Name: Fabricación de electrodos amperométricos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Aprende a fabricar electrodos de fibra de carbono para detectar catecolaminas en células individuales mediante amperometría. Este protocolo detallado permite obtener registros de bajo ruido en estudios de neurotransmisión.

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Agradecemos al Dr. Aaron P. Fox de la Universidad de Chicago, en cuyo laboratorio este protocolo fue diseñado originalmente, y William Roden (Saint Louis University) para un mayor desarrollo del protocolo. Agradecemos a la Fundación de Whitehall y el National Science Foundation para el apoyo.

Parte 1: Preparación de fibra de carbono <ol><li> Cortar un haz de fibras de carbono (que utilizamos 7μm diámetro) en una longitud que es de ~ 1,25 X la longitud de la pipeta capilar. </li><li> Retire el tamaño de punto de ebullición ~ 100 ml de acetona en un recipiente y añadir las fibras a la acetona caliente, hirviendo durante 30 minutos o más. </li><li> Eliminar las fibras de la acetona caliente, y transferir a un vaso limpio con 50-100 ml de acetona fresca. </li><li> Fibras secas, colocando el paquete en un abrir 150 mm placa de Petri y la noche airdry. </li></ol> Parte 2: pulido fuego tubos capilares <ol><li> Fuego pulir cada tubo capilar (se utiliza micro-hematócrito tubos capilares, diámetro exterior 1,5 mm, diámetro interior de 1,3 mm, 7,5 cm de largo) manteniendo el tubo en el centro con unas pinzas y exponer al final de la flame.Rotate el tubo alrededor de 3 veces, mientras que en la llama. </li><li> Invierta el tubo y coloque el extremo opuesto a la llama, de nuevo girando tres veces. </li><li> Coloque los tubos pulida al fuego en un recipiente de vidrio y llevar al horno hasta que estén listos para ser llenados con fibras de carbono. </li></ol> Parte 3: enhebrar una fibra de carbono en un tubo capilar <ol><li> Similar a las descripciones de Machado et al. (2008) y Mundroff y Wightman (2002), aspirar la fibra en el tubo de vidrio con un tubo de plástico conectado a una aspiradora con un filtro. </li><li> Cortar la fibra con un scalpel.Leave de ¼ de pulgada de las fibras del tubo. </li></ol> Parte 4: Tirar de una pipeta de fibra en un extractor de electrodos <ol><li> Colocar el tubo capilar en el extractor de electrodos (usamos Narishige Japón Modelo PP-830) y apriete los tornillos para sostener el tubo capilar en el lugar. </li><li> Manipular los interruptores de la ejecución de dos intentos, fijado en la configuración del extractor óptimo. </li><li> Una vez que la pipeta se tira por la mitad, separar las dos mitades por el corte de la fibra desnuda en el centro con unas tijeras. </li><li> Retire cada medio de electrodos y tire de la fibra que sobresalen de romper el vidrio de la fibra seal.Trim con unas tijeras para que sólo el 1 / 8 de pulgada de fibra que queda fuera del tubo. </li><li> Repita los pasos 1-4 hasta que alrededor de 16 fibras-electrodos se retiró. </li></ol> Parte 5: Hacer epoxi-vidrio Sello <ol><li> Calentar una parte alícuota de pre-hechas de epoxi en un plato caliente ajustado a 55 ° C durante 6 minutos en una campana extractora. </li><li> Mientras epoxi se está calentando, envuelva a 16 de los electrodos se detuvo en un paquete mediante el uso de la cinta. </li><li> Después de la resina Epon se calienta durante 6 minutos, añadir 0,7 gramos XOF MPDA a los baños de resina Epon (14% w / v). Mezclar por agitación del vial. </li><li> Sumerja el paquete de electrodos en la resina caliente más solution.After endurecedor unos 20 segundos, una cantidad suficiente de epoxi entrará en las puntas de vidrio a través de la acción capilar. </li><li> Deshacer el paquete, los electrodos en lugar de cartón con ranuras y el lugar esta bandeja en un horno a 100 ° F. </li><li> Después de al menos 48 horas, examinar cada electrodo en una electrodos microscope.Discard disección que no se llenan con resina epoxi, tienen una punta se estrelló, tiene más de una fibra, etc.After inspección de cada electrodo, coloque de nuevo en el soporte de cartón y de regreso en el oven.Electrodes suelen ser buenos para alrededor de 1 mes después de su fabricación. </li></ol> Parte 6: Corte de la fibra de carbono <ol><li> De fibra de carbono lugar electrodo con cuidado sobre un portaobjetos de vidrio con cinta de teflón. </li><li> Visualizar la punta con un microscopio de disección. </li><li> Use una hoja de bisturí limpios para cortar de forma perpendicular por la fibra de carbono para dejar una superficie plana y limpia para la colocación de la fibra de carbono en contra de una célula. </li></ol>

<ol><li>Mundorf, M. L., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amperometry+and+cyclic+voltammetry+with+carbon+fiber+microelectrodes+at+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protocols+in+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Amperometry and cyclic voltammetry with carbon fiber microelectrodes at single cells.</a> Curr Protocols in Neurosci. 6 (14), 1-6 (2002).</li>
<li>Machado, D. J., Montesinos, M. S., Borges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Good+practices+in+single-cell+amperometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molec.+Biol%22%5BJournal%5D)">Good practices in single-cell amperometry.</a> Methods in Molec. Biol. 440, 297-313 (2008).</li>
</ol>

Este protocolo se describe cómo generar y cortar electrodos amperométricos. En las grabaciones amperométrica, un electrodo de fibra de carbono se coloca contra la superficie de una célula secretora. La actividad de exocitosis se observa como los picos de amperométrica, lo que indica la corriente electroquímica causada por la transferencia de electrones después de la oxidación de las catecolaminas. Con la práctica de decisiones y reducir los electrodos amperométricos, los niveles de ruido puede ser mejorado en muchos de ...

<table><tbody><tr><td>Escamas de 1,3-fenilendiamina endurecedora de epoxi</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P23954-100G04 716AJ</td><td>Los alícuotas se almacenan en un desecador y no deben exponerse a la luz.</td></tr><tr><td>Fibras de carbono</td><td>Material</td><td>Goodfellow</td><td>C005725</td><td></td></tr><tr><td>Tubos capilares microhematocrito</td><td>Material</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9836768</td><td></td></tr><tr><td>Resina epoxi</td><td>Reactivo</td><td>Miller-Stephenson</td><td>Epon Resin 828</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Instrumento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extractor de electrodos</td><td>Instrumento</td><td>Narishige International</td><td>PP-830</td><td>1.ª tracción = 24,8 grados C; 2.ª tracción = 62,7 grados C</td></tr><tr><td>Horno</td><td>Instrumento</td><td></td><td></td><td>ajustado a 100 grados F.</td></tr><tr><td>Placa calefactora</td><td>Instrumento</td><td></td><td></td><td>ajustada a 55 grados C</td></tr></tbody></table>

fabricación de electrodos amperométricos

Fabrication of Amperometric Electrodes

Electrodos de fibra de carbono son cruciales para la detección de la liberación de catecolaminas de las vesículas en las células individuales para las mediciones de amperometría. A continuación, describimos las técnicas necesarias para generar ruido bajos (&lt;0,5 pA) electrodos. Las técnicas han sido modificadas a partir de las descripciones publicadas por otros investigadores (1,2). Los electrodos son hechos por la preparación de fibras de carbono y los hilos de forma individual en cada tubo capilar mediante el uso de una aspiradora con un filtro para aspirar la fibra. A continuación, el tubo capilar con la fibra es tirado por un extractor de electrodos, la creación de dos mitades, cada una con una punta afilada. Los electrodos se sumergen en epoxi líquida caliente mezclada con el endurecedor para crear un sello de epoxy de cristal. Por último, los electrodos se colocan en un horno para curar la resina. El manejo cuidadoso de los electrodos es fundamental para garantizar que se hace de forma coherente y sin daños. Este protocolo se muestra cómo fabricar y cortar electrodos amperométricos para la grabación de una sola célula.

Este protocolo se describe cómo generar electrodos de fibra de carbono. Los electrodos se utilizan posteriormente para detectar la liberación de catecolaminas de las vesículas con amperometría de fibra de carbono.

Fabricación de electrodos amperométricos

Los electrodos de fibra de carbono son fundamentales para la detección de la liberación de catecolaminas desde vesículas en células individuales para mediciones amperométricas. Aquí, nosotros...

Este protocolo describe cómo generar electrodos de fibra de carbono. Primero, llenaremos las capilares de vidrio con fibras de carbono a las que se les ha eliminado el recubrimiento. A continuación, estiraremos el conjunto capilar con fibra para formar dos electrodos y cortaremos la fibra.Luego colocaremos los electrodos para que se sumerjan en epoxi. Para sellar la fibra dentro del electrodo, almacenaremos los electrodos de fibra en una rejilla dentro de un horno caliente. Posteriormente, estos electrodos se utilizan para detectar la liberación de catecolaminas provenientes de vesículas en células individuales mediante fibra de carbono y barometría.Las grabaciones exitosas muestran bajo nivel de ruido y picos ascendentes bien definidos en el trazado de la grabación. Hola, soy Carrie Pike del laboratorio de la Dra. Amy Harkins en el Departamento de Ciencias Farmacológicas y Fisiológicas de la Escuela de Medicina de la Universidad de St. Louis. Voy a mostrarles un procedimiento para generar electrodos de fibra de carbono con bajo nivel de ruido, que se utilizarán en la voltametría para medir la liberación de catecolaminas a partir de células individuales.Comencemos a preparar las fibras de carbono para fabricar los electrodos. Primero, corte un haz de fibras de carbono a una longitud que sea aproximadamente 1,25 veces la longitud de la pipeta capilar en la campana extractora. Elimine el recubrimiento hirviendo alrededor de 100 mililitros de acetona en un recipiente y agregue las fibras a la acetona hirviente durante 30 minutos o más.Después de hervir, retire las fibras de la acetona caliente y transfiéralas a un vaso de precipitados limpio que contenga entre 50 y cien mililitros de acetona fresca. Transfiera las fibras nuevamente a una hoja de aluminio, que puede sacarse de la campana. Seque las fibras colocando el hazo sobre una placa de Petri abierta de 150 milímetros y dejando que las fibras de carbono sequen al aire durante la noche.Ahora que las fibras de carbono están preparadas, proceda a preparar los tubos capilares de vidrio para pulirlos con llama. Utilice tubos capilares de vidrio microhematocrito, que tienen una longitud de 7,5 centímetros, un diámetro exterior de 1,5 milímetros y un diámetro interior de 1,3 milímetros. Sujete el tubo por el centro y exponga un extremo a la llama.Gire el tubo aproximadamente tres veces mientras está en la llama. Invierta el tubo y coloque el extremo opuesto en la llama y gire nuevamente tres veces. Ambos extremos del tubo capilar ya están pulidos con fuego.Coloque los tubos de pulido con llama en un recipiente de vidrio y transfiéralos al horno hasta que estén listos para llenarse con fibras de carbono. Antes de comenzar a introducir una fibra de carbono en un tubo capilar, asegúrese de usar una mascarilla protectora. Luego, utilice un tubo de plástico conectado a un vacío con un filtro para succionar la fibra dentro del tubo de vidrio.A continuación, corte la fibra utilizando un escalpelo. Asegúrese de dejar un cuarto de pulgada de fibra sobresaliendo por ambos extremos del tubo. La fibra de carbono con rosca ya está lista para ser estirada y formar el electrodo de fibra para pipeta.Coloque el tubo capilar en el electrodo polar y apriete las perillas para sujetar el tubo capilar en su lugar. A continuación, configure el polar en los ajustes óptimos y manipule los interruptores para ejecutar dos polos. Una vez que la pipeta se haya partido por la mitad, separe las dos mitades cortando la fibra desnuda en el centro.Utilizando tijeras, retire cada mitad del electrodo y jale de la fibra que sobresale para romper el sello de vidrio. Recorte la fibra con tijeras de modo que quede solo un octavo de pulgada de fibra fuera del tubo.Repita estos pasos hasta obtener aproximadamente 16 electrodos. Los electrodos de fibra se estiran antes de proceder a sellarlos para formar el sello de vidrio epoxi. Primero, caliente una alícuota de epoxi previamente preparada en una placa calefactora ajustada a 55 grados Celsius durante seis minutos en una campana extractora. Mientras el epoxi se calienta, enrolle aproximadamente 16 de los electrodos estirados en un haz.Después de calentar el epoxi durante seis minutos, utilice cinta para agregar 0,7 gramos de endurecedor al epoxi caliente. Mezcle esto girando el vial. Sumerja el haz de electrodos en la solución de epoxi caliente más endurecedor.Sumerja el haz dos veces cada vez durante unos cinco segundos, de modo que una cantidad suficiente de epoxi entre en las puntas de vidrio por acción capilar. Desarme el haz y coloque los electrodos en un soporte de cartón con ranuras. Coloque esta bandeja en un horno ajustado a 100 grados Fahrenheit.Después de al menos 48 horas, examine cada electrodo bajo un microscopio estereoscópico. Descarte los electrodos que no se hayan llenado con epoxi. Tenga una punta aplastada.Tienen más de una fibra o no pueden usarse por otras razones. Después de inspeccionar cada electrodo, colóquelo nuevamente en el soporte de cartón y devuélvalo al horno. Por lo general, los electrodos son adecuados durante aproximadamente un mes después de su fabricación y requieren el corte de la fibra de carbono antes de usarlos para pirrometría en una célula.Para cortar la fibra de carbono, coloque cuidadosamente el electrodo de fibra de carbono sobre una placa de vidrio con cinta de teflón. Visualice la punta bajo un microscopio estereoscópico. A continuación, utilice una hoja de bisturí limpia para cortar perpendicularmente a través de la fibra de carbono, dejando una superficie plana y limpia para colocar la fibra de carbono contra una célula.Inmediatamente antes de las grabaciones. Rellene la capilar con cloruro de potasio tres molar utilizando una jeringa de llenado, y asegúrese de secar el extremo opuesto a la fibra. Para eliminar la sal en exceso.Coloque el electrodo sobre la perla de plata, cloruro de plata del soporte del electrodo. Conectado eléctricamente al cabezal del piroómetro. Ajuste el soporte del electrodo para mantenerlo estable.Coloque el electrodo adyacente a la célula y proceda a registrar los eventos métricos de RO. Este protocolo describe cómo generar y cortar electrodos tric. Durante las grabaciones tric, un electrodo de fibra de carbono se coloca contra la superficie de una célula secretora.La actividad exocitótica se observa como picos tric, lo que indica la corriente electroquímica causada por la transferencia de electrones tras la oxidación de las catecolaminas. Con la práctica en la elaboración y corte de electrodos métricos EmPro, los niveles de ruido pueden mejorar considerablemente en comparación con muchos de los electrodos disponibles comercialmente. Acabo de mostrarle cómo fabricar electrodos de fibra de carbono paramétricos al realizar este procedimiento.Es importante prestar mucha atención a los detalles del protocolo para obtener electrodos consistentes y de bajo ruido. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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