$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Alta resolución clara Electroforesis en gel nativo (hrCNE) para el Complejo mitocondrial en gel ensayos de actividad
Células madre embrionarias humanas (hESCs) se mantuvieron en una monocapa de fibroblastos de ratón irradiados ˠ o mitomicina C tratados con embrionarias (MEFs), luego pasó a un crecimiento en Matrigel durante 5 días en el MEF-medio condicionado con las condiciones estándar. Para eliminar la contaminación MEFs, hESCs fueron re-chapada en Matrigel y cultivadas en MEF medio condicionado por otros 3 días. Microscopio de inmunofluorescencia para los marcadores de pluripotencia Oct-4 y SSEA 4 se utilizó para confirmar la falta de diferenciación de células madre.
- Lavar las células con PBS caliente 1x, pH 7,4, seguido de tripsinización (1 ml de tripsina 1x por pocillo en una placa de 6 pocillos) durante 5 min.
- Añadir un volumen igual de fresca inhibidor de tripsina (1mg/ml en 1x PBS, pH 7,4). Las células de la cosecha y se centrifuga a 200 g, 5 min, a temperatura ambiente.
- Deseche las células pellets sobrenadante y resuspender en 0,8 - 1.7ml (basado en el tamaño de la celda de pellets) de hielo frío aislamiento de amortiguación mitocondrias (83 mm de sacarosa; 6.6mm imidazol / HCl, pH 7,0) con un recién preparada "cóctel inhibidor de la proteasa. Incubar en hielo durante 10 min.
- Dounce células con un homogeneizador (~ 40 - 50 golpes). Tinción de una parte alícuota de las células dounced con azul tripán para comprobar la integridad de la homogeneización utilizando un microscopio de luz.
- Centrifugar a 20.000 g durante 10 min a 4 ° C para obtener un crudo pellet mitocondrial que también contiene núcleos y fragmentos más grandes de la célula. Se decanta y se desecha el sobrenadante y pesar el precipitado crudo mitocondrial de pellets. Los gránulos pueden ser almacenadas a -80 ° C tras la congelación instantánea en nitrógeno líquido, si esto es un punto de parada.
NOTA: centrifugación diferencial o de otros procedimientos basados en gradiente puede ser utilizado para el aislamiento y la recolección de una fracción pura membrana mitocondrial. Ver ref. 4 para más detalles. Este enfoque alternativo producirá la actividad mitocondrial complejo por mg de proteína mitocondrial en lugar de compleja actividad por mg de peso celular o el número de células. La concentración de proteínas mitocondriales tendrá que ser determinada después de la purificación para hacer esta comparación. Además, un aislamiento de amortiguación diferentes pueden ser necesarios para este enfoque. Para la solubilización de la fracción de membrana mitocondrial puro, vea la nota siguiente paso 6.
- Solubilizar el crudo pellet mitocondrial en el hielo por agitación con tampón de solubilización de hielo frío (50 mM NaCl, 50 mM imidazol / HCl pH 7,0, 1 mM EDTA, 2 mM de 6 aminohexanoico). Ácido 6-aminohexanoico puede ser sustituido por el cóctel inhibidor de la proteasa 1x. Use 35μl de tampón de solubilización por 20 mg de peso de pellets. Añadir 20μl de 10% w / v digitonina por 20 mg de peso pellet y mezclar agitando el tubo. Incubar durante 50-10 min en hielo. Dodecil-bD-maltoside o Triton X-100 puede ser sustituido por digitonina para solubilizar las proteínas. La elección del detergente y su cantidad puede afectar la formación de supercomplexes o formas multiméricas de los complejos mitocondriales. Para más información, consulte ref.1.
NOTA: La cantidad de detergente para solubilizar una fracción pura membrana mitocondrial corresponde a una relación en peso de detergente / proteína que van desde 2-6 g / g. La relación óptima para solubilizar las membranas mitocondriales es 2,5 g / g de dodecil-bD-maltoside, 3 g / g de Triton X-100, y 6 g / g de digitonina.
- Centrifugar el sedimento solubilizada a 100.000 g durante 15 min a 4 ° C. Recoger el sobrenadante claro.
- Añadir tampón de carga a una definitiva del 5% w / v de glicerol y 0,01% w / v Ponceau S (utilice un 50% w / v de glicerol, 0,1% w / v buffer Ponceau S carga solución madre).
- Pozos de carga de gel con un volumen que contiene 20-40mg del crudo pellet mitocondrial por carril. Use un gel con gradiente de acrilamida (4 -13%) con un 3,5% gel de apilamiento.
Nota: La preparación del gel y las condiciones de electroforesis:
Para la preparación de gel, use un acrilamida / bis-acrilamida (AA / bisAA) 3 mezcla de la siguiente manera: 48 gramos de acrilamida y 1,5 g de bisacrilamida (49,5% T, 3% C. Donde T es la concentración total de AA y bisAA y C es el porcentaje de entrecruzamiento (bisAA) a monómero total).
Gel buffer (3 '): 1,5 millones 6 aminohexanoico; 75mm imidazol, pH 7,0
| En gel de gradiente: | 4% | 13% | Gel de apilamiento: | 3,5% |
| AA / 3 bisAA mezcla | 2 ml | 6,5 ml | | 0,6 ml |
| Gel de amortiguación 3 ' | 8,3 ml | 8,3 ml | | 2,7 ml |
| Glicerol | | 5 g | | |
| H 2 O | 14,7 ml | 5 ml | | 4,7 ml |
| Volumen total | 25 ml | 25 ml | | 8 ml |
| 10% de APS | 139 l | 125 l | | 67 l |
| TEMED | 14 l | 12,5 l | | 6,7 l |
Ánodo de buffer: 25 mM imidazol / HCl, pH 7,0
Tampón catódico: Tricina 50 mM, 7,5 mm de imidazol / HCl, 0,02% w / v dodecil-bD-maltoside, 0.05% w / v desoxicolato, pH 7,0
Vierta y ejecutar los geles en un cuarto frío (4-7 ° C). La tensión inicial utilizada es de 100V. Cuando la muestra ha entrado en el gel de apilamiento, la tensión se eleva a 500 V con la corriente limitada a 15 mA (de 0.15 '14' 14 cm de gel). La electroforesis es detenido después de 3-4 horas cuando la línea divisoria de colorante rojo punzó el S se acerca a la parte delantera de gel. Por otra parte, un gel puede ser ejecutado durante la noche con una tensión constante en el 70-100V.
- En gel de ensayos de actividad. El tiempo de incubación para cada ensayo depende de la eficiencia de solubilización de proteínas y la cantidad de material cargado por pozo. Complejos I, IV y V por lo general el rendimiento señales más fuertes que los complejos II y III.
Complejo I (CI)
Incubar la rebanada de gel con CI de amortiguación (5 mM Tris-HCl, pH 7,4; 0.1mg/ml NADH; 2.5mg/ml NBT) a temperatura ambiente durante varias horas.
IC del búfer: Añadir por cada 100 ml de 5 mM Tris-HCl, pH 7,4:
0,01 g NADH
0,25 g de NBT
Fijar el gel en el 50% de metanol y ácido acético 10% para 15-45 min. El gel se mantiene fija en 10% de ácido acético.
El complejo II (CII)
Incubar la rebanada de gel con la CII buffer (20 mM succinato de sodio; methasulfate fenazina 0.2mm; 2.5mg/ml NBT, 5 mM Tris-HCl pH 7,4) a temperatura ambiente durante varias horas.
CII búfer: Añadir por cada 100 ml de 5 mM Tris-HCl, pH 7,4:
200μl succinato sódico 1M
80μl methasulfate fenazina (PMS 250 mm disuelto en DMSO)
0,25 g de NBT
Fijar el gel como se describe para el Complejo I
El complejo III (CIII)
Incubar la rebanada de gel con CIII buffer (fosfato de sodio 50 mM, pH 7,2, 0,05% de 3,3 '-diaminobenzidina tetrahidrocloruro (DAB)) a temperatura ambiente durante varias horas.
CIII búfer: Añadir por cada 100 ml de 50 mM de sodio-fosfato, pH 7,2:
50mg tetrahidrocloruro diaminobenzidina
Fijar el gel como se describe para el Complejo I
Complejo IV (CIV)
Incubar la rebanada de gel con CIV buffer (fosfato de sodio 50 mM, pH 7,2, 0,05% de 3,3 '-diaminobenzidina tetrahidrocloruro (DAB), 50 micras caballo corazón citocromo c) a temperatura ambiente durante varias horas.
CIV búfer: Añadir por cada 100 ml de 50 mM de sodio-fosfato, pH 7,2:
50mg tetrahidrocloruro diaminobenzidina
0,1 g de caballos corazón del citocromo c
Fijar el gel como se describe para el Complejo I
Complejo V (CV)
Incubar la rebanada de gel con tampón CV (35 mm Tris-base, 270 mm glicina, pH 8,3 a 25 ° C, 14 mm de MgSO 4, 0,2% w / v Pb (NO 3) 2, 8 mm ATP) a temperatura ambiente durante varias horas.
CV búfer: 100 ml por la solución de añadir:
| Tris-base | 0.424g |
| Glicina | 2.026g |
| MgSO4 | 0.345g |
| Pb (NO 3) 2 | 0.29g |
No hay necesidad de ajustar el pH (debe ser 8.3) - no utilizar ácido o base. Filtrar y añadir
Fijar el gel en el 50% de metanol durante 30 minutos y la transferencia de agua.