Este es un protocolo que describe cómo aislar y cultivar primaria neuronas simpáticas de los ganglios cervical superior (SCG) de las crías recién nacido.
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Artículo de método
Protocolo para las neuronas simpáticas de rata cultivo Ganglios cervical superior (SCG)
En este artículo
Resumen
Resumen
Los ganglios cervical superior (SCG) en las ratas son pequeños, brillantes, con forma de almendra estructuras que contienen las neuronas simpáticas. Estas neuronas proporcionan inervación simpática de la cabeza y el cuello y las regiones que constituyen una población bien caracterizados y relativamente homogénea (4). Las neuronas simpáticas dependen de factor de crecimiento nervioso (NGF) para el crecimiento de la supervivencia, diferenciación y axonal y de la amplia disponibilidad de NGF facilita su cultura y su manipulación experimental (2, 3, 6). Por estas razones, cultivos de neuronas simpáticas se han utilizado en una amplia variedad de estudios, incluyendo el desarrollo neuronal y la diferenciación, los mecanismos de muerte celular programada y patológica, y la transducción de señales (1, 2, 5 y 6). La disección de los SCG de ratas recién nacidas y las neuronas simpáticas de cultivo no es muy complicada y se puede dominar con bastante rapidez. En este artículo vamos a describir en detalle cómo diseccionar el SCG de crías de rata recién nacida y de utilizarlos para establecer cultivos de neuronas simpáticas. El artículo también se describen los pasos preparatorios y de los diversos reactivos y equipos que se necesitan para lograr este objetivo.
Protocolo
1. Preparación para la disección:
- Seleccione la placa de cultivo apropiado (10 cm o placas de 6 pocillos o bien 24, etc) dependiendo de la naturaleza de sus experimentos, y el escudo con el colágeno de cola de rata-24 horas antes de la disección. Los métodos para la preparación de cola de rata colágeno y usarlo para placas de cultivo abrigo se han descrito en otra parte (1).
- Prepare una solución de tripsina 0,25% en tampón fosfato salino (PBS) (sin EDTA) y el filtro de esterilización. Preparar alícuotas de 1 ml y almacenar a -20 º C.
- Prepare una solución que contiene 2.5 mM de cada uno de uridina y 5 FDU-en agua destilada / desionizada H....
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Discusión
Utilizamos ratas Sprague Dawley, de nuestras culturas.
Tómese su tiempo y atención a la limpieza de los ganglios. Eliminar todos los restos, los vasos sanguíneos y grasa. Este paso es importante para asegurar una cultura que es más o menos homogénea y libre de los tipos de células extrañas. La adición de uridine/5-FDU gran medida eliminar cualquier resto de las células no neuronales (mitosis) contaminación de la cultura o al menos inhibir su proliferación.
Además, durante el paso de la disociación, ser paciente y tomar el ti.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
NZ gustaría agradecer a los miembros del laboratorio de Subhas Biswas, Andrew Sproul, y Willet Ryan por su formación en la disección y la cosecha de las neuronas simpáticas. Apoyado por becas de los NIH, NINDS.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios | |
|---|---|---|---|---|
| Pinzas, acero inoxidable n.º 5 | Herramienta | Roboz Surgical Instruments Co. | RS4976 | |
| Tijeras, DEAVER rectas con puntas afiladas y romas - cuchillas de 43 mm - 5,5 | Herramienta | Roboz Surgical Instruments Co. | RS6760 | |
| RPMI 1640 con L-glutamina | Reactivo | Cellgro | 10-040-CV | |
| Suero bovino fetal | Reactivo | SAFC Global | 12103c | |
| Suero de caballo donante | Reactivo | JRH Biosciences | 12449 | Inactivar por calor incubando en baño de agua a 56°C durante 30 minutos. |
| Penicilina/estreptomicina | Reactivo | GIBCO, por Life Technologies | 15140-122 | |
| Tripsina sin EDTA | Reactivo | Difco Laboratories | MT 25-050-CI | |
| Uridina | Reactivo | Sigma-Aldrich | U3003 | |
| 5-Fluoro-5’ desoxiuridina | Reactivo | Sigma-Aldrich | F-8791 | |
| NGF | Reactivo | Harlan Laboratories | BT-5025 | |
| Microscopio de disección y fuente de luz | Microscopio | |||
| Tubos de polipropileno de 15 ml | Herramienta | BD Biosciences | 352096 | |
| Placas de cultivo celular | Herramienta | Corning |
Referencias
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells. , MIT Press. (1998).
- Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Si....
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Reimpresiones y permisos
