Células madre embrionarias humanas: Cultura a partir de células congeladas

Resumen

Aquí se demuestra cómo nuestro laboratorio se inicia una HUES madre embrionarias humanas de cultivo de células de línea de un stock congelado.

Resumen

Aquí se demuestra cómo nuestro laboratorio se inicia una HUES madre embrionarias humanas de cultivo de células de línea de un stock congelado. En primer lugar, de uno a dos días de edad diez placa cm de aproximadamente una (o dos) millones de embriones de ratón irradiado células alimentadoras de fibroblastos se enjuaga con medios tonos para eliminar el suero residual y los desechos celulares, y luego los medios de comunicación HUES y se deja que se equilibre en el celular incubadora de cultivo. Un vial congelado de las células de almacenamiento a largo plazo o en el congelador de nitrógeno líquido a-80C es de origen y se sumerge rápidamente en un baño de agua 37 º C para la descongelación rápida. Las células en los medios de congelación se retira del vial y colocada en una gran cantidad de medios tonos. El gran volumen de los tonos medios de comunicación facilita la eliminación del exceso de suero y DMSO, que puede causar HUES células madre embrionarias humanas para diferenciar. Las células son suavemente se salió de la suspensión, y luego volvió a suspender en un pequeño volumen de los medios de comunicación HUES dulce que se utiliza para sembrar la placa MEF. Se considera importante que la semilla de la placa MEF añadiendo lentamente las células tonos en forma gota a gota de manera uniforme a dispersarse por todo el plato. La placa de reciente creación HUES cultura se devuelve a la incubadora durante 48 horas antes de que los medios de comunicación se sustituye, a continuación, se alimenta cada 24 horas después.

Protocolo

Deshielo de un stock congelado:

1. Antes de descongelar las células de colores, asegurarse de que la placa MEF ya ha preparado adecuadamente es plateado y en buenas condiciones. NO trate de utilizar una placa de menos deseables, o uno que tiene más de tres días. Se recomienda que antes de la etiqueta de todos los tubos cónicos y los pozos que se utiliza.
   
   
2. Pre-cálidos tonos medios de comunicación a 37 ° C. HUES medios alícuota en un tubo estéril cónica para cada línea. Quitar HUES vial / s de -80 e inmediatamente sumergir la parte inferior del tubo en un baño de agua 37 ° C. Se debe tener unos 45-60 segundos antes de que las células son del 80% descongelado (pequeña porción de helado a la izquierda).
   
   
3. Llevar rápidamente el tubo a la campana de flujo laminar, rocíe con el 70% de alcohol, y suavemente la transferencia de células a la de pre-calentado los medios de comunicación. Girar el tubo, retire el material, y resuspender en un volumen adecuado de agua dulce, previamente calentada medios tonos.
   
   
4. Aspirar fuera de los medios de comunicación MEF como de muchos pozos que se le deshielo en. Rápidamente, alícuota precalentado medios HUES de nuevo en cada pocillo de la placa, teniendo cuidado de no molestar a los adjuntos MEFs. Ajuste el plato a un lado de la campana. Al igual que con MEFs, mejores resultados se obtienen si las gotas se distribuyen uniformemente sobre la placa. Cuidadosamente la placa de retorno a una incubadora a 37 ° C durante la noche para permitir que las células tonalidades para sembrar el MEFs. Cambiar los medios de comunicación ~ 48 horas después de la descongelación, en sustitución de los medios de comunicación HUES fresco.

Discusión

En este vídeo, se muestra cómo nuestro laboratorio de rutina establece un HUES madre embrionarias humanas de cultivo de células de una masa congelada. Este proceso es susceptible de uso general en cualquier célula de mamífero si es congelado en una solución de DMSO. Descongelación eficiente es esencial para establecer una nueva cultura de las células de tonalidades de un stock congelado, y es importante para la consistencia experimental.

Materiales

HUES medios 651,5 ml DMEM KO-500 ml 6,5 ml Penstrep glutamina 6,5 ​​ml 6,5 ml AANE beta-mercaptoetanol 0.5ul KO Suero Reemplazo 65 ml 65 ml Plasmanate bFGF2 (10 ng / ml final) 0,65 ml