El protocolo de texto completo de este enfoque experimental está disponible en <a href="http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471143031/cp/cpcb/article/cb0101/current/abstract" target="_blank">protocolos actuales en Biología Celular</a> .

Los autores no tienen nada que revelar.

contar y determinar la viabilidad de las células cultivadas

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determinar el número de células en cultivo es importante en la normalización de las condiciones de cultivo y en la realización de experimentos precisa cuantificación. Un hemocitómetro es una lámina de vidrio de grosor con un área central diseñada como una cámara de recuento. Suspensión celular se aplica a un área definida y contó que la densidad celular se puede calcular.

Determinar el número de células en cultivo es importante en la normalización de las condiciones de cultivo y en la realización de experimentos precisa cuantificación. En este vídeo, se demuestra cómo las células se contaron usando un hemocitómetro.

Contar y determinar la viabilidad de las células cultivadas

Determinar el número de células en cultivo es fundamental para la estandarización de las condiciones de cultivo y para la realización de experimentos de cuantificación precisos. Un ...

La determinación del número de células y del cultivo es importante para la normalización de las condiciones de cultivo y al realizar experimentos en los que se necesitan cantidades precisas de células. A continuación, le mostraremos cómo contar células utilizando un hemocitómetro y cómo calcular la concentración de células presentes en suspensión. También le mostraremos cómo determinar el número de células viables presentes en su cultivo mediante el ensayo de viabilidad con azul de tripano.Hola, soy Ricky, del laboratorio del Dr. LAN en la Red de Laboratorios de Patología Molecular en el este de Tennessee. Hoy les mostraré cómo contar células en suspensión y cómo determinar su viabilidad. Para preparar el hemocitómetro para el recuento celular, primero debe limpiar su superficie y la cubierta que lo acompaña con etanol al 70 %.El cubreobjetos y el portaobjetos deben estar limpios, secos y libres de pelusas, huellas dactilares y marcas de agua. A continuación, humedezca ligeramente los bordes del hemocitómetro con agua del grifo y presione el cubreobjetos sobre él. El cubreobjetos debe quedar uniformemente apoyado sobre el área plateada de conteo.Ahora estamos listos para la suspensión celular para preparar la suspensión de células para el recuento. Primero, si las células se cultivan en cultivos en monocapa, desprenda las células de la superficie de la placa utilizando tripsina, como se muestra en el video para el trasplante de células. Una vez que las células se hayan desprendido de la placa, dilúyalas según sea necesario para obtener una suspensión uniforme.Asegúrese de dispersar cualquier grumo en la suspensión al usar el hemocitómetro. Se recomienda un recuento máximo de 20 a 50 células por cuadrado de un milímetro. Cuando esté listo para cargar el hemocitómetro con su muestra de células, utilice una micropipeta para transferir la suspensión celular al borde de la cámara de conteo del hemocitómetro.Sostenga la punta de la pipeta debajo del cubreobjetos y desprenda una gota de la suspensión. La suspensión será arrastrada debajo del cubreobjetos por acción capilar. Una vez que haya llenado la primera cámara, llene la segunda cámara de recuento y estará listo para contar sus células antes de comenzar a contar.Permita que las células se asienten durante unos minutos. También es útil absorber cualquier líquido en exceso una vez que las células se han asentado. Puede observar la preparación en el microscopio con una magnificación de cien x.Debe observarse la gran área central de la cuadrícula, que está delimitada por un conjunto de tres líneas paralelas. Las subdivisiones dentro del área central también están delimitadas por tres líneas paralelas, y cada subdivisión se divide en 16 cuadros más pequeños mediante líneas simples. Las células dentro de esta área deben distribuirse uniformemente sin formar agregados.Si las células no están distribuidas uniformemente, lave y recargue. El citómetro hemo utiliza un contador manual para contar las células en cada uno de los cuatro cuadrados de las esquinas y en el cuadrado central. No se cuentan las células que tocan la línea media de las líneas triples en la parte superior e izquierda de los cuadrados; sin embargo, sí se cuentan aquellas que tocan la línea media de las líneas triples en la parte inferior o derecha del cuadrado.Repita los conteos para la otra cámara de recuento. Una vez que haya contado las células, puede determinar el número de células por mililitro. Para hacer esto, tome el promedio del conteo de células por cuadrado y multiplíquelo por el factor de dilución y por 10 000 para obtener el número de células en su muestra.Multilique el número de células por mililitro por el volumen total de la suspensión celular del que se tomó la muestra. Ahora estamos listos para determinar la viabilidad de nuestra suspensión. Para determinar el número de células viables en su muestra, utilizaremos el azul de tripano: primero, combine 0,5 mililitros de azul de tripano al 4%, 0,03 mililitros de HBSS y 0,1 mililitros de la suspensión celular en un tubo pequeño, mezcle bien y deje reposar el tubo durante cinco minutos antes de cargar el hemocitómetro.Las células viables no deben estar teñidas, pero las células muertas aparecerán azules bajo el hemocitómetro. Cuente el número total de células y el número total de células viables, es decir, células no teñidas, y calcule el porcentaje de células viables en su muestra. Una vez que haya terminado, descontamine la lámina cubreobjetos del hemocitómetro enjuagándola con etanol al 70 % y luego con agua desionizada.Déjelo secar al aire y guárdelo para usos futuros. Acabamos de mostrarle cómo determinar el número y la viabilidad de sus células cultivadas. Eso es todo.Gracias por vernos y mucha suerte con todos sus experimentos.

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Molecular Pathology Laboratory Network, Inc.  Determinar el número de células en cultivo es importante en la normalización de las condiciones de cultivo y en la realización de experimentos precisa cuantificación. En este vídeo, se demuestra cómo las células se contaron usando un hemocitómetro.

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