Artículo de método
Hemos desarrollado la respuesta de Visual-Motor para cuantificar la potencia del motor de larvas de pez cebra en respuesta a incrementos de la luz y disminuye. También se examinaron el pez cebra mutantes de visión, incluyendo la no respuesta optocinético (NRC) de los mutantes, lo que se pensaba que eran completamente ciegos cuando se probó por otro ensayo de la visión, el reflejo de optocinético.
El reflejo de optocinético (okr) es un reflejo básico visual exhibida por la mayoría de los vertebrados y juega un papel importante en la estabilización de los ojos con respecto a la escena visual. Sin embargo, el okr requiere que el animal detecta franjas en movimiento y es posible que los peces que no presentan un okr no puede ser completamente ciego. Un pez cebra mutante, la c no optocinético respuesta (NRC) no tiene okr bajo cualquier condición de iluminación a prueba y se informó a ser completamente ciego. Anteriormente, hemos demostrado que fuera de actividad de las células ganglionares se pueden grabar en estos mutantes. Para determinar si los peces mutantes sin okr como el mutante NRC puede detectar incrementos y decrementos de luz simples, hemos desarrollado el análisis visual del comportamiento motor (VMR). En este ensayo, larvas de pez cebra solo se colocan en cada pocillo de una placa de 96 pocillos que permite el control simultáneo de las larvas utilizando un sistema automatizado de vídeo-seguimiento del sistema. Las respuestas del aparato locomotor de cada larva a 30 minutos de luz ON y 30 minutos de luz fueron grabados y cuantificados. PESO peces tienen un breve repunte de la actividad motora en las luces, conocida como la respuesta de sobresalto, seguido por el retorno a la menor a la actividad de referencia, llamado el congelamiento. PESO pescado también aumentar bruscamente su actividad locomotora inmediatamente después de luces apagadas y sólo gradualmente (durante varios minutos) volver a la actividad basal del aparato locomotor. Los mutantes NRC responden de manera similar a la luz OFF como el pescado WT, pero presentan una ligera reducción en su actividad promedio en comparación con los peces WT. La actividad motora en respuesta a la luz el NRC en los mutantes se ha retrasado y lento. Hay un tiempo lento aumento de la respuesta de la NRC mutante a la luz en comparación con la luz PESO EN respuesta. Los resultados indican que los peces NRC no son completamente ciegos. Debido a que los teleósteos pueden detectar la luz a través de la retina no-tejidos, que confirmó que las respuestas inmediatas del comportamiento de los cambios de intensidad de luz requieren los ojos intactos con la chokh (chk) mutantes que carecen por completo de los ojos desde las primeras etapas de desarrollo. En nuestro ensayo VMR, los mutantes chk no presentan respuesta de sobresalto a la luz ya sea encendido o apagado, que muestran que los ojos laterales mediar en este comportamiento. El ensayo se describe aquí VMR complementa el ensayo okr bien establecida, que no pone a prueba la capacidad de las larvas de pez cebra para responder a los cambios en la intensidad de la luz. Además, la automatización del ensayo VMR se presta a la selección de alto rendimiento de los defectos de intensidad de la luz impulsado por las respuestas visuales.
Este protocolo describe los pasos para llevar a cabo la respuesta de Visual-Motor de larvas de pez cebra a los incrementos y decrementos de la luz en su propio laboratorio. Pez cebra son un modelo ideal para estudios de comportamiento. Son fáciles de mantener, tienen gran tamaño del embrague, y se desarrollan rápidamente. Por ejemplo, los ojos de las larvas de pez cebra son sensibles a la luz el día 3 de desarrollo y de momento en el que muestran una respuesta de sobresalto.
Parte 1: Revestimiento de cada pez en una placa de 96 pocillos
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Los procedimientos experimentales se muestra en la película son representativos de los peces WT. Sin embargo, estos experimentos se puede hacer de forma análoga en los peces mutantes, así (véase la sección representativa de resultados). Sugerimos a los peces placa WT y peces mutantes en el mismo plato en un esquema de tablero de ajedrez para el control óptimo.
Cuando se utilizan peces mutantes en el mismo plato como el pescado PESO asegurarse de que usted anote qué tipo de peces se colocaron en cada pozo. Aquí está una sugerencia so.......
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Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud subvenciones EY0081 y 5T32UY07145 y por la Fundación Ojos Caballeros Templarios. Jason Rihel es miembro de Bristol-Squibb de las Ciencias de la Vida Fundación para la Investigación.
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios | |
|---|---|---|---|---|
| Dispositivos de microplaca | Herramienta | Whatman, GE Healthcare | 7701-1651 | |
| Pipetas de transferencia | Herramienta | VWR international | 202205 | |
| Agua para peces | Reactivo | consulte la referencia n.º 4 | ||
| Cámaras de grabación (Zebrabox) | Herramienta | Viewpoint Lifesciences | ||
| Software Videotrack | Herramienta | Viewpoint Lifesciences |
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