Un Sistema de Anclaje magnética para investigar control mediado de vuelo visual y olfativa en Drosophila

El creciente campo de la olfacción en Joof ha motivado ensayos conductuales cada vez más sofisticados, como el aparato olfativo con sujeción magnética o OMT. Este procedimiento consiste en pegar el tórax dorsal de la mosca a un alfiler mnuchin. La mosca se suspende a un ángulo de 30 grados con el alfiler en una inclinación adecuada, y luego se alinea entre dos imanes de tierras raras.

Cuando se realiza correctamente, esto dará como resultado un rango de movimiento libre. A continuación, se alinea un puerto de olor para producir una pluma que pase suavemente desde la boquilla de entrega sobre la cabeza de la mosca hacia la cámara de vacío. Luego se evalúa la capacidad de la mosca para localizar el odorante en presencia de estímulos visuales.

Hola, soy Brian DeMars del laboratorio del Dr. Mark Fry en el Departamento de Ciencia Fisiológica de la Universidad de California en Los Ángeles. Hoy les mostraré cómo sujetar moscas para su uso en un aparato magnético con sujeción olfativa. También les mostraré cómo alinear los imanes y los puertos de olor, y cómo ajustar los caudales másicos para el sistema de entrega de olores.

Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar el control de vuelo mediado por estímulos visuales y olfativos en moscas de la fruta. Comencemos. Para iniciar el amarre, recolecte moscas entre cuatro y seis días posteriores a la emergencia de los adultos (ELOs) y ayúnelas durante cuatro a seis horas.

En un vial de listado de alimentos que contiene una toallita kim húmeda para prevenir la desecación, transfiera a continuación un lote de moscas marcadas a un vial pequeño insertado en un bloque de latón sobre una plataforma de enfriamiento peltier ajustada a cuatro grados Celsius. A esta temperatura, las moscas se anestesiarán en aproximadamente 30 segundos.

Coloque una toalla de papel Kim sobre la platina de enfriamiento para absorber la humedad. A continuación, coloque las moscas anestesiadas sobre la platina para clasificarlas y seleccione las hembras más grandes para sujetarlas. Con un pincel fino, coloque una sola mosca en posición dentro del sarcófago de diseño personalizado, que tiene una forma adaptada para alojar a una única mosca de la fruta hembra de tipo silvestre.

Ahora use el microscopio para asegurarse de que la mosca esté correctamente posicionada con su lado dorsal hacia arriba. El extremo anterior de la mosca debe estar orientado hacia usted y el posterior alejado de usted. A continuación, coloque un alfiler minuchin con una varilla magnética montada en un micromanipulador.

La aguja debe alinearse con el extremo romo orientado hacia el tórax dorsal de la mosca. Esto se encuentra justo detrás de la cabeza, entre las dos alas. La mosca debe colocarse correctamente sobre la aguja a lo largo de tres ejes.

El ángulo de guiñada, el ángulo de alabeo y el ángulo de cabeceo deben ser perfectamente verticales cuando se observa de frente hacia los ojos; incluso una pequeña cantidad de alabeo entre la mosca y el pin no puede tolerarse. El ángulo de vista lateral entre el pin y el eje longitudinal del cuerpo, o cabeceo, debe formar un ángulo de 30 grados con la punta hacia arriba respecto al horizonte. Tenga en cuenta que puede ser necesario recortar el pin para lograr un funcionamiento óptimo del acoplamiento.

Esto dependerá de la distancia entre los imanes de suspensión. Una vez alineado el pin mnuchin, utilice un alambre de acero delgado para aplicar una pequeña gota de pegamento activado por UV al extremo romo del pin mnuchin. A continuación, manipule el pin de modo que la gota de pegamento toque el tórax de las moscas justo por encima de la cabeza.

Tenga cuidado de no usar demasiado pegamento. Con el tamaño adecuado de gota, el pegamento debe formar una pequeña cúspide y fluir desde la aguja hacia el tórax. A continuación, cure el pegamento con dos ráfagas de luz UV de 22 segundos cada una.

Una vez completada la sujeción, coloque manualmente un pequeño cuadrado de toalla de papel Kim a cada mosca utilizando pinzas debido a un reflejo instintivo de aterrizaje. Las moscas agarrarán las toallas de papel Kim. Después de una hora de recuperación, las moscas sujetas están listas para los experimentos.

Para lograr un rango de movimiento suave de 360 grados, es fundamental alinear correctamente los imanes. Para ello, sostenga los imanes anulares inferiores en posición horizontal con una funda de plástico y colóquelos directamente encima de una cámara de vacío transparente. El imán de varilla superior está fijado verticalmente aproximadamente tres cuartas partes de pulgada por encima de los imanes inferiores; un rodamiento dual en V se adhiere con epoxi a la superficie inferior del imán superior.

Esto estandarizará la posición de la mosca y minimizará la fricción rotacional. Tenga en cuenta que estos imanes pueden ser peligrosos y que su uso inadecuado puede provocar daños en el equipo o lesiones corporales menores. A continuación, alinee aproximadamente los imanes superior e inferior visualmente.

Al colocar el imán de varilla superior directamente encima del punto central de los imanes anulares inferiores, será útil sujetar el imán superior a un micromanipulador para realizar ajustes finos. Ahora, coloque una mosca en la arena y ajuste la posición horizontal y vertical del imán superior hasta que la mosca pueda girar suavemente y de manera estable 360 grados al comienzo de cada experimento; cada mosca debe verificarse para asegurar una rotación uniforme, garantizando así que los imanes estén correctamente alineados y que los pasadores mnuchin no estén dañados. Si la configuración es incorrecta, la mosca podría no girar en absoluto.

Puede tener un rango de movimiento restringido o puede rotar a velocidades inconsistentes. Esto podría ser un problema con el pegamento, lo cual puede probarse rotando una cuadrícula rayada frente a la mosca para provocar una respuesta omo. Si la mosca no gira o gira de manera inconsistente, reemplácela por otra mosca.

Si esta mosca no gira correctamente y estos problemas existen para cada mosca, entonces es probable que el problema se deba al alineamiento de los imanes y se requerirá un ajuste adicional para lograr un olor estable. El seguimiento de la configuración inicial del sistema de olor requerirá la instalación de tubos de teflón de calibre estrecho desde el multiplexor de gas hasta los viales personalizados de olor acuoso. La salida de estos viales debe conectarse directamente a los tubos de puerto hipodérmico utilizando el mismo tubo de teflón.

A continuación, coloque una cámara de vacío de acrílico transparente debajo de la arena para sostener los imanes. Utilice un tubo de vidrio de cuatro milímetros montado debajo de la mosca y conectado a la cámara de vacío para acercar la abertura de vacío a la mosca y reducir el diámetro de la abertura. Ahora coloque una mosca sujeta en la arena usando pinzas.

Una vez que la mosca esté en su lugar, active un olor atractivo. Puede verificar visualmente si la mosca se dirige hacia la posición del puerto de olor cuando se activa el olor. Si la mosca parece no tener preferencia por el olor, utilice el método de ensayo y error para optimizar el OMT.

Para hacer esto primero, ajuste la posición del puerto de olor hasta que la mosca parezca seguir el olor. Aquí, los puertos de olor están montados en micromanipuladores y posicionados cuatro milímetros en posición dorsal y tres milímetros en posición anterior respecto a la cabeza de la mosca. Si cambiar la posición del puerto de olor no mejora el seguimiento del olor, ajuste el caudal másico hasta que la mosca parezca seguir el olor.

Utilizamos un ajuste de siete mililitros por minuto. Si ajustar el caudal másico no mejora el seguimiento del olor, regule el caudal del vacío hasta que la mosca parezca seguir el olor. Establecemos el caudal del vacío en 13 litros por minuto utilizando un regulador de flujo.

Una vez que se haya establecido la posición del puerto y los caudales, cambie periódicamente entre la entrega de vapor de agua y vapor de olor utilizando un multiplexor de gas conmutable. Si ha montado su aparato correctamente, debería observar dos cosas. Primero, bajo estímulos visuales rotatorios constantes, una mosca sujeta colocada en el OMT debería rotar suavemente 360 grados en el eje vertical o eje ya; giros bruscos denominados kos son característicos del comportamiento espontáneo de giro en ausencia de estímulos visuales constantes.

Si las moscas no pueden girar suavemente, es posible que la causa sean un pegado inadecuado y unos imanes mal alineados. En segundo lugar, también debería observarse que cuando se activa el olor, la mosca debe dirigirse hacia el puerto del olor. Cuando el olor se desactiva, la mosca debe girar espontáneamente sin preferencia por ninguna posición en la arena.

Si las moscas no siguen activamente la columna de olor, esto podría significar que es necesario ajustar la posición del puerto de olor, la velocidad del flujo de aire y/o la velocidad del flujo de vacío. Acabamos de mostrarle cómo inmovilizar una mosca para su uso en un aparato magnético de sujeción olfativa. También le hemos mostrado cómo alinear correctamente los imanes y los puertos de olor, y cómo establecer los caudales másicos para el sistema de entrega de olores.

Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.