Técnicas basadas en inmunoprecipitación: purificación de proteínas endógenas mediante perlas de agarosa

1. Inmunoprecipitación con abalorios de agarosa de proteína A/G PLUS

Preparación de lisato celular

1. Centrifugar 10⁸ timiocitos en una microcentrífuga a 13.000 rpm durante 3 min y retirar el sobrenadante.
   Nota: El número de células variará dependiendo de los niveles de expresión de la proteína deseada y el tipo de célula elegido.
2. Vuelva a suspender las celdas en el búfer de lisis de 500 l RIPA con PMSF.
3. Interrumpe las células usando unos pulsos rápidos con un vórtice y luego aspira el lisado unas cuantas veces con una aguja de 25 G unida a una jeringa.
   Nota: Evite crear burbujas. Utilice una aguja más grande, como una aguja 21G para tipos de células más grandes.
4. Incubar el lisado celular sobre hielo durante 10 minutos.
5. Centrifugar el lisado a 13.000 rpm durante 15 min a 4oC.
6. Transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga fresco y etiquetado.

Pre-clearing

7. Añadir cuentas de agarosa de 20 l de proteína A/G PLUS y 1 g de un anticuerpo de control de isotipo (aquí, se utiliza el anticuerpo de control de isotipo IgG1 de ratón), al lisado.
   Nota: La elección del anticuerpo isotipo utilizado dependerá del anticuerpo específico de proteína utilizado más adelante en el paso desplegable.
8. Incubar la mezcla de lisado en un rotador centrífugo en la cámara fría (4oC) durante 30 min.
9. Centrifugar la muestra a 3200 rpm durante 30 s a 4oC.
10. Transfiera el sobrenadante pre-claro a un tubo de microcentrífuga fresco, etiquetado, de 1,5 ml. Deseche el pellet.

Determinación de la concentración de proteínas

11. Determinar la concentración de proteína del lisado celular mediante la realización de un ensayo de Bradford.
12. Reactivo Bradford Aliquot 1000 l en 7 tubos de microcentrífuga.
13. Añadir las siguientes cantidades de proteína BSA estándar (2 mg/ml) en 6 de los tubos (Tabla 1).

Número de tubo	Volumen de la AB (L) (2 mg/ml)	Concentración de proteínas (g/L)
1	0	0
2	1	2
3	2	4
4	3	6
5	4	8
6	5	10

Tabla 1: Cantidades estándar de proteína BSA

14. En el^tubo 7, añadir 1 l del lisado pre-claro.
    Nota: Para asegurarse de que la concentración de la muestra se encuentra dentro del rango de detección de ensayo, prepare y analice también una dilución de lisado 1:2 o 1:5.
15. Coloque 200 ml de cada uno de los 7 tubos en pozos individuales de una placa de fondo plano de 96 pocillos repitiendo cada muestra en triplicado.
16. Lea la placa en un lector de placas a 595 nm.
17. Genere la curva estándar en Excel y calcule la concentración de proteínas del lisado pre-borrado.

Tire hacia abajo

18. Etiquete dos tubos de microcentrífuga nuevos de 1,5 ml, uno como "control" y otro como "prueba", que en este ejemplo es c-myc.
19. Coloque 500 g de lisado pre-claro en cada uno de estos tubos.
    Nota: La cantidad de proteína utilizada aquí dependerá de la cantidad de la proteína deseada para ser purificada.
20. Traiga el volumen total para cada tubo hasta 500 l utilizando el tampón de lisis.
21. Añadir 2 g de anticuerpo anti-c-mico al tubo del grupo de ensayo y 2 g de anticuerpo de control de isotipo IgG1 del ratón al grupo de control.
    Nota: La cantidad de anticuerpos dependeráde la eficacia de los anticuerpos y de la cantidad de la proteína diana.
22. Incubar los tubos de un rotador en la cámara frigorífica (4oC) durante 2 h.
23. Añadir 20 éL de proteína A/G PLUS perlas de agarosa a cada tubo.
    Nota: Es aconsejable utilizar puntas de pipeta con el extremo cortado para evitar daños en las perlas.
24. Incubar sobre un rotador en cámara frigorífica (4oC) durante la noche.
    Nota: Dependiendo de la proteína diana y la eficacia de los anticuerpos, este paso puede variar de 1 h a la noche.
25. Centrifugar los tubos a 3200 rpm a 30 s 4oC para tirar hacia abajo de las perlas.
26. Aspirar el sobrenadante de cada tubo.
    Nota: La proteína diana ahora está unida a las cuentas.
27. Lave las perlas dos veces con PBS de 500 L 1X Dulbecco.
28. Centrifugar los tubos a 3200 rpm durante 30 s 4oC.
    Nota: Para un lavado más estricto, utilice búferes más estrictos, como RIPA.
29. Aspirar el tampón de cada tubo. Usando puntas de carga de gel, elimina cualquier tampón sobrante de las cuentas y mantén las cuentas en hielo para eluir la proteína.
    Nota: En este ejemplo, la proteína se eluye en el búfer de ejecución SDS-PAGE hirviendo las perlas, para el análisis de manchas occidentales. Este enfoque es adecuado para verificar los resultados de la P.I. o para examinar las interacciones proteínas y proteínas. Para otras aplicaciones posteriores, como la purificación de proteínas para análisis estructurales o enzimáticos, se utilizan sistemas más sofisticados, como etiquetas de epítopos (etiqueta de bandera o etiqueta micálica) para evitar la elución del anticuerpo con la proteína de interés.

2. Verificación de la P.I. a través del análisis de Western Blot

Electroforesis SDS-PAGE:

1. Vuelva a suspender las perlas en un tinte de carga SDS-PAGE de 20 l que contenga el mercapto-etonol.
2. Hervir las muestras a 95 oC durante 5 min.
3. Centrifugar las perlas a 13.000 rpm durante 10 s a temperatura ambiente.
4. Usando puntas de carga de gel, entube cuidadosamente las muestras obtenidas de las cuentas y cárguelas en pozos de 4-15% de gradiente SDS-PAGE gel.
5. Además de las muestras, cargue un carril con una escalera de proteínas, así como un carril con el islapreo pre-despejado para servir como control de carga.
6. Corre a 100 V hasta que el frente del tinte alcance la parte inferior del gel (1h).

Análisis de Western Blot:

7. Haga un sándwich western blot, asegurándose de que la membrana PVDF esté entre el gel y el cátodo rojo.
8. Traslado por 1 h a 100 V.
9. Coloque la membrana en tampón de bloqueo de 5 ml a temperatura ambiente durante 1 h en un balancín en un ajuste bajo, para bloquear los sitios de unión a proteínas no específicos.
   Nota: Es posible que sea necesario aumentar los volúmenes de tampón de bloqueo, anticuerpoprimario, anticuerpo secundario y lavados para manchas de mayor tamaño.
10. Incubar la mancha con un anticuerpo anti-c-mico de 5 ml en el tampón de bloqueo durante la noche a 4oC en balancín en un ajuste bajo.
    Nota: El anticuerpo utilizado aquí debe ser diferente del utilizado en el paso desplegable.
11. Lave la mancha 3-6 veces usando 5 ml de TBST con cada lavado siendo 5 min a temperatura ambiente en un balancín en un ajuste bajo.
12. Incubar la mancha con anticuerpo secundario de cadena ligera anticonejo con etiqueta HRP en tampón de bloqueo, durante 1 h a temperatura ambiente en balancín a un ajuste bajo.
    Nota: La elección del anticuerpo secundario dependerá del anticuerpo primario utilizado para la mancha occidental. Además, una cadena ligera específica secundaria se utiliza en el protocolo porque la proteína diana está cerca en peso molecular de la cadena pesada del anticuerpo. Si la proteína diana está cerca de 50kDa, utilice una cadena ligera específica secundaria. Si la proteína diana está cerca de 25kDa, utilice y una cadena pesada específica secundaria.
13. Lave la mancha 3-6 veces usando 5 ml de TBST con cada lavado siendo 5 min a temperatura ambiente en un balancín en un ajuste bajo.
14. Retire el líquido de la mancha y el borde de la mancha en las toallitas de laboratorio para eliminar el exceso de líquido.
15. Cubra la mancha con 1 x reactivo de detección quimioluminiscente' e incubar durante 1 min.
    Nota: Los siguientes pasos deben realizarse en rápida sucesión, ya que el reactivo de detección es sensible a la luz y al tiempo.
16. Dab borde de mancha en toallitas de laboratorio para eliminar el exceso de reactivo de detección.
17. Coloque la mancha en la superficie de imagen de la bandeja Imager.
    Nota: Las manchas quimioluminiscentes también se pueden visualizar utilizando película.
18. Imagen usando el 'Programa Chemiluminescent' para capturar múltiples puntos de tiempo de 10 s a 5 min.
    Nota: El tiempo óptimo puede cambiar en función de la cantidad de proteínas y la calidad de los anticuerpos.
19. Elija una imagen con una visibilidad óptima de la banda y, a continuación, exporte esa imagen.
20. Antes de mover la mancha, tome una foto de la mancha usando el imager, para capturar la ubicación de la escalera. Luego, exporta esa imagen también.
21. Con un software de preparación de diapositivas (como PowerPoint), alinee las bandas y las imágenes de escalera para formar una sola imagen.