Desde MEFs a Matrigel 3: hESCs pases de Matrigel en Matrigel

Resumen

Este video muestra la forma de mantener el crecimiento de células madre embrionarias humanas (hESCs) en el alimentador de células libres de condiciones y la forma de hESCs paso continuo en el alimentador de células libres de condiciones. La confirmación de células madre cultivadas en el alimentador de pluripotencia de células en condiciones libres por microscopía de inmunofluorescencia se demuestra también.

Resumen

Este video muestra la forma de mantener el crecimiento de células madre embrionarias humanas (hESCs) en el alimentador de células libres de condiciones y la forma de hESCs paso continuo en el alimentador de células libres de condiciones. La confirmación de células madre cultivadas en el alimentador de pluripotencia de células en condiciones libres por microscopía de inmunofluorescencia se demuestra también.

Protocolo

HESCs división de Matrigel de Matrigel

Por lo general, una confluencia de 6 pocillos de hESCs en Matrigel se puede dividir 1:03-1:05 a otra placa de Matrigel, con los pozos cada vez más confluentes 4-5 días después de partir.

1. CM y las placas de Matrigel se preparan como se describe arriba antes de separarse.
2. En el día de la división, lave cada pocillo para dividir con PBS 1X, pH 7,4, agregar 1 ml de 1mg/ml Dispasa (la solución diluida de valores 5mg/ml con DMEM/F12 los medios de comunicación) a cada pocillo y se incuba a 37 ° C durante 3 min.
3. Lavar cada pocillo tres veces con PBS 1X, pH 7,4, agregar 1 ml de ES medios de comunicación sin bFGF, use una espátula para raspar las colonias de células de la parte inferior del pozo, recoger las hESCs en suspensión en un tubo de 50 ml de halcón, y el precipitado por centrifugación a 200 g por 5 min a temperatura ambiente.
4. Para volver a la placa de hESCs en las placas de Matrigel, primero se deben lavar las placas con Matrigel DMEM/F12 y añadir 2,5 ml de la CM complementado con 10ng/ml bFGF por pozo. Resuspender las células madre de pellets en un volumen adecuado de CM complementado con 10ng/ml bFGF, pipeta de la suspensión celular arriba y hacia abajo tres veces. (NOTA: Cuando hESCs para la división proviene de las placas Matrigel, los grupos son muy fáciles de romper, por tres rondas de pipeteado es suficiente y más de pipeteo puede alterar demasiado las colonias y hacer que las células individuales.) Alícuota de 0,5 ml de suspensión de células madre por grupos pocillo de la placa de 6 pocillos Matrigel para lograr 3 ml por pocillo en un volumen final. Colocar la placa en una incubadora a 37 ° C.

Detección de marcadores de pluripotencia por microscopía de inmunofluorescencia

Microscopio de inmunofluorescencia se utiliza para examinar la expresión de marcadores de células madre pluripotencia Oct-4 y 4-SSEA durante el cultivo.

1. Aspirar los medios de comunicación de un bien y lavar con PBS 1X, pH 7,4. Añadir 2 ml de 3,7% de formaldehído al pozo para fijar durante 10 min.
2. Enjuague con 1XPBS, pH 7,4, agregar 2 ml de metanol para el bienestar y el lugar de -20 º C durante 2 min.
3. Enjuague con 1XPBS, pH 7,4, y el bloque con 1 ml de 0,2% serume albúmina bovina (BSA) durante 5 min.
4. Añadir 1 ml de anticuerpos Oct-4 o anti-h/mSSEA-4 (dilución 1:200 en 0,2% de BSA) y se incuban a temperatura ambiente durante 1 hora o menos 4 ° C durante la noche. (NOTA: para SSEA-4 tinción, vaya directamente al paso 6)
5. Enjuáguese la boca tres veces con 1XPBS, pH 7,4, agregar FITC-conjugado de IgG de conejo (dilución 1:500 en 0,2% de BSA) y se incuban a temperatura ambiente durante 1 hora.
6. Enjuague tres veces con 1XPBS, pH 7,4, y poner una gota de solución de montaje (puede contener DAPI nuclear si la visualización se desea) en el centro del pozo. Poner el cubreobjetos en la parte superior de las células, sello con el esmalte de uñas, y evaluar por microscopía de inmunofluorescencia.

Recibos de embriones humanos con células madre

ES medios de comunicación (medios de comunicación de células madre embrionarias):

DMEM/F12 - 400ml
Octavos de final de suero Replacer - 100 ml
No aminoácidos esenciales - 5 ml
200 mM Glutamax / BME de soluciones - 5 ml
Penicilina / estreptomicina - 5 ml

Mezclar bien y guardar final de Medios de cultivo células madre en botellas de 500 ml a 4 ° C. Bueno para un máximo de dos semanas.

MEF cultura de los medios:

DMEM - 1000 ml
FBS - 100 ml
No aminoácidos esenciales - 10 ml
Glutamina - 10ml
Penicilina / estreptomicina - 10ml

Mezclar bien y guardar final de Medios de Cultivo MEF a 4 ° C.

200 mM Glutamax / BME de solución:

Glutamax - 100 ml
β-mercaptoetanol (solución de archivo de 14,3 millones) - 140 μ1
Mezclar dos soluciones bien y luego las alícuotas de 10 ml. Mantenga alícuotas a -20 ° C.
bFGF solución (concentración final de stock: 10 microgramos / ml):
bFGF (FGF2) - 50 mg
0,1% de BSA en 1XPBS, pH 7,4 - 5 ml

Disolver 50 microgramos bFGF en 5 ml de BSA al 0,1% para un 10 ug / ml de caldo. Alícuota en porciones de 500 microlitros. Almacenar a -80 ° C.

Colagenasa IV de la solución (1mg/ml):

Colagenasa IV - 50 mg
DMEM/F12 los medios de comunicación - 50ml

Agregue el polvo de la colagenasa IV a un tubo de 50 ml de halcón. En la capilla, la mezcla en 50 ml de agua estéril DMEM/F12 los medios de comunicación. Vortex la solución de <1 min. para asegurarse de que el polvo se disuelva. En la capilla, pasan por un filtro de 0,22 micras en un nuevo tubo de 50 ml estéril halcón. Esta solución es buena para un máximo de 2 semanas si se almacena a 4 ° C.

Dispasa solución (1mg/ml):

Dispasa 5mg/ml - 2 ml
DMEM/F12 los medios de comunicación - 8ml

Alícuota comerciales 5mg/ml solución Dispasa y almacenar a -20 ° C. Diluir dispasa a 1mg/ml utilizando DMEM/F12. Esta solución puede conservarse durante una semana a 4 ° C.

Discusión

Esta serie de tres videos muestra cómo crecer células madre embrionarias humanas (hESCs) en fibroblastos de embriones de ratón (MEF), las células de alimentación (video 1), cómo paso a Matrigel libre de células de alimentación placas (video 2), y cómo mantener la hESCs por pases en el alimentador de Matrigel de células en condiciones libres (video 3). Numerosos estudios previos mostraron que el mantenimiento de hESCs viable, no diferenciado requiere la cultura en las células inactivadas MEF alimentador. Sin embargo, para muchos experimentos...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sustituto de suero para knockout (KSR)	Reactivo	GIBCO, por Life Technologies	10828-028
DMEM/F12	Reactivo	GIBCO, por Life Technologies	11330-057
Aminoácidos no esenciales	Reactivo	GIBCO, por Life Technologies	11140-050
GlutaMax	Reactivo	GIBCO, por Life Technologies	35050-061
DMEM	Reactivo	GIBCO, por Life Technologies	11995-065
SFB	Reactivo	Clontech Laboratories	631107
L-glutamina	Reactivo	GIBCO, por Life Technologies	25030-081
BME	Reactivo	Fisher Scientific	BP176-100
bFGF	Reactivo	R&D Systems	233-FB-025
Colagenasa IV	Reactivo	GIBCO, por Life Technologies	17104-019
Dispasa	Reactivo	Stem Cell Technologies	17105-041
Penicilina / Estreptomicina	Reactivo	GIBCO, por Life Technologies	15140-122
Gelatina	Reactivo	Chemicon International	ES-006-B
Matrigel	Reactivo	BD Biosciences	354277
Anticuerpo Oct-4	Reactivo	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-9081
Anticuerpo monoclonal de ratón IgG3 conjugado con fito–eritrina anti-h/mSSEA-4	Reactivo	R&D Systems	FAB1435P
Anticuerpo secundario conjugado con FITC antiinmunoglobulina G de conejo	Reactivo	Jackson ImmunoResearch	715-095-152