Name: Modelo murino de isquemia Miembro Posterior (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-21T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 51 s
Description: Aprende a inducir isquemia unilateral en el miembro posterior de ratones mediante ligadura de la arteria femoral y confirma la reducción del flujo sanguíneo con imagenología Doppler láser. Este modelo quirúrgico permite estudiar enfermedad arterial periférica y regeneración vascular.

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Los autores agradecen a Andrea Axtell, Satoshi Itoh, MD, Velotta Jeff, MD, Hoyt Grant, Robert C. Robbins, MD, Yu Jin, MD, Tim Doyle, PhD, y el Stanford pequeño núcleo de imágenes de animales para la asistencia técnica. Los autores también agradecen AM Bickford, Inc. para el apoyo del equipo de veterinarios. Esta investigación fue financiada por becas de investigación de los Institutos Nacionales de Salud (R01 HL-75774, R01 CA098303, R21 HL085743, 1K12 HL087746), el tabaco de California las enfermedades relacionadas con el Programa de Investigación de la Universidad de California (15IT-0257 y 0169-1514RT) , y el Instituto de Medicina Regenerativa de California (RS1-00183). NH es apoyado por una beca de la Asociación Americana del Corazón.

1. La inducción de isquemia Miembro Posterior Unilateral <ol><li> El instrumental quirúrgico necesario para esta operación son: pinzas finas puntas, pinzas de punta, tijeras de primavera, tijeras quirúrgicas, porta agujas, y el retractor. Hacemos nuestro propio retractor con un clip, ya que es más pequeño que los retractores disponibles en el mercado. Esterilizar las herramientas antes de la cirugía por un autoclave o esterilizador de calor de perlas. Una herramienta de cauterización y estéril bastoncillos de algodón señaló también serán necesarios para esta cirugía. Se recomienda que las herramientas de ser re-esterilizados en las puntas cuando sea necesario durante el procedimiento. </li><li> Cuando los instrumentos están listos, coloque el ratón en la cámara de inducción de la anestesia que contiene un 1-3% de isoflurano en oxígeno al 100%, con un caudal de 1L/min. </li><li> Deja el ratón en la cámara de inducción hasta que no responde a los estímulos externos. A continuación, retire el animal de la cámara de inducción. Se recomienda para eliminar la anestesia de la caja antes de abrir la tapa, para disminuir la exposición del operador con el isoflurano. </li><li> A continuación, coloque el animal en decúbito supino sobre la mesa antes de la operación y conectarlo a un flujo continuo de isoflurano. Usando una máquina de afeitar eléctrica, eliminar el vello de las extremidades inferiores. Aplicar crema de depilación para eliminar completamente el cabello. </li><li> Coloque el ratón en la posición de decúbito supino sobre una toalla envuelta con calefacción en la mesa de operaciones, y conectarlo a un flujo continuo de isoflurano. Ampliar y asegurar la extremidad posterior con un pedazo de cinta adhesiva. Una vez que el miembro posterior es segura, limpia la piel con tres alterna matorrales Betadine y alcohol. Para el resto del procedimiento quirúrgico, el uso de un microscopio de disección a 10X o 20X de aumento para obtener una vista ampliada de la región de las extremidades traseras. </li><li> Con unas pinzas finas y tijeras quirúrgicas, hacer una incisión de la piel, de aproximadamente 1 cm de largo, desde la rodilla hacia el muslo. </li><li> Utilizando tampón fosfato salino (PBS)-humedecido bien hisopos de algodón señaló, cepille suavemente el tejido graso subcutáneo que rodea el músculo del muslo. </li><li> A continuación, aplicar el cauterio para incidir transversalmente y disecar a través del tejido graso subcutáneo para revelar la arteria femoral subyacente. </li><li> Use un separador para abrir la herida y para obtener una mejor visión de los vasos de las extremidades inferiores. </li><li> Con unas pinzas finas y un hisopo de algodón en punta, suavemente atravesar la vaina femoral membranosa para exponer el paquete neurovascular. </li><li> Luego, utilizando un juego limpio de fórceps y un hisopo de algodón, analizar y separar la arteria femoral de la vena femoral y el nervio en la posición proximal cerca de la ingle. Después de la disección, pasar un hilo de sutura de seda 7-0 por debajo del extremo proximal de la arteria femoral. Ocluir la arteria femoral proximal con nudos dobles. Coloque el empate en el buque como proximal en la herida como sea posible a fin de dejar de longitud para el segundo empate y un segmento intermedio que se secciona. </li><li> Separada de la arteria femoral de la vena femoral en la posición distal cerca de la rodilla. Pase un hilo de sutura de 7-0 por debajo del extremo distal de la arteria femoral proximal de la arteria poplítea. Ocluir el vaso con nudos dobles. </li><li> Ocluir la arteria femoral distal con un segundo conjunto de nudos dobles proximal a la primera serie de nudos. Este segundo conjunto de puntos de sutura se utiliza para el agarre de la arteria durante el procedimiento de transacción. </li><li> Del mismo modo, a los efectos de agarre, ocluir la arteria femoral proximal con un segundo conjunto de nudos dobles justo distal a la primera serie de nudos. </li><li> Seccionar el segmento de la arteria femoral entre los nudos distales y proximales con un hisopo de algodón de punta fina y un par de tijeras de primavera. Tenga cuidado de no perforar la pared de la vena femoral. </li><li> Retire el separador y cerrará la incisión con puntos de sutura Vicryl 5-0. Estas suturas no necesitan ser removidos en un momento posterior, ya que se disuelven por sí mismos. </li><li> Una vez que se cierra la incisión, el lugar del animal en la parte superior de un cojín cubierto con calefacción en la jaula de recuperación y seguimiento de forma continua hasta que despierto. </li><li> Después de animal se ha recuperado de una hora, continúe con el paso de láser Doppler perfusión de la sangre con el fin de confirmar la inducción de isquemia. </li></ol> 2. Laser Doppler perfusión de la sangre <ol><li> Para comenzar la etapa de láser Doppler perfusión, coloque el ratón en la cámara de inducción de la anestesia que contiene un 1-3% de isoflurano en oxígeno al 100%, con un caudal de 1L/min. </li><li> Deja el ratón en la cámara de inducción hasta que no responde a los estímulos externos. A continuación, retire el animal de la cámara de inducción. Se recomienda para eliminar la anestesia de la caja antes de abrir la tapa, para disminuir la exposición del operador con el isoflurano. </li><li> Colocar el animal sobre la mesa pre-operativos relacionados con el flujo continuo de isoflurano. A continuación, eliminar el vello de las extremidades inferiores con una afeitadora eléctrica seguida por la crema del retiro del pelo si es necesario. </li><li> Después de quitar el pelo,Colocar el animal en una superficie de 37 ° C se calienta durante 5 minutos con un flujo continuo de isoflurano. Monitorear la temperatura del núcleo para asegurar euthermia, como los cambios de temperatura afectan notablemente la perfusión. </li><li> Después de 5 minutos, coloque el animal en decúbito supino sobre una base no-reflectante que absorben la luz de superficie como de color verde de tela, conectado a un flujo continuo de isoflurano. Extender las extremidades posteriores. </li><li> A continuación, encienda la impresora láser Doppler y la adquisición de software e inicializar el software. Especificar el tamaño del campo de visión y resolución. Lo mejor es mantener el campo de visión y la densidad de píxeles consistente entre los animales con el fin de realizar análisis en el futuro sea más fácil. </li><li> Abra un archivo nuevo. Pulse inicio para comenzar a adquirir los datos de imagen. En general, la cámara detecta automáticamente la distancia con el ratón, pero si se le solicita, especifique la distancia del animal a la cámara. El láser se muestran los límites del campo de visión y luego iniciar la adquisición de datos. </li><li> Después de la adquisición se haya completado, la imagen empieza a mostrar una gama de colores que indican el nivel de perfusión de la sangre a las piernas. Los colores se pueden establecer en un rango de perfusión específicas para una mejor comparación de datos entre los animales. </li><li> Cuando la adquisición de datos, guarde el archivo. </li><li> A continuación, devolver el animal a la jaula de recuperación y seguimiento de los animales continuamente hasta que despierto. </li><li> Para analizar los datos, use el ajuste de umbral en el software de análisis para restar el ruido de fondo. Un umbral de 0,2 suele ser un valor razonable. Seleccione dos regiones de interés o rendimiento de la inversión, que cubren cada área de las extremidades traseras. Una variedad de puntos de referencia se pueden utilizar para normalizar el retorno de la inversión entre los miembros y los animales. A continuación, determinar el promedio de perfusión y la variabilidad en el retorno de la inversión. La diferencia de perfusión y la relación entre la perfusión de la extremidad isquémica y la integridad física de control entonces se puede determinar fácilmente. </li><li> Este procedimiento se puede repetir para seguir los cambios en la perfusión de extremidades inferiores en el tiempo. En un momento de tiempo deseado, el animal puede ser sacrificado para la evaluación de la función del tejido y la comparación de datos de imágenes de perfusión. </li></ol> 3. Los resultados representativos: La anatomía de la vasculatura extremidades inferiores se muestra en la Figura 1 2. Un esquema representativo de las extremidades inferiores después de la explantación arteria femoral se muestra en la Figura 2. Para confirmar la inducción de isquemia de las extremidades inferiores, láser Doppler de análisis de imágenes de perfusión demuestra una reducción drástica en el flujo de sangre a la extremidad isquémica, en comparación con la rama de control, como se muestra en la Figura 3. <img src="/files/ftp_upload/old/1035_2009_1_26_9/figure1_1035.png" alt="Figura 1" width="600" height="406" /> Figura 1. Anatomía de la vasculatura extremidades inferiores. Los asteriscos indican la ubicación de la ligadura de la inducción de isquemia extremidades inferiores. <img src="/files/ftp_upload/old/1035_2009_1_20_7/Niiyama_HLI_Fig2.png" alt="Imagen 2" width="600" height="450" /> Figura 2. Esquema representativo que muestra la anatomía de las extremidades inferiores después de la ligadura de la arteria femoral en los sitios proximal y distal después de la eliminación de la arteria femoral. <img src="/files/ftp_upload/old/1035_2009_1_20_8/Niiyama_HLI_Fig3.png" alt="Figura 3" width="600" height="256" /> Figura 3. Laser Doppler imágenes que muestran el flujo de sangre antes y después de la inducción de isquemia de la extremidad posterior izquierda (indicado por la flecha).

<ol><li>Huang, N. F., Niiyama, H., De, A., Cooke, J. P., , <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+and+non-invasive+tracking+of+embryonic+stem+cell-derived+endothelial+cells+for+treatment+of+hindlimb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation and non-invasive tracking of embryonic stem cell-derived endothelial cells for treatment of hindlimb ischemia.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Cook, M. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCook%2C+MJ+%22The+anatomy+of+the+laboratory+mouse%22">The anatomy of the laboratory mouse</a>. , Academic Press. New York. (1976).</li>
<li>Niiyama, H., Kai, H., Yamamoto, T., Shimada, T., Sasaki, K., Murohara, T., Egashira, K., Imaizumi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+endogenous+monocyte+chemoattractant+protein-1+in+ischemia-induced+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Roles of endogenous monocyte chemoattractant protein-1 in ischemia-induced neovascularization.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 44, 661-666 (2004).</li>
<li>Dokun, A. O., Keum, S., Hazarika, S., Li, Y., Lamonte, G. M., Wheeler, F., Marchuk, D. A., Annex, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+trait+locus+%28LSq-1%29+on+mouse+chromosome+7+is+linked+to+the+absence+of+tissue+loss+after+surgical+hindlimb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia.</a> Circulation. 117, 1207-1215 (2008).</li>
</ol>

Hay algunas fuentes de variabilidad a considerar al planear y ejecutar modelos de isquemia extremidades inferiores. En primer lugar, el nivel de la isquemia puede variar de acuerdo a la ubicación de la ligadura con respecto a la de las ramas laterales. Por lo tanto, para mantener la coherencia del modelo, los animales deben ser sometidos a un mismo nivel de la ligadura arterial. Otra fuente de variabilidad en la recuperación isquémica está relacionada con la edad de los animales, con animales jóvenes (6-8 semanas de edad) que tengan más rápida y completa recuperación de las tasas que los animales mayores (8-10 meses), según la evaluación hemodinámica (es decir, láser Doppler perfusión) o funcionales (es decir, prueba de esfuerzo) las medidas. Para los estudios en los que uno está evaluando un agente angiogénico, puede ser preferible utilizar animales de más edad, debido a una mayor diferencia entre los grupos se pueden observar con una intervención terapéutica. Por el contrario, para los estudios en los que uno está evaluando un factor anti-angiogénico, puede ser preferible utilizar los animales más jóvenes para maximizar el efecto del tamaño de tres. Si se realiza correctamente, debería haber un mínimo de complicaciones tales como sangrado, infección, o la mortalidad. Si se produce una hemorragia por la ruptura accidental de la vena femoral o de otros buques, una presión moderada con un algodón estéril con punta de aplicador o gasa debe ser aplicada en el sitio de la hemorragia hasta que el sangrado se detenga. Los animales que presenten signos de infección debe ser tratada con agentes anti-infecciosos. Los animales presentan gangrena significativa posible que tenga que beeuthanized. Esta complicación es más frecuente en los animales, y en algunas cepas, como los ratones BALB c 4. Además, el modelo de isquemia extremidades inferiores pueden causar dolor leve a moderado. Por lo tanto, los analgésicos como la buprenorfina o carprofeno se debe administrar como sea necesario para el tratamiento del dolor, de acuerdo con las recomendaciones de la IACUC. En conclusión, hemos demostrado un método simple y reproducible para el estudio de la PAD en un modelo murino de isquemia extremidades inferiores. El modelo de isquemia miembro posterior con láser Doppler de análisis de imágenes es un excelente sistema para el estudio de patologías vasculares y para la evaluación de candidatos terapéuticos.

<table><tbody><tr><td>Herramientas quirúrgicas</td><td>Herramienta</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hisopos de algodón Constix</td><td>Herramienta</td><td>Contec</td><td>SC-4</td><td></td></tr><tr><td>Betadine (povidona-yodo)</td><td>Reactivo</td><td>PDI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcohol al 70%</td><td>Reactivo</td><td>Kendall</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfatos</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutura de seda 7-0</td><td>Herramienta</td><td>Genzyme</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutura vicryl 5-0</td><td>Herramienta</td><td>Ethicon Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Afeitadora eléctrica</td><td>Herramienta</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electrocauterio</td><td>Herramienta</td><td>Baxter International Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Doppler láser y PeriScan PIM 3</td><td>Equipo</td><td>Perimed</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

modelo murino de isquemia miembro posterior

Murine Model of Hindlimb Ischemia 

En los Estados Unidos, la enfermedad arterial periférica (EAP) afecta a alrededor de 10 millones de personas en todo el mundo y es también frecuente. Tratamientos médicos para el alivio sintomático son limitados. Intervenciones quirúrgicas o endovasculares son útiles para algunas personas, pero a largo plazo resultados suelen ser decepcionantes. Como resultado, existe una necesidad para el desarrollo de nuevas terapias para tratar la enfermedad arterial periférica. La preparación miembro posterior isquemia es un modelo murino de la PAD, y es útil para probar nuevas terapias. Cuando se compara con otros modelos de isquemia tisular, tales como la ligadura de la arteria coronaria o cerebral, ligadura de la arteria femoral establece un modelo más simple de los tejidos isquémicos. Otras ventajas de este modelo son la facilidad de acceso a la arteria femoral y la baja tasa de mortalidad. En este video, se demuestra la metodología para el modelo murino de isquemia hindimb unilateral. Los materiales y procedimientos específicos para la creación y la evaluación del modelo se describe, incluyendo la evaluación de la perfusión de un miembro por láser Doppler. Este protocolo también puede ser utilizado para el trasplante y el seguimiento no invasivo de las células, lo cual es demostrado por Huang et al. 1.

El procedimiento quirúrgico para la inducción de isquemia miembro posterior unilateral se demuestra, con la confirmación de la isquemia por imágenes de perfusión Doppler láser.

Modelo murino de isquemia Miembro Posterior

En los Estados Unidos, la enfermedad arterial periférica (EAP) afecta a unos 10 millones de personas y también es prevalente en todo el mundo. Las terapias médicas para...

En Estados Unidos, la enfermedad arterial periférica, EAP, afecta a aproximadamente 10 millones de personas, en particular fumadores, diabéticos y personas mayores de 70 años. El objetivo general de esta cirugía es inducir isquemia de la extremidad trasera mediante la ligadura de los segmentos proximal y distal de la arteria femoral. El procedimiento comienza anestesiando, afeitando y posicionando al ratón sobre la mesa quirúrgica en posición supina.Luego se realiza una incisión de la piel desde la rodilla hacia el muslo medial, exponiendo la arteria femoral subyacente. A continuación, la arteria femoral se separa cuidadosamente de la vena femoral. Se hacen nudos dobles en el sitio de ligadura distal así como en el sitio de ligadura proximal.Se extrae entonces el segmento de la arteria femoral. El sitio de la incisión se cierra mediante suturas y se permite que el animal se recupere de la anestesia. Para confirmar la inducción de isquemia en la extremidad trasera, se coloca al ratón anestesiado en posición supina.Luego, ambos miembros posteriores se escanean mediante el láser doppler. La imagen se guarda y se evalúa la perfusión. Hola, soy John Cook.Soy profesor de medicina en la división de medicina cardiovascular de la Universidad de Stanford. Nuestro laboratorio se interesa por la angiogénesis y la regeneración vascular. En este video, dos de mis becarios postdoctorales, la Dra. Nan Wong y Hir Niyama, les presentarán el modelo de isquemia en la extremidad trasera de ratón, un modelo importante para la enfermedad arterial periférica y frecuentemente utilizado en nuestro laboratorio para evaluar los efectos de los factores de crecimiento y la terapia celular sobre la angiogénesis.Utilizamos estos procedimientos en nuestro laboratorio para estudiar el efecto de las células endoteliales derivadas de células madre en la reparación vascular. Comencemos. Las herramientas quirúrgicas necesarias para esta operación incluyen pinzas finas de punta, pinzas de punta, tijeras de resorte, tijeras quirúrgicas, portaagujas y retractor.Preparamos nuestro propio retractor utilizando un clip de papel porque es más pequeño que los disponibles comercialmente. Los retractores deben esterilizar estas herramientas antes de la cirugía con un esterilizador de cuentas calientes; también se necesitará una herramienta de cauterización y torundas estériles de punta fina para esta cirugía. Cuando las herramientas estén listas, coloque el ratón en la cámara de inducción de anestesia que contiene de 1 a 3% de isoflurano en oxígeno al cien por ciento, con un flujo de un litro por minuto.Deje al ratón en la cámara de inducción hasta que no responda a estímulos externos. Luego, retire al animal de la cámara de inducción. A continuación, coloque al animal en posición supina sobre la mesa de preoperación y conéctelo a un flujo continuo de isoflurano.Utilizando una afeitadora eléctrica, retire el vello de la extremidad trasera. Aplique crema depilatoria para eliminar completamente el vello. Después de afeitar al ratón, extienda y sujete la extremidad trasera con un trozo de cinta adhesiva.Una vez que la extremidad trasera esté fija, limpie la piel con tres frotaciones alternadas de Betadine y alcohol. Utilizando fórceps finos y tijeras quirúrgicas, haga una incisión en la piel de aproximadamente un centímetro de longitud desde la rodilla hacia el muslo medial usando solución salina tamponada con fosfato. Mantenga húmedos y definidos los hisopos de algodón puntiagudos con PBS.Retire suavemente el tejido de grasa subcutánea que rodea el músculo del muslo. A continuación, aplique la electrocoagulación transversalmente en tamaños y seccione a través del tejido de grasa subcutánea para exponer la arteria femoral subyacente. A continuación, utilice un retractor para abrir la herida y obtener una mejor vista de la vasculatura de la extremidad inferior.Usando pinzas finas y un hisopo de algodón de punta fina, perforar suavemente la vaina femoral membranosa para exponer el paquete neurovascular. Luego, con un juego limpio de pinzas finas y un hisopo de algodón, disecar y separar la arteria femoral de la vena femoral y el nervio en la ubicación proximal cerca de la ingle. Después de la disección, pasar un hilo de sutura de seda de siete hilos por debajo del extremo proximal de la arteria femoral.Ocluya la arteria femoral proximal utilizando nudos dobles. Coloque el lazo en el vaso lo más proximal posible dentro de la herida, con el fin de dejar longitud suficiente para el segundo lazo y un segmento intermedio que será seccionado. Separe la arteria femoral de la vena femoral en la ubicación distal, cerca de la rodilla.Pase un hilo de sutura 7-0 por debajo del extremo distal de la arteria femoral, proximal a la arteria poplítea. Ocluya el vaso mediante nudos dobles. Ocluya la arteria femoral distal con un segundo par de nudos dobles justo proximal al primer par de nudos.Este segundo conjunto de suturas se utilizará para sujetar la arteria durante el procedimiento de sección. De manera similar, para fines de sujeción, ocluya la arteria fal proximal con el segundo conjunto de nudos dobles justo distal al primer conjunto de nudos. Seccione el segmento de la arteria femoral comprendido entre los nudos distal y proximal utilizando un bastoncillo de algodón de punta fina y un par de tijeras de resorte.Tenga cuidado para no perforar la pared de la vena femoral. Retire el retractor y cierre la incisión utilizando suturas de hilo 5-0. Una vez cerrada la incisión, devuelva el animal a la jaula de recuperación y monitórelo hasta que despierte. Después de que el animal se haya recuperado durante una hora, proceda con la perfusión sanguínea por láser doppler.Paso para confirmar la inducción de isquemia. Para iniciar el paso de perfusión con láser doppler, coloque el ratón en la cámara de inducción de anestesia que contiene de uno a 3% de isoflurano en oxígeno al cien por ciento con un flujo de un litro por minuto. Deje al ratón en la cámara de inducción hasta que no responda a estímulos externos.A continuación, retire el animal de la cámara de inducción y colóquelo sobre la mesa de preoperación conectada al flujo continuo de isoflurano. Luego, retire el vello de la extremidad trasera utilizando una afeitadora eléctrica y, si es necesario, una crema depilatoria. Después de eliminar el vello, coloque el animal sobre una superficie calentada a 37 grados Celsius durante cinco minutos bajo un flujo continuo de isoflurano.Después de cinco minutos, coloque el animal en posición supina sobre una superficie absorbente de luz no reflectante, como una tela de color verde conectada a un flujo continuo de isoflurano. Extienda las extremidades posteriores. A continuación, encienda el imagenólogo de láser doppler y el software de adquisición, e inicialice el software.Especifique el tamaño del campo de visión y la resolución. Es recomendable mantener constantes el campo de visión y la densidad de píxeles entre los animales. Para facilitar el análisis futuro, abra un archivo nuevo.Pulse el botón de inicio para comenzar la adquisición de los datos de la imagen. Cuando se le solicite, especifique la distancia del animal al dispositivo de imagen. El láser mostrará los bordes del campo de visión y luego comenzará a adquirir datos.Una vez completada la adquisición, la imagen comenzará a mostrar una gama de colores que indican el nivel de perfusión sanguínea en las patas. Los colores pueden ajustarse a un rango de perfusión específico. Para comparar mejor los datos entre animales cuando finalice la adquisición de datos, guarde el archivo, devuelva el animal a la jaula de recuperación y supervise continuamente al animal hasta que despierte.Para analizar los datos, utilice el ajuste de umbral en el software de análisis para restar cualquier ruido de fondo. Un umbral de 0.2 generalmente es un valor razonable. Seleccione dos regiones de interés o ROI que cubran cada área de la extremidad trasera.Se puede utilizar una variedad de puntos anatómicos de referencia para estandarizar la ROI entre extremidades y animales, y luego determinar la perfusión media y la variabilidad en la ROI. Luego, se puede determinar fácilmente la diferencia de perfusión y la razón de perfusión entre la extremidad isquémica y la extremidad control. Este procedimiento puede repetirse para seguir los cambios en la perfusión de la extremidad trasera.Con el tiempo, en un punto temporal deseado, el animal puede ser sacrificado para evaluar la función del tejido. En comparación con los datos de imagen de perfusión, aquí se muestra un diagrama representativo de la extremidad trasera tras la disección de la arteria femoral. Las suturas marcan las ubicaciones de los sitios de ligadura proximal y distal.Cuando la cirugía se realiza con cuidado, hay un sangrado mínimo y puede completarse en menos de una hora. Y aquí se muestran los resultados del análisis de imágenes de perfusión por láser doppler. La imagen de la izquierda muestra la perfusión de ambas extremidades antes de la inducción isquémica.Mientras que la imagen de la derecha muestra la profusión de ambos miembros tras la inducción isquémica del miembro trasero izquierdo. La intensidad del color en la imagen indica la cantidad de flujo sanguíneo.En comparación con la extremidad control, la extremidad isquémica muestra muy poco color, lo que sugiere una reducción drástica del flujo sanguíneo. Utilizando estos datos, el software puede cuantificar la perfusión media en la extremidad isquémica y la control para determinar la diferencia de perfusión y la razón de perfusión. Por lo tanto, estos resultados confirman la inducción de isquemia en la extremidad posterior.Acabamos de mostrarle cómo inducir isquemia unilateral en la extremidad trasera en el modelo de ratón y confirmar la inducción de isquemia mediante la perfusión sanguínea con láser Doppler. El modelo de isquemia en la extremidad trasera con análisis mediante imagenología por láser Doppler es un sistema excelente para estudiar patologías vasculares y evaluar candidatos terapéuticos. Este procedimiento puede seguirse con el trasplante y el seguimiento no invasivo de células, lo cual se demuestra en otro video de jve por Huang et al.Al realizar estos procedimientos, es importante recordar tener cuidado para no perforar la pared de la vena femoral al diseccionar la arteria femoral con tijeras de disección. Asimismo, utilice un sitio de ligadura similar en todos los animales del experimento para mantener la consistencia del modelo de isquemia severa. Eso es todo.Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

La falta de comprensión mecanicista de la médula espinal lesión por isquemia-reperfusión ha obstaculizado otros aditamentos para prevenir la paraplejia después de las operaciones de aorta de alto riesgo. Por lo tanto, el desarrollo de modelos animales es imperativo. Este manuscrito demuestra menor parálisis de las extremidades reproducible después de la oclusión de la aorta torácica en un modelo murino.

Paraplejia reproducible por la oclusión de la aorta torácica en un modelo murino de la médula espinal por isquemia-reperfusión

Se introduce un método quirúrgico para inducir experimental de isquemia / reperfusión (I / R) lesión para simular el infarto de miocardio (MI) en modelos de ratón que permite una mayor claridad en el posicionamiento de la ligadura en la arteria descendente anterior izquierda (LAD) para aumentar la reproducibilidad de experimentos en ratones MI.

Un modelo murino de isquemia-reperfusión miocárdica lesión a través de la ligadura de la arteria descendente anterior

La inducción quirúrgica de la isquemia de las extremidades posteriores en el ratón es útil para examinar la angiogénesis, sin embargo, esto se ve comprometido en ciertas cepas endogámicas de ratón que muestran una marcada necrosis tisular inducida por la isquemia. Se describen métodos para inducir isquemia subaguda de las extremidades utilizando constrictores ameroides, para eludir este problema mediante la inducción de una oclusión arterial gradual.

Los métodos para aguda y subaguda murino de isquemia del miembro posterior

Describimos un modelo de ratón de accidente cerebrovascular inducido por la oclusión de la arteria cerebral media utilizando una sutura recubierta de silicona. El protocolo se puede aplicar para inducir una oclusión permanente o una isquemia temporal, seguida de reperfusión.

La inducción de ictus isquémico y la isquemia-reperfusión en ratones con la técnica de oclusión de la arteria Medio y Visualización de un infarto Área

Describimos un procedimiento quirúrgico utilizado para inducir isquemia periférica en conejos con hiperlipidemia y diabetes. Esta cirugía actúa como un modelo preclínico para afecciones experimentadas en la enfermedad arterial periférica en pacientes. La angiografía también se describe como un medio para medir la magnitud de la isquemia introducida y la recuperación de la perfusión.

Modelo preclínico de isquemia de extremidades traseras en conejos diabéticos

Aquí, se presenta un modelo experimental crítico de isquemia de la extremidad posterior seguido de una batería de pruebas funcionales, histológicas y moleculares para evaluar la eficacia de las terapias angiogénicas.

Evaluación de la angiogénesis terapéutica en un modelo murino de isquemia de las extremidades posteriores

Aquí se describe un procedimiento quirúrgico que muestra cómo lograr la ligadura permanente de la arteria coronaria descendente izquierda-anterior en ratones. Este modelo es de gran relevancia para investigar la fisiopatología del infarto de miocardio y los procesos biológicos concomitantes.

Modelo de infarto de miocardio murino usando ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior izquierda

Este artículo demuestra un enfoque quirúrgico eficiente para establecer la isquemia aguda en ratones con una pequeña incisión. Este enfoque puede ser aplicado por la mayoría de los grupos de investigación sin ninguna actualización de laboratorio.

Un modelo quirúrgico modificado de isquemia de la extremidad posterior en ApoE-/- Ratones que usan una incisión en miniatura

En este trabajo describimos un método sencillo y reproducible que puede inducir infarto de miocardio o lesión por isquemia-reperfusión miocárdica en ratones mediante ligadura de precisión de la arteria coronaria descendente anterior izquierda mediante micromanipulación.

Inducción de infarto de miocardio y lesión por isquemia-reperfusión miocárdica en ratones

El presente protocolo describe un modelo único y clínicamente relevante de enfermedad arterial periférica que combina la electrocoagulación de la arteria femoral y la vena con la administración de un inhibidor de la óxido nítrico sintasa para inducir gangrena de las extremidades posteriores en ratones FVB. La perfusión Intracardíaca DiI se utiliza para obtener imágenes tridimensionales de alta resolución de la vasculatura de la almohadilla del pie.

Imágenes tridimensionales de alta resolución de la vasculatura de la almohadilla del pie en un modelo de gangrena de extremidades posteriores murinas

Describimos cómo generar un modelo quirúrgico ampliamente utilizado de lesión por isquemia-reperfusión intestinal (IRI) en roedores. El procedimiento consiste en la oclusión de la arteria mesentérica superior seguida de la restauración del flujo sanguíneo. Este modelo es útil para los estudios que investigan las causas oclusivas de la IRI intestinal tanto en medicina veterinaria como humana.

Modelo en roedor de lesión por isquemia-reperfusión intestinal por oclusión de la arteria mesentérica superior

Aprende a inducir isquemia unilateral en el miembro posterior de ratones mediante ligadura de la arteria femoral y confirma la reducción del flujo sanguíneo con imagenología Doppler láser. Este modelo quirúrgico permite estudiar enfermedad arterial periférica y regeneración vascular.

Modelo murino de isquemia Miembro Posterior

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