Monte doble entero hibridación in situ de embriones de pollo temprano

Resumen

Este video muestra a 2 colores montar toda la hibridación in situ, un método por el cual el patrón de expresión espacial y temporal de dos genes diferentes se pueden visualizar en embriones de pollo joven. Este método fue introducido originalmente por David Wilkinson, Henrique Domingos, Ingham Phil y David Ish-Horowicz.

Resumen

El embrión de pollo es una herramienta valiosa en el estudio del desarrollo embrionario temprano. Su transparencia, accesibilidad y facilidad de manipulación, lo hacen una herramienta ideal para estudiar la expresión génica en el cerebro, tubo neural, somite y la formación de primordios corazón. Este video muestra los diferentes pasos en el monte de 2 colores toda la hibridación in situ, En primer lugar, el embrión se diseca del huevo y se fijaron en paraformaldehído. En segundo lugar, el embrión se procesa para prehibridación. El embrión se hibrida con dos sondas diferentes, una junto a la DIG, y un acoplado a FITC. Tras la hibridación noche a la mañana, el embrión se incuba con anticuerpo acoplado DIG. Reacción de color de sustrato DIG se lleva a cabo, y la región de interés se ve azul. El embrión se incuba con anticuerpos FITC acoplados. El embrión se procesa para la reacción de color con FITC, y la región de interés se ve rojo. Finalmente, el embrión se fija y se procesaron para phtograph y seccionamiento. Una guía de solución de problemas también se presenta.

Protocolo

Parte 1: La fijación de los embriones

1. Rellene plato disección con helada DEPC PBS. Mantener en hielo. Abrir el huevo tocando la concha con una pinza y retirar pedazos de la cáscara.
2. Eliminar la albúmina de espesor con pinzas. Inclinación del saco vitelino con pinzas gruesas para que el embrión hacia arriba.
3. Con la tijera, cortar un cuadrado de alrededor del saco vitelino del embrión.
4. Usando una cuchara, retire embrión a partir de yema de huevo y colocar en hielo frío DEPC PBS.
5. Bajo el microscopio, retire las membranas y la yema y traslado al plato de fijación.
6. Precisar, eliminar DEPC PBS. Reemplazar con PFA al 4% en PBS con DEPC y fijar O / N a 4 ° C.
7. Eliminar el fijador. Vuelva a colocar con helada DEPC PBS. Utilizando una aguja de punta roma microcapilar o un cuchillo de microdisección, perfore el sistema nervioso y las cavidades del corazón, para evitar la captura de la sonda.
8. Lavar 2 veces 10 minutos con DEPC PBS con 0,1% de Tween-20 (PBT). Deshidratar 10 minutos cada uno en el 25%, 50%, 75% de metanol en PBT. Deshidratar los embriones en dos ocasiones en metanol al 100%. Almacenar a -20 ° C en metanol.

Parte 2: prehibridación

1. Rehidratar embriones 10 minutos cada uno en el 75%, 50% y 25% de metanol en PBT. Lavar 2 veces 10 minutos en PBT.
2. Mientras tanto, prepare fijador fría (4% de paraformaldehído en PBT). Vuelva a colocar PBT con proteinasa K solución (3 ml / vial; [? 5 g / ml] final en PBT). Asegúrese de que el vial está expuesto a una solución de proteinasa K por suaves ondulaciones del vial, consulte Solución de problemas para los tiempos de exposición.
3. Utilizando RNasa libre pipeta Pasteur eliminar proteinasa K y añadir el fijador (2 ml). Colocar inmediatamente en hielo durante exactamente 20 minutos.
4. Todos los lavados se llevan a cabo en la RT nutator. Lavar 2 veces 10 minutos en el PBT, y 1x 10mn en PBT con 50% de tampón de hibridación.
5. Lavado 1X en tampón de hibridación. Se incuba a 65 ° C en 2 ml de tampón de hibridación 05.04 horas.

Parte 3: embriones híbridos con sondas

1. DIG y FITC síntesis de la sonda unida se describe en el Apéndice. La sonda de espera para dar una señal fuerte, debe ser synhesized con FITC-que contiene nucleótidos, la sonda más débiles deben ser sintetizados con con DIG-que contiene los nucleótidos.
2. Precaliente sondas de hibridación de amortiguación (500 ng / ml cada una) mediante un vial de 2 ml. Rápidamente reemplazar el tampón de hibridación con la solución de la sonda. No deje que los embriones seco. Incubar durante 16 horas a 65 ° C.
3. Vuelva a colocar la sonda con el tampón de hibridación, lavados de 2, 30 mn cada uno a 65 ° C. Lavado de 15 minutos en tampón de hibridación / MABT (1 / 1 v / v /) a 65 ° C.

Parte 4: incubación DIG anticuerpos y la reacción de color

1. Lave 2x20 mn en MABT. Lavado de 1 hora en el 2% BBR / MABT. Lávese las 5 horas en el 2% BBR/20% HISS / MABT (tampón de bloqueo). Incubar en 1:2000 de anticuerpos DIG diluido en tampón de bloqueo, O / N a 4 ° C en nutator.
2. Lave 3 veces cada 10 minutos en MABT, y 3x 1 hora cada uno en MABT.
3. Lavar 2 veces 20 minutos en NTMT. Añadir 200ul NBT / BCIP sustrato NTMT de 10 ml. Quitarse de inmediato NTMT de vial y reemplazar con 1-2 ml NBT / BCIP buffer. Lugar en la oscuridad. Monitorear la reacción de color después de 20 minutos y, posteriormente, a intervalos de 20 mn.
4. Tras la reacción de color (azul debe aparecer), lavar en PBS durante 10 minutos, de precisar en un plato lleno de fijación con PBS, y reemplazar la solución con 4% PFA en PBS. Fix O / N a 4 ° C.
5. Traslado al nuevo vial de centelleo. Lave en PBST (PBS con 1% de Tween-20) 2x10 mn. Lave en MABT 2x 10 mn.
6. Incubar en MABT 30 minutos a 63 ° C.

Parte 5: incubación de anticuerpos FITC y color de la reacción

1. Lavar 2 veces 10 minutos en MABT, 1 hora en el 2% BBR / MABT, 5 horas en tampón de bloqueo
2. Incubar en la fosfatasa alcalina-junto anti-FITC-anticuerpo (1:500) O / N a 4 ° C.
3. Lave 3 veces cada 10 minutos en MABT, y 3x 1 hora cada uno en MABT.
4. Lave en 2x 20 minutos en TBS pH 8,45, con 0,1% de Tween-20 (TBST).
5. Prepare una solución vectorial Red de trabajo (5 ml) en TBST utilizando reactivos 1,2 y 3 incluye en el kit. Quitarse de inmediato la TBST de vial y reemplazar con el vector de búfer Roja. Lugar en la oscuridad. Monitorear la reacción de color después de 40 minutos, y en intervalos de 30 mn a partir de entonces.
6. Tras la reacción de color (deben aparecer de color rojo), los embriones de transferencia de PBS.

Parte 6: La fijación y el procesamiento

1. Traslado al plato de fijación que contiene PBS, y fijar en PFA al 4% durante 20 min a temperatura ambiente o S / N a 4 ° C.
2. Se lavan con PBS, 2 veces 10 minutos. Para el proceso de la fotografía, la transferencia y el 20% de glicerol en PBS (esto hará que los embriones transparentes). Para crear una cámara, cortar dos tiras de cinta de PVC, superponerlos en la diapositiva. Corte un cuadrado en el centro con una cuchilla. Retire las pinzas cuadrados utilizando.
3. Para el proceso de corte de cera, traslado de regreso a la PBS, lavar 2 veces 10 minutos, deshidratar en serie gradual de metanol (25%, 50%, 75% y 100% en PBS, a 10 minutos cada uno).
4. Reemplazar con propanol, 3 millones. Reemplazar con 1,2,3,4-tetrahidronaftaleno, a 20 minutos seguido por Histoclear (2x 1 hora). Reemplazar con histoclear / cera 1 / 1 (v / v) 60 ° C durante 1 hora. Vuelva a colocar la cera de un procesode la histología.

Parte 7: Soluciones

Tampón de hibridación, almacenar a -20 ° C en Falcón, 50 ml: 25 ml de formamida, 3.25 ml (20xSSC), 0,5 ml (0,5 M EDTA), 1 ml (10% de Tween-20), 2,5 ml (1% SDS) , 125 ul (20mg/ml tRNA);. 100ul (50 mg / ml de heparina) MABT, preparar ácido maleico 100 mM, pH de 7,5 con NaOH pellets. Añadir 150 mM NaCl y 0,1% Tween-20.

NTMT (hace justo antes de su uso), 50 ml: 1 ml (5M NaCl) 2,5 ml (2 M Tris-HCl pH9.5), 1,25 ml (2 M MgCl _2), 5 ml (10% de Tween-20).

TBST: 0,1 M Tris-HCl, NaCl 0,15 M, pH 8,45, 0,1% Tween-20.

Parte 8: Solución de problemas

Problema	Causa	Remedio
Embrión es un ovillo	Deshidratación insuficiente / rehidratación	Mantener intervalos de 10 mn durante los sucesivos deshidratación / rehidratación pasos
No hay ninguna señal de la sonda	La sonda se degrada la contaminación RNasa en vial	Ejecutar la sonda en un 1% en gel de agarosa Asegúrese de que el vial está expuesto a la proteinasa K solución en el paso 2
La sonda está etiquetas cavidades del corazón de un tubo neural	La sonda está atrapado	En el paso 2, asegúrese de que todas las cavidades están perforadas con un cuchillo o microdisección microcapilar
Embrión se desintegró después de la hibridación (paso 3)	Proteinasa K paso a la izquierda la temperatura de hibridación demasiado tiempo es demasiado alto	Proteinasa K no se debe dejar más de 1 millón de (etapas 3 + y 4), 2 mn (fase 5 a 7), 3 mn (fase 8-10), 4 mn (etapa 11-13) no hibridan en T o superior de 65 º C

Parte 9: Resultados de Representante

Embriones representativos se muestran a continuación: (A) embrión (fase HH7) está marcado con una sonda DIG-Medias (azul) y FITC-delta-1 de la sonda (rojo). (B) embrión (fase HH8) está marcado con una sonda DIG-Pax6 (azul) y una sonda FITC-Shh (rojo). NF, de los nervios veces, la ANP, la placa neural anterior, psm, mesodermo presomitic, n, notocorda, nt, del tubo neural). Regalos de la sonda de los laboratorios de los doctores. C. Tabin, M. Goulding, Henrique D., y J. Briscoe.

Discusión

Todo el monte de 2 colores en el método de hibridación in situ se utiliza para determinar los patrones espaciales y temporales de la expresión génica, utilizando uno o dos genes de interés. Las aplicaciones incluyen la evaluación de patrones de expresión génica de los genes de la novela (por ejemplo, ^1,2, así como los cambios en la expresión génica insulto siguientes (manipulaciones embrionarias ^{3, 4} bolas, y la electroporación de ARN o ADN construye ^5).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Huevos	Animal	Charles River Laboratories	Premium Fértil
Stereo microscopio	Microscopio	Leica Microsystems	MZ9.5
Incubadora automática Marsh	Herramienta	Lyon	RX
Incubadora de hibridación	Herramienta	Hybaid	Micro-4
Mezclador orbital Adams Nutator	Herramienta	Fisher Scientific	14-062
Pinzas curvas (1)	Herramienta	Electron Microscopy Sciences	72991-4C
Tijeras finas	Herramienta	Fine Science Tools	14161-10
Cucharilla	Herramienta	Fine Science Tools	10370-18
Pipeta capilar Pasteur		Electron Microscopy Sciences	70950-12
Tubo microcapilar		Sigma-Aldrich	P1049-1PAK	Tirar usando un tirador vertical de micropipetas; romper el extremo con pinzas finas
Cuchillo de microdisección		Fine Science Tools	10056-12	Usar para perforar cavidades antes de la hibridación in situ
Alfileres Minuten, diámetro 0,2 mm		Fine Science Tools	26002-20	Mantener los alfileres juntos usando un agitador magnético;
Agente de curado y base de elastómero de silicona Sylgard 184	Reactivo	Dow Corning	0001986475	Mezclar 1 parte de agente de curado con 9 partes de base; dejar toda la noche a 37 °C
Diethylpirocarbonato (depc)	Reactivo	Acros Organics	10025025	Añadir 1 ml de depc a 1 l de PBS; agitar; autoclavar
PFA al 16%	Reactivo	Electron Microscopy Sciences	15710
Tween-20	Reactivo	Sigma-Aldrich	P1379-100ML
Proteasa K		Sigma-Aldrich	P2308-5MG	Preparar stock a 10 mg/ml en depc-H₂O en alícuotas de 10 µl. Almacenar a -20 °C.
Formamida desionizada	Reactivo	Ambion	9342
tRNA de levadura - 25 mg	Reactivo	Invitrogen	15401-011	Preparar stock a 20 mg/ml en depc-H₂O en alícuotas de 125 µl. Almacenar a -20 °C
Heparina, sal sódica	Reactivo	Sigma-Aldrich	H4784-250MG	Preparar stock a 50 mg/ml en depc-H₂O en alícuotas de 100 µl. Almacenar a -20 °C.
SSC x20 pH 5,5	Reactivo	Fisher Scientific	PR-V4261
EDTA (0,5 M)	PR-V4231	Fisher Scientific
SDS	Reactivo	Fisher Scientific	BP166-100
Ácido málico	Reactivo	Fluka	63189
Reactivo bloqueante B–hringer	Reactivo	Roche Group	11096176001	Usar al 2% en MABT. Para prepararlo, calentar con MABT durante 20 min a 60 °C. Puede prepararse un stock y almacenarse en alícuotas de 1-5 ml a 20 °C.
Suero de oveja inactivado por calor	Reactivo	Jackson ImmunoResearch	013-000-121	Disolver en 10 ml de H₂O; calentar a 55 °C durante 30 min. Aliquotar en 1 ml y almacenar a -20 °C.
Anti-digoxigenina-AP, fragmentos Fab	Reactivo	Roche Group	11093274910
Solución stock de NBT/BCIP	Reactivo	Roche Group	11681451001
Anti-fluoresceína-AP, fragmentos Fab	Reactivo	Roche Group	11426338910
Tris 2 M	BP1759-500	Fisher Scientific
Kit de sustrato de fosfatasa alcalina Vector Red	Reactivo	Vector Laboratories	SK-5100
1,2,3,4-tetrahidronaftaleno	Reactivo	Sigma-Aldrich	429325-100ML	Bajo campana extractora