Demostración de técnicas de hibridación del genoma entero matriz Genómica Comparativa

Resumen

Este video es una demostración técnica del protocolo de hibridación para todo el genoma amplia baldosas CGH camino, que escanea todo el genoma humano utilizando sólo 25 a 100 ng de ADN que se puede aislar de una variedad de fuentes, incluyendo archivos de material fijado en formol.

Resumen

Hibridación amplia genómica comparada (CGH array) es un método para la detección de pérdidas y ganancias de los segmentos de ADN o la dosis del gen en el genoma de ^uno. Los recientes avances en esta tecnología han permitido la comparación de alta resolución de todo el genoma para la identificación de alteraciones genéticas en el cáncer y otras enfermedades genéticas ^2. La Sub-Megabase Resolución mosaico conjunto de matriz (o SMRT) serie se compone de un conjunto de aproximadamente treinta mil superposición de cromosomas artificiales bacterianos (BAC) clones que abarcan todo el genoma humano en ~ 100 pares de kilobases (kb) segmentos ^2. Estos objetivos son BAC individual sintetizados y manchado por duplicado en un portaobjetos de vidrio solo ^2-4. Array CGH se basa en el principio de la hibridación de la competencia. Muestra de ADN de referencia y son diferencialmente etiquetados con cianina-3 y colorantes cianina-5 fluorescentes, y co-hibridizada a la matriz. Después de un período de incubación de las muestras no unidos son lavados de la diapositiva y la matriz es fotografiado. Un paquete de software a libre disposición denominado SeeGH (www.flintbox.ca) se utiliza para procesar el gran volumen de datos recopilados - un solo experimento genera 53.892 puntos de datos. SeeGH visualiza la señal log2 relación de intensidad entre las dos muestras en cada objetivo BAC, que se alinea verticalmente con la posición de los cromosomas ^5,6. La matriz SMRT puede detectar alteraciones tan pequeños como 50 kb de tamaño ^7. La matriz SMRT puede detectar una variedad de eventos de reordenamiento del ADN incluyendo las ganancias de ADN, las pérdidas, amplificaciones y deleciones homocigóticas. Una ventaja única de la matriz SMRT es que uno puede usar el ADN aislado de las muestras en formol fija parafina embebidos. Cuando se combina con los requisitos de entrada bajos de ADN amplificado (25-100 ng) esto permite que el perfil de las muestras preciosas tales como los producidos por microdisección ^7,8. Esto se atribuye al gran tamaño de cada objeto de la hibridación BAC, que permite la unión de suficientes muestras etiquetadas para producir las señales para la detección. Otra de las ventajas de esta plataforma es la tolerancia de la heterogeneidad del tejido, la disminución de la necesidad de microdisección de tejidos tedioso ^8. Este protocolo de vídeo es un tutorial paso a paso de etiquetado de la entrada de ADN a través de adquisición de señal para el conjunto del genoma mosaico toda SMRT camino.

Protocolo

SONDA DE ETIQUETADO

Nota: limitar la exposición de tintes Cye a la luz en todo momento (esto se puede lograr mediante el trabajo en un área oscura o mediante el blindaje de los tubos con una cubierta como una lámina de aluminio)

1. Combine:
   (Instalación de un tubo de reacción de referencia y un tubo de reacción de la muestra)
   • ADN (25-400 ng)
   • 5 l de tampón 5X cebadores aleatorios (concentración final: 5 veces Promega Klenow de amortiguación y 7 mg / l octamers al azar)
   • Diluir a 17,0 l de volumen total con H ₂ O destilada
2. Hervir durante 10 minutos a ....

Discusión

ADN de mala calidad no proporcionan un perfil de hibridación bien. Es esencial para asegurar que la muestra de ADN de referencia y están libres de contaminantes tales como el ARN fenol, sal, etc, que pueden interferir con el paso de etiquetado primer azar antes de iniciar un experimento de hibridación. Por ejemplo, la resuspensión de ADN en Tris - EDTA (TE) en lugar de agua no se recomienda como alta concentración de sal puede inhibir la reacción de marcaje. Se recomienda ensayar la calidad del ADN utilizando el espectrofotómetro Nanodrop p.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Buffer Klenow 5X	Reactivo	Promega Corp.
Octámeros aleatorios	Reactivo	Alpha DNA
Mezcla de dNTP 10X	Reactivo	Promega Corp.		2 mM dATP, dGTP, dTTP, 1,2 mM dCTP
dCTP marcado con Cy-3	Reactivo	GE Healthcare
dCTP marcado con Cy-5	Reactivo	GE Healthcare
ADN genómico humano de referencia	Reactivo	Novagen, EMD Millipore		Ejemplo de una posible referencia
Klenow	Reactivo	Promega Corp.
Columna YM-30	Reactivo	EMD Millipore
ADN Cot-1	Reactivo	Invitrogen
DIG Easy	Reactivo	Roche Group
ADN de esperma de arenque fragmentado	Reactivo	Promega Corp.
Cubreobjetos	Reactivo	Fisher Scientific		22 mm x 60 mm
Casete de hibridación	Herramienta	Telechem