaria (DMP-1); ambos puntos finales proteicos se cuantifican utilizando la metodología estandarizada del puntaje H. Se detallan parámetros experimentales críticos, incluyendo la densidad de siembra celular, cronogramas de inducción, condiciones de los ensayos, estrategias de normalización (incluyendo la actividad de ALP normalizada por proteína, viabilidad al MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro] normalizada por célula y el puntaje H de inmunofluorescencia) y enfoques de análisis de datos, junto con orientaciones para la resolución de problemas con el fin de minimizar la variabilidad técnica. Esta metodología se ha aplicado como un marco estandarizado en múltiples estudios experimentales basados en andamiajes, demostrando robustez y reproducibilidad. Al proporcionar un marco integral y validado, este artículo tiene como objetivo facilitar la evaluación estandarizada de las interacciones entre células madre y andamiajes y mejorar la comparabilidad entre estudios regenerativos preclínicos.
Introducción
La endodoncia regenerativa representa un cambio de paradigma en odontología, centrado en la restauración de la vitalidad de la pulpa dental mediante el uso de células madre, factores de crecimiento y andamios1,2. Mantener la vitalidad de la pulpa es esencial para la función sensorial y la respuesta inmunitaria, y es particularmente crucial en el manejo de dientes inmaduros con pulpas necróticas para permitir el desarrollo continuo de la raíz2.
Las células madre de la pulpa dental humana (DPSC) y las células madre de la papila apical (SCAP) son candidatas principales para estos procedimientos debido a su alto potencial proliferativo, capacidad de autorrenovación, propiedades inmunosupresoras y habilidad para diferenciarse en células similares a odontoblastos bajo condiciones microambientales adecuadas, lo que las convierte en candidatas altamente viables para aplicaciones futuras en medicina regenerativa e intervenciones terapéuticas basadas en células3,4,5.
Aunque se han explorado materiales formulados convencionalmente, como los cementos a base de silicato de calcio, evidencia reciente sugiere que la modificación con nanopartículas puede influir sustancialmente en las interacciones entre biomateriales y células6. Los biomateriales nanoestructurados podrían proporcionar un microentorno más biomimético, mejorando potencialmente la adhesión de células madre y la diferenciación específica por linaje7. Sin embargo, el comportamiento biológico de materiales novedosos, como el NeoMTA2 en forma nanoparticulada, sigue siendo insuficientemente comprendido en comparación con materiales establecidos, como la nanohidroxiapatita8. Este protocolo aborda la necesidad de un marco metodológico estandarizado para evaluar con precisión y reproductibilidad estas interacciones.
Este marco estandarizado es particularmente adecuado para estudios que evalúan nuevos biomateriales o andamios de nanomateriales en condiciones biológicas idénticas, donde la comparabilidad entre estudios es fundamental. Ofrece ventajas frente a los enfoques de un solo ensayo al integrar el cribado de viabilidad (MTT), el compromiso osteogénico temprano (actividad de ALP) y la diferenciación a nivel de proteínas (puntaje H por inmunofluorescencia) dentro de un único flujo de trabajo. Los investigadores que utilicen tinción convencional con rojo de alizarina o ensayos de un solo punto temporal podrían beneficiarse al adoptar este marco multiparamétrico para reducir el sesgo del observador y mejorar la resolución cuantitativa. Sin embargo, este protocolo no está destinado para cultivos de organoides tridimensionales, sistemas de co-cultivo o modelos de células madre derivadas de animales sin una adaptación adecuada. Los investigadores que requieran perfiles de expresión génica (por ejemplo, RT-qPCR para RUNX2, OCN o DSPP) deben complementar este flujo de trabajo con ensayos moleculares, ya que el protocolo actual se centra exclusivamente en puntos finales proteicos y enzimáticos.
Para captar de manera integral la capacidad bifuncional de diferenciación de las células madre dentales, este protocolo emplea dos marcadores complementarios de inmunofluorescencia que reflejan puntos finales biológicos distintos. Se utiliza RANKL (ligando del activador del receptor del factor nuclear kappa-B) como marcador del compromiso con la línea osteogénica: su expresión en células similares a osteoblastos refleja la señalización de mineralización dependiente de iones de calcio y la activación de células formadoras de hueso, lo cual es consistente con su uso en varios estudios que evalúan SCAPs4,8,9. Paralelamente, se utiliza DMP-1 (proteína de matriz dentinaria-1) como marcador específico de diferenciación odontogénica/dentinogénica: su sobreexpresión en células similares a odontoblastos refleja la inducción de la formación de matriz dentinaria y la reparación de tejidos duros específicos del pulpo, siendo particularmente relevante cuando la población celular objetivo son las DPSCs10. Al cuantificar tanto RANKL como DMP-1 dentro del mismo marco experimental mediante la metodología del puntaje H, este protocolo permite a los investigadores distinguir el compromiso osteogénico del odontogénico; dos resultados superpuestos pero mecanísticamente distintos de las interacciones entre células madre y andamiaje, sin necesidad de diseños experimentales separados.
Protocolo
Este protocolo fue aprobado por el Comité Ético de la Facultad de Odontología de la Universidad Ain Shams con el número de aprobación FDASU-Rec IM112105. Todos los procedimientos que involucraron tejidos humanos se realizaron cumpliendo con la Declaración de Helsinki. Se obtuvieron consentimientos informados por escrito de todos los participantes antes de la extracción dental y la obtención de células madre.
1. Preparación y caracterización de nanomateriales
- Sintetice nanomateriales según requisitos específicos10,11. Para Nano-NeoMTA2, muela el polvo utilizando un molino planetario de bolas (ver Tabla de Materiales) durante 10 h a 350 rpm con intervalos de 3 min encendido/apagado. Utilice una relación de masa bola:polvo de 10:1 con bolas de molienda de circonia (diámetro de 5 mm) en un frasco de molienda de circonia. Verifique el tamaño final de las partículas mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) (objetivo: <200 nm) antes de continuar.
ADVERTENCIA: El polvo de NeoMTA2 puede causar irritación respiratoria si se inhala. Realice todos los pasos de molienda en seco dentro de una campana extractora certificada, utilizando un respirador N95, gafas de seguridad y guantes de nitrilo. - Prepare la nanohidroxiapatita mediante un método de precipitación química en húmedo8,11,12: 10Ca(NO₃)₂ + 6(NH₄)₃PO₄ + 8NH₄OH → Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂ + 20NH₄NO₃ + 6H₂O. Prepare 1 L de solución de nitrato de calcio 0,5 M y 0,6 L de solución de fosfato de amonio 0,3 M, ambas en agua desionizada. Añada gota a gota la solución de nitrato de calcio a la solución de fosfato de amonio a aproximadamente 2–3 mL/min bajo agitación continua a 400 rpm y caliente a 70 °C, manteniendo un pH de 10–12 mediante la adición gota a gota de hidróxido de amonio8.
ADVERTENCIA: El hidróxido de amonio es corrosivo y libera vapores tóxicos de amoníaco. Manipúlelo únicamente en una campana extractora química. Use guantes resistentes a ácidos, gafas protectoras contra salpicaduras y una bata de laboratorio. En caso de contacto con la piel, enjuague inmediatamente con agua durante ≥15 min. - Someta el precipitado de apatita resultante a un tratamiento hidrotermal en autoclave a 140 °C y 0,3 MPa durante 2–3 h10. Liofilice el precipitado purificado a -50 °C bajo vacío de ≤0,05 mbar durante 48 h8.
- Prepare nanopartículas de vidrio bioactivo 45S5 mediante el método sol-gel como sigue.
- Prepare la solución precursora mezclando 40 mL de ortosilicato de tetraetilo (TEOS) con 10 mL de ácido nítrico 2 M (HNO₃) como catalizador ácido en un vaso de polipropileno bajo agitación continua a 300 rpm a temperatura ambiente.
- Después de 30 min, añada nitrato de calcio tetrahidratado (Ca(NO₃)₂·4H₂O) y nitrato de sodio (NaNO₃) para alcanzar la composición molar objetivo: 45 mol% SiO₂, 24,5 mol% CaO, 24,5 mol% Na₂O y 6 mol% P₂O₅. Añada fosfato de trietilo (TEP) como precursor de fósforo.
- Agite a temperatura ambiente durante 24 h. Envejezca el gel a 60 °C durante 24 h en un recipiente sellado. Seque a 120 °C durante 24 h. Calcine en un horno mufla a 650 °C durante 3 h (velocidad de rampa: 2 °C/min). Muela y confirme la composición de fases mediante TEM y difracción de rayos X (XRD)4,9.
ADVERTENCIA: El TEOS y el etanol son inflamables. El HNO₃ es corrosivo. Realice todos los procedimientos en una campana extractora, lejos de fuentes de ignición.
- Caracterice todas las nanopartículas preparadas mediante TEM de alta resolución y XRD para confirmar el tamaño de partícula y la cristalinidad8. Registre el tamaño medio de partícula, el índice de politispersión (PDI) y el potencial zeta mediante dispersión dinámica de luz (DLS) para confirmar la estabilidad coloidal. Acepte lotes con tamaño medio de partícula <200 nm y potencial zeta <−15 mV o >+15 mV.
2. Recolección y cultivo de células madre
- Obtenga DPSCs o SCAPs de terceros molares mandibulares incluidos frescos tras obtener el consentimiento informado por escrito10. Procese los dientes extraídos dentro de las 2 h posteriores a la extracción y transpórtelos en solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) a 4 °C.
NOTA: Los criterios de elegibilidad del donante incluyen adultos sistémicamente sanos de 18 a 35 años, no fumadores, sin antecedentes de uso de antibióticos en los últimos 3 meses, sin enfermedad periodontal y sin evidencia radiográfica de patología periapical. - Isole las células mediante el método de digestión enzimática9. Pique el tejido dental en fragmentos de 1–2 mm y digiera con una solución de colagenasa tipo I a una concentración de 3 mg/mL en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) sin suero durante 1 h a 37 °C con agitación continua a 60 rpm en una plataforma oscilante8. Neutralice con medio de cultivo completo y filtre a través de un tamiz celular de 70 µm.
ADVERTENCIA: La colagenasa tipo I puede contener endotoxinas. Utilice únicamente colagenasa de grado para cultivo de tejidos y libre de endotoxinas. Use guantes y evite la inhalación. - Siembre la suspensión de células individuales en frascos de 75 cm2 a una densidad inicial de 1 × 104 células/cm2 con medio de cultivo completo compuesto por DMEM, 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina (Tabla de Materiales)8.
- Incube los frascos a 37 °C en una atmósfera de 5% CO₂8. Monitoree el crecimiento y la contaminación diariamente utilizando un microscopio invertido de contraste de fases10. Cambie el medio de cultivo cada 48–72 h. Descarte cualquier frasco que muestre signos de contaminación (turbidez, cambio de color, morfología celular irregular).
- Recolecte las células tras el tercer pase, cuando alcancen aproximadamente un 70–80% de confluencia8. Para el pase, aspire el medio, enjuague con PBS y desprenda las células utilizando tripsina-EDTA al 0,25% a 37 °C durante 3–5 min. Neutralice con medio de cultivo completo, centrifugue a 300 x g durante 5 min y resiembra a 1 × 104 células/cm2. Utilice únicamente células entre el pase 3 y el pase 6 para mantener la estabilidad fenotípica.
3. Caracterización de células madre
- Evalúe el inmunofenotipo de las células aisladas mediante citometría de flujo8,10. Caracterice las células en el tercer pase. Incluya un control negativo sin teñir y controles de compensación monocromáticos para cada fluorocromo utilizado.
- Ajuste el recuento celular a 106/mL en PBS. Centrifugue a 800 x g durante 10 min y lave el sedimento dos veces con PBS8,10.
- Marque las células con anticuerpos antihumanos para marcadores mesenquimales (CD44, CD43) y marcadores hematopoyéticos (CD45) a las diluciones recomendadas por el fabricante (típicamente 1:100 en PBS que contiene 1% de albúmina sérica bovina (BSA)) (Tabla de Materiales)8,10. Incube a 4 °C durante 45 min en la oscuridad. Lave dos veces con PBS y resuspenda en 300 µL de PBS para la adquisición.
- Analice las células utilizando software de análisis de citometría de flujo (Tabla de Materiales) para evaluar el inmunofenotipo (expresión de CD44 y CD73, con CD45 como marcador de exclusión hematopoyética). Aplique un encuadre secuencial: (a) encuadre por dispersión (FSC-A vs. SSC-A); (b) exclusión de dobletes (FSC-H vs. FSC-A); (c) puertas específicas para cada fluorocromo establecidas frente a los controles sin teñir. Reporte el porcentaje de células positivas para cada marcador junto con la estrategia de encuadre.
4. Determinación de la concentración segura del material (concentración efectiva media, EC₅₀)
- Determine la CE₅₀ utilizando software de análisis estadístico (GraphPad Prism 9). Ajuste los datos de dosis-respuesta a una curva sigmoidea de regresión no lineal (modelo logístico de cuatro parámetros: Y = Inferior + (Superior − Inferior) / (1 + 10^((LogCE₅₀ − X) × Pendiente de Hill))). Informe el valor de CE₅₀ en µg/mL con un intervalo de confianza del 95 %8.
- Prepare diluciones seriadas de los nanomateriales (50, 25, 12,5, 6,25, 3,12 y 1,56 µg/mL) en 1 mL de PBS. Agite la suspensión madre durante 30 s, luego sométala a sonicación (sonicador de sonda, 40 W, 30 s encendido/10 s apagado durante 3 ciclos a 4 °C) para asegurar una suspensión homogénea. Esterilice con luz UV en una cabina de seguridad biológica bajo luz UV durante 30 min.
- Cultive células madre a una densidad de 1 × 104 células/pocillo en placas de 96 pocillos durante 72 h con las diferentes concentraciones y cuente las células viables utilizando azul de tripano para calcular la CE₅₀ mediante el modelo logístico de cuatro parámetros descrito en el paso 4.1.
- Realice los experimentos por triplicado (n = 3 pocillos independientes por concentración) con al menos tres réplicas biológicas. Reporte los valores de CE₅₀ como media ± DE y calcule el coeficiente de variación (CV %) entre las réplicas (CV aceptable <15 %).
5. Evaluación de la diferenciación osteogénica y odontogénica
NOTA: Esta sección evalúa dos vías de diferenciación complementarias mediante ensayos de inmunofluorescencia paralelos a partir de la misma preparación celular. RANKL (paso 5.5) sirve como marcador osteogénico; DMP-1 (paso 5.6) sirve como marcador odontogénico. Ambos se cuantifican mediante la misma metodología del puntaje H (paso 5.8). Realice ambos ensayos en cubreobjetos separados preparados simultáneamente.
- Siembre células madre en placas de seis pocillos a una densidad de 4,5 × 105 células/pocillo. Permita que las células se adhieran durante 24 h en medio de cultivo completo antes de iniciar la diferenciación.
- Asigne las muestras en cuatro grupos: control negativo (DMEM solo), control positivo (medio de diferenciación osteogénica/odontogénica) y grupos experimentales (nanomateriales en concentraciones seguras derivadas de la CE₅₀).
- Prepare el medio de diferenciación osteogénica suplementando el DMEM con 10 % de FBS, 1 % de penicilina/estreptomicina, 10 mM de β-glicerofosfato, 50 µg/mL de ácido ascórbico (L-ascorbato-2-fosfato) y 100 nM de dexametasona. Cambie el medio cada 48 h. Incube durante 72 h a 37 °C y 5 % de CO₂.
- Medición de la actividad de ALP
- Siembre células en placas de cultivo de 24 pocillos a 1 × 104 células/pocillo e incube a 37 °C en una atmósfera humedecida con 5 % de CO₂ durante 72 h.
- Aspire el medio de cultivo, enjuague los pocillos con PBS y lise las células añadiendo 200 µL de tampón de lisis por pocillo (0,1 % de Triton X-100 en PBS) e incube a 4 °C durante 10 min con agitación suave.
- Recoja el lisado y centrifugue a 500 x g durante 5 min a 4 °C; utilice el sobrenadante para todas las mediciones posteriores de ALP. Transfiera 50 µL de cada muestra de prueba y 100 µL de patrones de p-nitrofenol a una placa microtituladora de 96 pocillos. Añada tampón de sustrato AMP (Tabla de Materiales) para iniciar la reacción catalítica.
- Tras una incubación secundaria de 30 min a 37 °C, detenga la reacción añadiendo 50 µL de NaOH 0,5 M por pocillo. Mida inmediatamente la absorbancia a 405 nm utilizando un lector de microplacas de absorbancia (Tabla de Materiales).
- Genere una curva patrón de absorbancia frente a la concentración de p-nitrofenol y calcule la actividad de ALP en U/L.
- Determine el contenido total de proteína del mismo lisado celular utilizando un ensayo de proteína Bradford o BCA. Normalice la actividad de ALP respecto al contenido total de proteína y reporte los resultados finales como U/mg de proteína.
- Marcador osteogénico (RANKL)
- Evalue la expresión proteica de RANKL mediante inmunofluorescencia. Primero, prepare controles de isotipo y de solo anticuerpo secundario: (a) sustituya el anticuerpo primario por una IgG de conejo con isotipo coincidente a la misma concentración, y (b) omita completamente el anticuerpo primario en pocillos separados.
- Fije las células con formaldehído al 4 % recién preparado en PBS durante 15 min a temperatura ambiente. Lave tres veces con PBS (5 min cada vez).
- Permeabilice con Triton X-100 al 0,1 % en PBS durante 10 min, luego bloquee con suero de cabra normal al 5 % en PBS durante 1 h a temperatura ambiente para reducir la unión no específica. Sin lavar, añada directamente el anticuerpo primario Conejo Anti-RANKL a una dilución de 1:200 en tampón de bloqueo (Tabla de Materiales) e incube toda la noche a 4 °C.
- Lave tres veces con PBS, luego incube con el anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo Cabra Anti-Conejo IgG a una dilución de 1:500 en tampón de bloqueo (Tabla de Materiales) durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad8. Tras la incubación con el anticuerpo secundario, lave tres veces con PBS (5 min cada vez) y continúe directamente al paso 5.7 para el montaje.
ADVERTENCIA: El formaldehído (solución al 4 %) es un fijador tóxico y probable carcinógeno. Prepárelo y úselo únicamente en una campana extractora de gases certificada. Use guantes de nitrilo, gafas de protección y bata de laboratorio. Deseche los residuos según las normas institucionales.
NOTA. La identidad celular se confirma mediante microscopía de contraste de fases y criterios morfológicos antes de la puntuación por inmunofluorescencia (véase el paso 5.10).
- Marcador odontogénico (DMP-1)
NOTA: Evalúe la expresión proteica de DMP-1 (proteína de matriz dentinaria-1) mediante inmunofluorescencia en paralelo con el paso 5.5 para evaluar el compromiso odontogénico.- Utilizando un conjunto separado de cubreobjetos de la misma preparación celular, repita todos los pasos de fijación, permeabilización y bloqueo descritos en el paso 5.5, incluyendo los controles de isotipo y de solo anticuerpo secundario.
- Sin lavar tras el bloqueo, añada directamente el anticuerpo primario anti-DMP-1 (véase Tabla de Materiales) a una dilución de 1:200 en tampón de bloqueo e incube toda la noche a 4 °C. Lave tres veces con PBS, luego incube con el anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo apropiado (use un fluorocromo espectralmente distinto al utilizado para RANKL; véase Tabla de Materiales) a una dilución de 1:500 en tampón de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Adquiera imágenes de fluorescencia con un aumento de 10x para evaluar la expresión de DMP-1 como indicador de diferenciación tipo odontoblasto10. Tras la incubación con el anticuerpo secundario, lave tres veces con PBS (5 min cada vez) y continúe directamente al paso 5.7 para el montaje.
- Monte las laminillas con medio de montaje antifade (véase Tabla de Materiales) y deje que solidifique durante toda la noche a temperatura ambiente. Monte las laminillas teñidas para RANKL y DMP-1 por separado y etiquételas claramente (por ejemplo, «Grupo 1 RANKL» y «Grupo 1 DMP-1») antes de la obtención de imágenes.
- Examine las laminillas inmediatamente mediante microscopía de fluorescencia o almacénelas a 4 °C protegidas de la luz. Cuantifique la expresión proteica evaluando la intensidad de tinción mediante un sistema de puntuación estandarizado de cuatro niveles: 0 (sin tinción), 1+ (débil), 2+ (moderada) y 3+ (fuerte).
- Adquiera imágenes utilizando configuraciones idénticas del microscopio (tiempo de exposición, potencia del láser y ganancia) en todos los grupos experimentales. Aplique configuraciones idénticas de forma independiente para cada marcador (RANKL y DMP-1) para garantizar la consistencia dentro del marcador entre los grupos.
- Puntúe un mínimo de cinco campos de alta potencia seleccionados al azar (objetivo x20) por pocillo. Dos observadores independientes y ciegos deben realizar la puntuación y reportar el coeficiente kappa de Cohen (kappa aceptable ≥ 0,7).
- Calcule el H-score utilizando la fórmula: H-score = Σ(i × Pi), donde i = intensidad de tinción (1, 2 o 3) y Pi = porcentaje de células (0–100 %) en cada nivel de intensidad.
NOTA: El H-score varía entre 0 y 30010. - Normalice los datos del H-score respecto al número total de células por campo, determinado mediante conteo manual de todas las células visibles en cada campo bajo microscopía de contraste de fases antes de la obtención de imágenes por inmunofluorescencia, para tener en cuenta las diferencias en densidad celular entre los pocillos.
- Calcule y reporte los H-scores por separado para RANKL (punto final osteogénico) y DMP-1 (punto final odontogénico) para permitir una comparación directa entre las dos vías de diferenciación.
6. Evaluación de la proliferación y viabilidad
- Realice el recuento celular utilizando un hemocitómetro y tinción con azul de tripano para distinguir células viables de no viables. Calcule el número total de células viables por mL de cultivo. Cuente al menos 100 células por muestra para garantizar confiabilidad estadística.
- Realice el ensayo de MTT para medir la actividad metabólica mitocondrial8,10.
- Añada la solución de MTT a una concentración final de 0,5 mg/mL (Tabla de Materiales) a las células e incube durante 4 h a 37 °C. Retire la solución, añada un agente solubilizante (por ejemplo, SDS-HCl; véase la Tabla de Materiales) y mida la densidad óptica a 570 nm utilizando un espectrofotómetro (longitud de onda de referencia: 630–650 nm).
- Calcule la viabilidad celular como: Viabilidad (%) = (Absorbancia de las células tratadas / Absorbancia de las células de control no tratadas) × 100. Valores >100% indican estimulación proliferativa en relación con el control negativo. Incluya un pozo en blanco para la corrección del fondo.
- Normalice los resultados respecto al número de células utilizando un recuento paralelo con azul de tripano. Realice todos los ensayos por triplicado (n = 3 pozos/grupo, ≥3 réplicas biológicas).
ADVERTENCIA: El tampón de solubilización SDS-HCl es corrosivo. Manipúlelo con el equipo de protección personal adecuado. Deseche los residuos que contienen formazán de acuerdo con las regulaciones institucionales.
Resultados
Todos los resultados presentados aquí se adaptaron de estudios complementarios4,8,9,10 realizados por el mismo grupo de investigación bajo una aprobación ética institucional unificada (FDASU-Rec IM112105).
Caracterización de nanomateriales y aislamiento de células madre
El procedimiento estandarizado produce inicialmente una confirmación cuantificable de las propiedades del andamiaje y los fenotipos de las células madre. Tras la síntesis, los nanomateriales preparados se validan mediante microscopía electrónica de transmisión de alta resolución (TEM) y difracción de rayos X (XRD) para confirmar el tamaño de las partículas y la cristalinidad (Figura 1A,B). Paralelamente, las DPSC o las SCAP aisladas mediante digestión enzimática muestran una adhesión y proliferación robustas en medio de cultivo completo. El análisis mediante citometría de flujo valida el inmunofenotipo de las células recolectadas en el pase 3, mostrando una alta expresión de marcadores mesenquimales (CD44, CD43) y confirmando su origen no hematopoyético por la ausencia de CD45 (Figura 1C).
Establecimiento de la concentración segura de material y proliferación
Al cultivar células madre en diluciones seriadas de los nanomateriales (50–1.56 µg/mL) durante 72 h, la regresión logística de cuatro parámetros de los recuentos de células viables proporciona un valor EC₅₀ confiable (modelo de respuesta dosis-respuesta sigmoidal no lineal, como se describe en el paso 4.1). Valores de viabilidad MTT superiores al 100 % indican una estimulación proliferativa en relación con el control no tratado, ya que los valores se normalizan respecto al grupo control negativo (células no tratadas establecidas como 100 %). Un valor de aproximadamente 196 % para Nano-NeoMTA2, por ejemplo, refleja una estimulación bioactiva de la actividad mitocondrial y no >100 % de supervivencia celular absoluta9.
En varios estudios que aplican este protocolo estandarizado, se establecieron valores de CE₅₀ de 7,9 µg/mL (Nano-NeoMTA2, SCAPs)8 y 9,92 µg/mL (Nano-NeoMTA2, DPSCs)10 utilizando el modelo logístico de cuatro parámetros (paso 4.1), lo que confirma concentraciones seguras para su uso en los ensayos de diferenciación descritos en este protocolo. Estos valores se incluyen en Tabla 1 como métricas representativas de validación.
Cuantificación de la diferenciación osteogénica y odontogénica (evaluación con dos marcadores)
El enfoque de inmunofluorescencia dual proporciona dos medidas de resultado distintas y complementarias a partir de la misma preparación celular. Para la evaluación osteogénica, los puntajes H de RANKL distinguieron significativamente los cuatro grupos: las células cultivadas con Nano-NeoMTA2 mostraron una expresión de RANKL considerablemente mayor que el control negativo, lo que indica una activación similar a la de los osteoblastos (Figura 2A, Tabla 1)8,9. Para la evaluación odontogénica, los puntajes H de DMP-1 revelaron una diferenciación robusta hacia un fenotipo similar al de odontoblastos en las DPSC cultivadas con Nano-NeoMTA2, con puntajes H significativamente superiores a los observados en los grupos con nanohidroxiapatita y control negativo, lo que confirma un compromiso preferencial hacia la formación de dentina (Figura 3A, Tabla 1)10. La identidad celular se confirmó mediante microscopía de contraste de fase y criterios morfológicos característicos (morfología fusiforme o poligonal) antes de la cuantificación.
La actividad de la ALP se distinguió espectrofotométricamente entre todos los grupos a 405 nm, actuando como un marcador enzimático temprano de la diferenciación osteogénica y odontogénica (Tabla 1). El análisis espectrofotométrico de MTT confirmó que todos los nanomateriales, a concentraciones seguras derivadas de la CE₅₀, mantuvieron una alta viabilidad celular en comparación con el control negativo, lo cual es consistente con los valores representativos presentados (Tabla 1).
Resultados experimentales subóptimos e infructuosos
Los resultados subóptimos se resumen en la Tabla 2. Una viabilidad celular baja en el ensayo de MTT generalmente indica que la concentración del nanomaterial supera el umbral de EC₅₀ o que la esterilización con UV fue insuficiente. Una absorbancia inconsistente de ALP (CV > 20 %) generalmente indica una densidad de siembra desigual o una homogeneización incompleta del tampón de lisis. Una señal de inmunofluorescencia débil o ausente para RANKL o DMP-1 se debe más comúnmente a la inactivación del anticuerpo, una permeabilización insuficiente o una sobrefijación; el uso de formaldehído fresco al 4 % y alícuotas de anticuerpos de un solo uso resuelve este problema. Debe descartarse la reactividad cruzada entre los canales de RANKL y DMP-1 mediante la revisión de las imágenes de control con solo el anticuerpo secundario antes de la cuantificación.
Figura 1: Caracterización estandarizada de nanomateriales y validación del fenotipo de células madre. (A) Espectros de XRD que confirman la fase cristalina e integridad estructural de las nanopartículas. (B) Imágenes representativas de TEM que demuestran el tamaño nanométrico de las partículas, la morfología y la dispersión homogénea de los biomateriales sintetizados; comparando NeoMTA2 e hidroxiapatita. Se muestran vistas de baja magnificación para (a) NeoMTA2 y (b) hidroxiapatita, mientras que las vistas de alta magnificación se detallan en (c) NeoMTA2 y (d) hidroxiapatita. Las barras de escala se indican en la esquina inferior izquierda. (C) Protocolo de selección por citometría de flujo para la caracterización de células madre. Gráficos de puntos multiparamétricos representativos muestran células marcadas para CD44, CD73 (etiquetado como CD43 PE en los gráficos originales) y CD45. Las subpoblaciones CD44+ y CD73+ fueron seleccionadas según la expresión de CD45. El panel A y C se adaptaron de Zaki et al.8 (CC BY-NC-SA) y el panel B se adaptó de Habib et al.10 (CC BY-NC). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Evaluación cuantitativa y semicuantitativa de la diferenciación osteogénica mediante inmunofluorescencia de RANKL. (A) Micrografías inmunofluorescentes representativas de alta resolución que muestran la expresión del marcador proteico osteogénico clave RANKL dentro del microentorno del andamio 2D. (a) Las células del control negativo forman colonias pequeñas con expresión débil y membranosa de RANKL, mientras que (b) las células del control positivo muestran un mayor número de colonias de tipo osteoblástico con expresión densa y homogénea. Las células madre tratadas con (c) NHAP, (d) NHAP/citosano y (e) nanopartículas de vidrio bioactivo presentan una diferenciación avanzada, caracterizada por colonias grandes y fusionadas de tipo osteoblástico con intensa y homogénea localización de RANKL tanto en la membrana como en el núcleo; adaptado de: Elshahat et al.4. (B) Gráficos de barras que representan la cuantificación del puntaje H de la expresión de RANKL en los diferentes estudios. Aplicación de la metodología del puntaje H para normalizar los datos de inmunofluorescencia. Al integrar matemáticamente la intensidad visual de la tinción (graduada de 0 a 3) con el porcentaje de células teñidas positivamente, el puntaje H transforma la microscopía cualitativa en una métrica robusta y semicuantitativa, reduciendo significativamente el sesgo subjetivo del observador. (a) Comparación de Nano-NeoMTA2 (7.9 µg/mL) y nanopartículas de vidrio bioactivo (NBG; 500 µg/mL) frente al control positivo en medio osteogénico (OM-PC) y al control negativo en DMEM (DMEM-NC). NBG indujo el perfil de expresión más elevado (p &< 0,001). Adaptado de Abdelaziz et al.9 (CC BY-NC-ND 4.0). (b) Evaluación de la nano-hidroxiapatita (NHAP; 10µg/mL), compuesto de NHAP/quitosano (10 µg/mL), y NBG (500 µg/mL) con respecto a los controles, mostrando NHAP/Quitosano las puntuaciones H máximas. Adaptado de Elshahat et al.4 (CC BY 4.0). (c) Evaluación de Nano-NeoMTA2 (7.9 µg/mL) frente a NHAP (10 µg/mL) y controles, demostrando una expresión significativamente elevada de RANKL en el Nano-NeoMT adaptado de: Zaki et al.8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes representativas de inmunofluorescencia y análisis de puntuación H. (A) Evaluación mediante microscopía de inmunofluorescencia de la expresión de la proteína de matriz dentinaria (DMP-1) en los diferentes grupos experimentales; la fluorescencia verde indica tinción positiva para anticuerpos policlonales anti-DMP-1. (a) Control negativo: células madre del pulpo dental humano (hDPSCs) en medio no diferenciado (UM) muestran pequeños agregados celulares con expresión débil y uniforme de DMP-1 (+). (b) Control positivo: hDPSCs en medio odontogénico (OM) muestran expansión de colonias marcadas por señales densas y homogéneas de DMP-1 (++). (c) Nanohidroxiapatita (10 μg/mL) y (d) Nano-NeoMTA2 (9.92 μg/mL): hDPSCs diferenciadas forman grandes colonias fusionadas de células similares a odontoblastos que exhiben una expresión intensa y homogénea de DMP-1 localizada en las membranas y núcleos. Aumento: ×10. Los círculos amarillos indican colonias de tipo odontoblástico; las flechas amarillas señalan expresión intensa de DMP-1. (B) Gráfico de barras que representa la cuantificación de la puntuación H de la expresión de la proteína de matriz dentinaria en los grupos del estudio. Se observó una diferencia altamente significativa entre los grupos evaluados, siendo la puntuación H más alta en el grupo tratado con Nano-NeoMTA2 (169,33 ± 4,04), seguido por nanohidroxiapatita (140,33 ± 2,52) y el control negativo (15,33 ± 1,53). Los paneles A y B se adaptaron de Habib et al.10 (CC BY-NC). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Ensayo / Parámetro | Nanomaterial / Tipo celular | Valor representativo (Media ± DE) | Normalización | Origen |
| Viabilidad celular (ensayo MTT) | ||||
| Viabilidad MTT | Nano-NeoMTA2 (7,9 µg/mL) / SCAPs | ~196% (OD = 1,56 ± 0,24) | Normalizado respecto al control no tratado (DMEM-NC = 100%) | Abdelaziz et al.⁹ |
| Viabilidad MTT | Chitosan-nHA (10 µg/mL) / SCAPs | ~99,97% | Normalizado respecto al control no tratado (DMEM-NC = 100%) | Elshahat et al.⁴ |
| Viabilidad MTT — Control positivo | OM-PC / SCAPs | 113,46% (OD = 0,93 ± 0,03) | Normalizado respecto al control no tratado (DMEM-NC = 100%) | Abdelaziz et al.⁹ |
| Viabilidad MTT — Control negativo | DMEM-NC / SCAPs | 100% (OD = 0,82 ± 0,02) — Línea base de referencia | DMEM-NC definido como 100% de referencia para todos los grupos | Abdelaziz et al.⁹ |
| Actividad de fosfatasa alcalina (ALP) | ||||
| Actividad ALP | Nanopartículas de vidrio bioactivo (500 µg/mL) / SCAPs | 69,86 ± 0,98 U/L | Normalizado respecto al contenido total de proteína (U/mg proteína, ensayo de Bradford/BCA) | Abdelaziz et al.⁹ |
| Actividad ALP — Control positivo | OM-PC / SCAPs | 77,68 ± 1,28 U/L | Normalizado respecto al contenido total de proteína (U/mg proteína, ensayo de Bradford/BCA) | Abdelaziz et al.⁹ |
| Actividad ALP — Control negativo | DMEM-NC / SCAPs | 55,81 ± 1,6 U/L | Normalizado respecto al contenido total de proteína (U/mg proteína, ensayo de Bradford/BCA) | Abdelaziz et al.⁹ |
| Concentración segura del material (CE₅₀) | ||||
| CE₅₀ (SCAPs) | Nano-NeoMTA2 / SCAPs | 7,9 µg/mL | Modelo logístico de cuatro parámetros (respuesta dosis-respuesta sigmoidea no lineal, GraphPad Prism 9) | Zaki et al.⁸ |
| CE₅₀ (DPSCs) | Nano-NeoMTA2 / DPSCs | 9,92 µg/mL | Modelo logístico de cuatro parámetros (respuesta dosis-respuesta sigmoidea no lineal, GraphPad Prism 9) | Habib et al.10 |
| Puntuación H — Expresión proteica de RANKL (marcador osteogénico) | ||||
| Puntuación H (RANKL) Marcador osteogénico | Nano-NeoMTA2 (7,9 µg/mL) / SCAPs | 164 ± 4 (escala 0–300) | Recuento total de células visibles por campo (microscopía de contraste de fase) | Zaki et al.⁸ |
| Puntuación H (RANKL) Marcador osteogénico | nHA (10 µg/mL) / SCAPs | 68 ± 3 (escala 0–300) | Recuento total de células visibles por campo (microscopía de contraste de fase) | Zaki et al.⁸ |
| Puntuación H (RANKL) Control positivo | OM-PC / SCAPs | 84 ± 1 (escala 0–300) | Recuento total de células visibles por campo (microscopía de contraste de fase) | Zaki et al.⁸ |
| Puntuación H (RANKL) Control negativo | DMEM-NC / SCAPs | 18 ± 1 (escala 0–300) | Recuento total de células visibles por campo (microscopía de contraste de fase) | Zaki et al.⁸ |
| Puntuación H — Expresión proteica de DMP-1 (marcador odontogénico) | ||||
| Puntuación H (DMP-1) Marcador odontogénico | Nano-NeoMTA2 (9,92 µg/mL) / DPSCs | 169,33 ± 4,04 (escala 0–300) | Recuento total de células visibles por campo (microscopía de contraste de fase) | Habib et al.10 |
| Puntuación H (DMP-1) Marcador odontogénico | nHA (10 µg/mL) / DPSCs | 140,33 ± 2,52 (escala 0–300) | Recuento total de células visibles por campo (microscopía de contraste de fase) | Habib et al.10 |
| Puntuación H (DMP-1) Control negativo | DMEM-NC / DPSCs | 15,33 ± 1,53 (escala 0–300) | Recuento total de células visibles por campo (microscopía de contraste de fase) | Habib et al.10 |
| Puntuación H (DMP-1) Marcador odontogénico [Control positivo -OM-PC] | OM-PC / DPSCs | ~103 puntos H (escala 0–300) | Recuento total de células por campo (microscopía de contraste de fase) | Habib et al. Eur Endod J, 202610 |
| Puntuación H = Σ(i × Pi): i = intensidad de tinción (1, 2 o 3); Pi = porcentaje de células en cada nivel de intensidad (0–100%); rango 0–300. La viabilidad MTT se expresa en relación con DMEM-NC, establecido como referencia del 100%. La actividad ALP se expresa en U/L a partir de la desfosforilación enzimática del fosfato de p-nitrofenilo; posteriormente normalizada respecto al contenido total de proteína (U/mg proteína). OM-PC = medio de inducción osteogénica/odontogénica (control positivo). DMEM-NC = Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (control negativo). | ||||
Tabla 1: Resultados representativos del protocolo de evaluación in vitro estandarizado. Resultados cuantitativos representativos de estudios previamente publicados que demuestran el análisis de la proliferación celular, la actividad de fosfatasa alcalina y los análisis de inmunofluorescencia realizados utilizando el protocolo estandarizado.
| Problema observado | Causa potencial | Solución recomendada |
| Baja viabilidad celular en el ensayo MTT (OD < control no tratado | La concentración del nanomaterial supera la CE₅₀, o la esterilización UV es insuficiente, o la dispersión de las nanopartículas es inadecuada. | Volver a realizar la determinación de la CE₅₀ (Sección 4). Extender la esterilización por UV a 30 min. Verificar la suspensión homogénea de nanopartículas mediante sonicación con sonda (40 W, 30 s encendido/apagado, 3 ciclos en 4 °C) inmediatamente antes del uso. |
| CV de viabilidad MTT >15 % entre réplicas | Error de pipeteo, siembra desigual de células o variabilidad en el tiempo/temperatura de incubación de MTT. | Utilice una pipeta multicanal calibrada para todas las adiciones. Confirme la densidad de siembra mediante hemocitómetro antes de la siembra. Mantenga una incubación estricta de 4 h a 37 °C en un incubador de CO₂ humedecido. Incluya un pocillo en blanco para la corrección del fondo. |
| Lecturas inconsistentes de absorbancia de ALP (CV >20 % entre pozos | Densidad de siembra celular irregular, lisis celular incompleta o inconsistencia al pipetear durante la adición del sustrato. | Adhiera estrictamente a 1 × 10⁴ células/pocillo en placas de 24 pocillos. Agite completamente el tampón de lisis antes de usarlo. Mantenga una incubación de lisis constante (10 min, 4 °C, agitación suave). Verifique la absorbancia de fondo con un pocillo en blanco sin células. |
| Inmunofluorescencia débil o ausente de RANKL señal (paso 5.4a) | Inactivación de anticuerpos por almacenamiento inadecuado, sobrefijación que reduce la accesibilidad del epítopo o permeabilización insuficiente. | Prepare al 4% de formaldehído fresco inmediatamente antes de su uso. Añada la permeabilización con Triton X-100 al 0,1% (10 min, temperatura ambiente) antes del bloqueo. Titule la dilución del anticuerpo primario (iniciar en 1:200). Incluya una sección de tejido control positivo. Aliquote el anticuerpo stock para evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación. |
| Inmunofluorescencia débil o ausente de DMP-1 señal (paso 5.4b) | Inactivación de anticuerpos debido a ciclos de congelación-descongelación, dilución subóptima del anticuerpo primario o especie del huésped del anticuerpo secundario incompatible. | Aliquotear el anticuerpo anti-DMP-1 para evitar ciclos de congelación-descongelación. Realizar una titulación con una dilución inicial de 1:200. Confirmar la compatibilidad entre las especies huésped del anticuerpo primario (DMP-1) y del anticuerpo secundario. Incluir una sección de tejido de dentina como control positivo para DMP-1. |
| Reactividad cruzada entre RANKL y DMP-1 canales de fluorescencia | Solapamiento espectral en los espectros de emisión si se utiliza el mismo fluorocromo para ambos anticuerpos secundarios, o separación inadecuada de canales en el microscopio de fluorescencia. | Utilice fluorocromos de anticuerpos secundarios espectroscópicamente distintos para RANKL y DMP-1 (por ejemplo, Alexa Fluor 488 para un marcador, Alexa Fluor 594 para el otro). Revise las imágenes de control con solo el anticuerpo secundario para cada canal de forma independiente antes de la cuantificación. Adquiera las imágenes de RANKL y DMP-1 por separado utilizando el modo de adquisición secuencial. |
| Alto fondo inespecífico en tinción por inmunofluorescencia | Bloqueo insuficiente de proteínas, concentración excesiva del anticuerpo secundario o pasos de lavado inadecuados entre las incubaciones. | Prolongue la incubación de bloqueo hasta 2 h a temperatura ambiente. Aumente la dilución del anticuerpo secundario a 1:1000. Confirme la especificidad con el control de solo secundario (sin anticuerpo primario). Asegúrese de que todos los lavados con PBS sean completos (3 × 5 min cada uno). |
| Variabilidad interobservador del puntaje H (Cohen’s kappa <0,7, paso 5,6) | Aplicación inconsistente de la escala de intensidad de tinción de cuatro niveles (0, 1+, 2+, 3+) entre observadores, o calibración insuficiente antes de las sesiones de puntuación. | Realice una sesión conjunta de calibración utilizando imágenes de entrenamiento representativas antes de la puntuación formal. Utilice configuraciones idénticas de visualización de imágenes (brillo, contraste) para todos los observadores. Evalúe un mínimo de cinco campos de alto aumento por pocillo y calcule el coeficiente kappa después de cada 10 campos para monitorear posibles desviaciones. |
| La curva de CE₅₀ no converge o el ajuste es deficiente (paso 4.1) | Puntos de datos insuficientes, rango de concentración estrecho o suspensión homogénea no lograda antes de la siembra. | Amplíe el rango de dilución seriada para incluir al menos 6 concentraciones que abarquen de 50 a1.56 µg/mL. Asegúrese de que la sonicación con sonda se realice inmediatamente antes de cada paso de dilución. Repita con al menos 3 réplicas biológicas independientes. Confirme CV <15% entre réplicas. |
Tabla 2: Parámetros críticos y guía de solución de problemas. Problemas técnicos comunes que se presentan durante el protocolo, sus causas potenciales y soluciones recomendadas para mejorar la reproducibilidad experimental y la calidad de los datos. Abreviaturas: CV = coeficiente de variación; RT = temperatura ambiente.
Discusión
Los pasos críticos de este protocolo incluyen la determinación precisa de la CE₅₀, la suspensión homogénea de nanomateriales y la normalización de los resultados del ensayo biológico. El cálculo de la CE₅₀ mediante regresión no lineal (modelo logístico de cuatro parámetros) proporciona una estimación más rigurosa de la relación dosis-respuesta que la interpolación lineal y debe preferirse cuando se dispone de suficientes puntos de datos13,14. Es fundamental garantizar una suspensión homogénea de nanopartículas mediante sonicación con sonda inmediatamente antes de la exposición celular; las suspensiones mal dispersas generan curvas dosis-respuesta poco confiables y dificultan las estimaciones de la CE₅₀. Para materiales novedosos como NeoMTA2, la molienda a escala nanométrica es un paso esencial inicial, ya que el tamaño de las partículas a granel altera sustancialmente la reactividad superficial y la bioactividad subsiguiente13,14. Si se observa una viabilidad celular baja en concentraciones que se esperaba fueran seguras, los investigadores deben verificar el protocolo de esterilización con UV y revisar nuevamente los procedimientos de molienda y dispersión antes de repetir el ensayo de CE₅₀10.
Un pilar fundamental de este protocolo es el uso de dos marcadores de inmunofluorescencia complementarios que reflejan vías de diferenciación distintas aunque superpuestas. La regulación positiva de RANKL en células similares a osteoblastos refleja la señalización osteogénica inducida por iones de calcio y es proporcional al número de células osteogénicas8,9, mientras que la expresión de DMP-1 sirve como un indicador específico de la diferenciación hacia células similares a odontoblastos y de la actividad dentinogénica, lo que la hace particularmente relevante cuando la población celular objetivo son las DPSC10. Al cuantificar ambos marcadores mediante la metodología del puntaje H, este protocolo permite a los investigadores distinguir el compromiso hacia la línea osteogénica frente al odontogénico dentro de un único sistema de ensayo estandarizado, una mejora frente a los enfoques con un solo marcador que no pueden diferenciar entre el compromiso hacia la formación ósea y la formación de dentina. Tanto los puntajes H de RANKL como de DMP-1 deben reportarse en todas las publicaciones que utilicen este protocolo para mantener la comparabilidad entre estudios. Los investigadores deben usar fluorocromos espectralmente distintos para los dos anticuerpos secundarios con el fin de evitar la superposición de canales, y deben revisar las imágenes de control con solo el anticuerpo secundario antes de realizar la puntuación.
Pueden ser necesarias varias modificaciones metodológicas al adaptar este protocolo a biomateriales o modelos celulares alternativos. Para andamios altamente opacos o coloreados, la interferencia con la absorbancia de MTT a 570 nm puede requerir un ensayo de viabilidad alternativo, como CellTiter-Glo (luminiscencia) o PrestoBlue (reducción de resazurina), que son menos susceptibles a interferencias ópticas por parte de los materiales del andamio. Los investigadores que utilicen SCAPs en lugar de DPSCs deben tener en cuenta que los SCAPs tienden a mostrar una expresión más fuerte de RANKL, lo que refleja su mayor compromiso osteogénico, mientras que los DPSCs presentan una expresión más pronunciada de DMP-1, lo que refleja su mayor tendencia hacia la linaje odontogénico/dentinogénico. El número de pase es una variable crítica: deben evitarse células posteriores al pase 6, ya que podrían exhibir una capacidad de diferenciación reducida y una expresión alterada de marcadores de superficie.
Las limitaciones de este marco metodológico incluyen una ventana de evaluación a corto plazo (72 h), que podría no captar eventos de mineralización en fase tardía que típicamente requieren de 14 a 21 días. La ausencia de validación in vivo representa una brecha significativa en la traslación. El uso del puntaje H introduce una variabilidad potencial entre observadores; la fiabilidad entre observadores (kappa de Cohen) informada en la sección 5.10 debe incluirse en todos los resultados publicados.
Este marco ofrece varias ventajas frente a los enfoques convencionales de un solo punto final. Los ensayos osteogénicos convencionales a menudo dependen únicamente de la tinción con rojo de alizarina o de la actividad de la fosfatasa alcalina (ALP) en un solo punto temporal. La integración del ensayo de viabilidad MTT, la cuantificación de la actividad de la ALP y la puntuación H por inmunofluorescencia dual para RANKL y DMP-1 dentro de un único flujo de trabajo proporciona una salida multiparamétrica que permite comparaciones estadísticas directas entre tipos de andamios bajo condiciones experimentales idénticas. Las estrategias de normalización descritas, como la actividad de la ALP expresada por mg de proteína, los resultados del MTT como porcentaje del control no tratado y la puntuación H normalizada respecto al número total de células por campo, eliminan las variables confusas derivadas de la variabilidad entre pocillos4,8.
Estudios futuros podrían aplicar esta metodología para evaluar los efectos de los biomateriales sobre marcadores inflamatorios, respuestas angiogénicas o modelos alternativos de células madre. La secuencia del ensayo también es adaptable a formatos de andamiaje tridimensional. En última instancia, la adopción de este marco estandarizado en laboratorios independientes facilitará comparaciones metaanalíticas significativas del rendimiento de andamiajes en investigaciones preclínicas de odontología regenerativa15.
Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placas de cultivo de 24 pocillos | Corning | 3527 | Utilizadas para ensayos de ALP |
| Placas de 96 pocillos | Corning | 3596 | Utilizadas para lecturas de absorbancia de ALP y ensayos de MTT |
| Kit de ensayo de ALP | Abcam | ab83369 (o equivalente) | Utilizado para medir la actividad de la fosfatasa alcalina |
| Tampón sustrato de ALP (2-amino-2-metil-1-propanol) | Sigma-Aldrich | N/A | Utilizado para iniciar la reacción catalítica de ALP |
| Hidróxido de amonio (NH4OH) | N/A | N/A | Utilizado para ajuste de pH durante la síntesis de nanohidroxiapatita. CORROSIVO |
| Anticuerpo primario anti-DMP-1 | N/A | N/A | Marcador odontogénico; dilución 1:200 en tampón bloqueante; incubación nocturna a 4 °C |
| Anticuerpo anti-CD44 humano (CD44-FITC) | Beckman Coulter | N/A | Utilizado para citometría de flujo; marcador positivo de células madre mesenquimales |
| Anticuerpo anti-CD45 humano (CD45-PC5) | Beckman Coulter | N/A | Utilizado para citometría de flujo; marcador negativo de linaje hematopoyético |
| Anticuerpo anti-CD73 humano (CD73-PE) | Beckman Coulter | N/A | Utilizado para citometría de flujo; marcador positivo de células madre mesenquimales |
| Autoclave (reactor hidrotermal) | Tuttnauer | N/A | Utilizado para el tratamiento hidrotermal de nanohidroxiapatita a 140 °C, 0,3 MPa |
| Kit de ensayo de proteína BCA | Thermo Fisher Scientific | 23225 (o equivalente) | Utilizado para determinar la concentración total de proteína para la normalización de la actividad de ALP |
| Incubadora de CO2 | Thermo Fisher Scientific | N/A | Ajustada a 37 °C y 5 % de CO2 para todos los pasos de cultivo celular |
| Colagenasa tipo I | Sigma-Aldrich | C0130 | Utilizada para la digestión enzimática de tejidos dentales durante el aislamiento de células madre |
| DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 11965-092 | Medio de cultivo basal; también utilizado como grupo control negativo |
| Suero bovino fetal (FBS) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 10270-106 | Suplemento para medio de cultivo completo; FBS calificado para MSC utilizado en medio de diferenciación |
| Citómetro de flujo (Navios) | Beckman Coulter | Navios | Utilizado para inmunofenotipado de células madre |
| Software de análisis de citometría de flujo (Navios) | Beckman Coulter | N/A | Utilizado para el análisis de puertas y datos de paneles de citometría de flujo |
| Microscopio de fluorescencia | Labomed / NY Microscope Company | 9126000 | Utilizado para imágenes de inmunofluorescencia y puntuación H-score |
| Liofilizador (secador por congelación) | Labconco | N/A | Utilizado para secar los precipitados de nanomateriales a −50 °C |
| Anticuerpo secundario de cabra anti-IgG de conejo (Alexa Fluor 488) | Invitrogen | A-11034 | Anticuerpo secundario fluorescente; dilución 1:500; 1 h a temperatura ambiente |
| Anticuerpo secundario de cabra anti-IgG de conejo (Alexa Fluor 594) | Invitrogen (o equivalente) | A-11012 (o equivalente) | Anticuerpo secundario espectroscópicamente distinto utilizado para inmunofluorescencia de DMP-1 cuando se realiza tinción múltiple |
| Software GraphPad Prism | GraphPad Software | Versión 9 | Utilizado para el cálculo de EC50 y análisis estadístico |
| Hemocitómetro | Neubauer | N/A | Utilizado para conteo manual de células y conteo total de células para la normalización del H-score |
| Microscopio invertido de contraste de fases | Olympus | N/A | Utilizado para el monitoreo diario del crecimiento y morfología celular |
| Medio de montaje antifade (ProLong Gold) | Invitrogen | P36930 | Utilizado para el montaje de portaobjetos tras la tinción de inmunofluorescencia |
| Reactivo MTT | Invitrogen | M6494 | Utilizado para evaluar la actividad metabólica celular; 0,5 mg/mL, 4 h a 37 °C |
| Nanohidroxiapatita (NHAP) | Nanogate, El Cairo, Egipto | N/A | Sintetizada por precipitación húmeda o adquirida comercialmente; utilizada a 10 µg/mL |
| Polvo de NeoMTA2 | NuSmile Ltd. / Avalon Biomed | N/A | Material inicial para la preparación de Nano-NeoMTA2 mediante molino planetario de bolas |
| Suero normal de cabra | N/A | N/A | Utilizado para bloqueo (5 % en PBS) antes de la aplicación del anticuerpo primario |
| Medio de diferenciación osteogénica/odontogénica | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | N/A | Medio control positivo; contiene DMEM, FBS, ascorbato, beta-glicerofosfato y dexametasona |
| Paraformaldehído (4 %) | Sigma-Aldrich | P6148 | Utilizado para la fijación celular antes de la inmunofluorescencia. TÓXICO — usar en cabina de extracción |
| PBS (solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 10010-023 | Utilizado para lavado celular, dilución de anticuerpos y suspensión de nanomateriales |
| Solución de penicilina-estreptomicina | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 15140-122 | Suplemento antibiótico; utilizado al 1 % en medio de cultivo completo |
| Molino planetario de bolas | Retsch (o equivalente) | PM 400 | Utilizado para la nanodivisión del polvo de NeoMTA2; 350 rpm, 10 h |
| Estándares de p-nitrofenol | Sigma-Aldrich | N/A | Utilizados para generar la curva estándar de actividad de ALP |
| Anticuerpo primario de conejo anti-RANKL | Abcam | ab9957 | Marcador osteogénico; dilución 1:200; incubación nocturna a 4 °C |
| Anticuerpo control isotípico de IgG de conejo | N/A | Control negativo para inmunofluorescencia; concentración equivalente al anticuerpo primario | |
| Solución de solubilización SDS-HCl | Sigma-Aldrich | N/A | Utilizada para disolver los cristales de formazán de MTT. CORROSIVA |
| Placas de cultivo tisular de seis pocillos | Corning | 3516 | Utilizadas para ensayos de diferenciación |
| Hidróxido de sodio (NaOH), 0,5 M | Sigma-Aldrich (o equivalente) | N/A | Utilizado para detener la reacción de ALP antes de la medición de absorbancia; CORROSIVO |
| Sonicador (sonda o baño ultrasónico) | Branson Ultrasonics | N/A | Utilizado para la dispersión de nanopartículas antes de los ensayos biológicos |
| Matraces de cultivo T-75 | Corning | 430641 | Utilizados para la expansión de células madre |
| TEOS (ortosilicato de tetraetilo) | N/A | N/A | Precursor de sílice para la síntesis sol-gel de vidrio bioactivo 45S5. INFLAMABLE |
| Microscopio electrónico de transmisión | JEOL Ltd. | JEM-2100 | Utilizado para la caracterización del tamaño y morfología de nanomateriales |
| Tritón X-100 (0,1 % en PBS) | N/A | N/A | Utilizado para la permeabilización celular antes de la inmunofluorescencia |
| Solución de azul de tripano (0,4 %) | Sigma-Aldrich | T8154 | Utilizada para la evaluación de viabilidad celular |
| Difractómetro de rayos X (X'PERT-PRO) | PANalytical | X'PERT-PRO | Utilizado para el análisis cristalográfico de nanopartículas |
Referencias
- Sui B et al. Dental pulp stem cells: from discovery to clinical application. J Endod. 2020;46(9 Suppl):S46-S55. doi:10.1016/j.joen.2020.06.027.
- Zhang W, Yelick PC. Vital pulp therapy: current progress of dental pulp regeneration and revascularization. Int J Dent. 2010;2010:856087. doi:10.1155/2010/856087.
- Zhang W et al. The performance of human dental pulp stem cells on different three-dimensional scaffold materials. Biomaterials. 2006;27(33):5658-68. doi:10.1016/j.biomaterials.2006.07.013.
- Elshahat S, Elgendy AA, Elsewify T. Osteogenic differentiation and proliferation of apical papilla stem cells using chitosan-coated nanohydroxyapatite and bioactive glass nanoparticles. Eur J Dent. 2024;18(2):665-71. doi:10.1055/s-0043-1777044.
- Huang M, Dissanayaka WL, Yiu CKY. Exploring the potential of stem cells from the apical papilla (SCAPs) in regenerative medicine: advantages, applications, challenges and opportunities. Stem Cell Res Ther. 2025;16(1):626. doi:10.1186/S13287-025-04705-8.
- Tran N, Webster TJ. Nanotechnology for bone materials. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 2009;1(3):336-51. doi:10.1002/wnan.23.
- Ding F, Guo S, Pan G. Emerging biomimetic materials with micro/nanostructure-dependent biological effects. Rev Mater Res. 2025;1(2):100040. doi:10.1016/j.revmat.2025.100040.
- Zaki NT, El-Helbawy M, Mahran AH, Elsewefy T. Effect of Neo-MTA and hydroxyapatite nanoparticles on proliferation and osteogenic differentiation of apical papilla stem cells (SCAPs) (in vitro study). J Pharm Negat Results. 2023;14. doi:10.47750/pnr.2023.14.02.344.
- Abdelaziz H, Mahran AH, Elsewify T. Osteogenic differentiation and proliferation of apical papilla stem cells using nanoparticles of Neo MTA and bioactive glass. Saudi Dent J. 2024;36(1):134-39. doi:10.1016/j.sdentj.2023.10.018.
- Habib N, Elgendy A, Elsewify T, Yehia T. The effect of Nano-NeoMTA2 and nanohydroxyapatite on the human dental pulp stem cells odontogenic differentiation and proliferation. Eur Endod J. 2026;11(4):158-65. doi:10.65717/eej.2026.25165.
- Ferraz MP, Monteiro FJ, Manuel CM. Hydroxyapatite nanoparticles: a review of preparation methodologies. J Appl Biomater Biomech. 2004;2(2):74-80.
- Xu F, Li Y, Wang X, Wang J, Yang A. Preparation and characterization of nano-hydroxyapatite/poly(vinyl alcohol) hydrogel biocomposite. J Mater Sci. 2004;39:5669-72. doi:10.1023/B:JMSC.0000040074.64787.b3.
- Tanomaru-Filho M et al. Biocompatibility and mineralized nodule formation of Neo MTA Plus and an experimental tricalcium silicate cement containing tantalum oxide. Int Endod J. 2017;50(Suppl 2):e31-e39. doi:10.1111/iej.12780.
- Rodríguez-Lozano FJ et al. Biomineralization potential and biological properties of a new tantalum oxide (Ta2O5)-containing calcium silicate cement. Clin Oral Investig. 2022;26(2):1427-41. doi:10.1007/s00784-021-04117-x.
- Okajcekova T et al. A comparative in vitro analysis of the osteogenic potential of human dental pulp stem cells using various differentiation conditions. Int J Mol Sci. 2020;21(7). doi:10.3390/ijms21072280.