Name: Micro-array de unidades de crónicos In vivo Grabación: Tetrodo Asamblea (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 19 s
Description: Aprende a fabricar y ensamblar tetrodos para grabaciones electrofisiológicas crónicas en ratas despiertas. Este protocolo detalla la construcción de matrices micro-drive con protección para estudios neuronales de largo plazo.

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Nos gustaría agradecer junio Yamamoto por su diseño y construcción del dispositivo automático, motor tornado tetrodo se muestra en el video. Además, nos gustaría agradecer a todos los miembros de Wilson pasado y el presente de laboratorio, por sus contribuciones a la micro-drive y el desarrollo de la tecnología tetrodo en el laboratorio.

1. Fabricación de tetrodos <ol><li> Iniciar la construcción de un tetrodo obteniendo una longitud de 50 cm, con aislamiento de poliamida, ni cromo alambre con un núcleo de 12,5 micrones de diámetro. Doble el alambre a la mitad. Corra sus dedos a lo largo de la pareja para que se peguen entre sí. Asegúrese de que el par de hilos de tener un buen contacto en toda su longitud. </li><li> Veces el par de nuevo por la celebración de los dos extremos. Asegúrese de que el bucle formado en un extremo no está doblado. Cortar los cuatro cables en el extremo no bucle de modo que las cuatro extremidades están alineados. </li><li> Para el siguiente paso, se necesita una pinza modificada, un dispositivo de giro de motor, y una barra horizontal sobre el dispositivo de giro. La pinza se ve modificada por una barra de plástico pegado a la base del gancho. Donde las puntas de alambre se exponen, pinza de los cuatro cables con la pinza modificada. Colgar el circuito de los cables sobre la barra horizontal. Coloque la pinza en la etapa motorizada. </li><li> Aplicar 80 sabios reloj giros seguidos de 40 vueltas en sentido horario contrario al conjunto de cable a lo largo de aproximadamente tres minutos. Estos parámetros pueden variar de acuerdo a sus necesidades. </li><li> Después de girar tetrodo se ha completado, se fusionan los cables juntos por el calentamiento desde tres ángulos diferentes con una pistola de aire caliente (420 ° C o 790 º F), el uso medio-bajo flujo. Para cada ángulo, empezar a 1-2 cm por debajo de donde el conjunto de cable se divide, ejecute la pistola de calor hacia arriba y abajo a una distancia de 2 cm de los cables durante unos 5 segundos. Tenga cuidado como las altas temperaturas se derrita por completo el aislamiento y provocar cortocircuitos. </li><li> Ahora que los cables se han fusionado, retire el tetrodo del aparato girando con cuidado, levantando la pinza para aliviar la tensión en el tetrodo, y cortar el tetrodo cerca de la pinza. En el otro extremo, corte el lazo de tal manera que hay cuatro líneas no en condiciones de servidumbre de cables de igual longitud. </li><li> A continuación, separar las hebras individuales en la parte superior con cuidado doblar los cables con unas pinzas de punta suave. </li><li> El tetrodo ya está listo para la carga en la matriz de micro-drive. Haga 21 para 25 más tetrodos y guárdelas en una caja libre de polvo hasta que es hora de que el proceso de carga tetrodo. </li></ol> 2. Carga de la tetrodos y cables de tierra en la matriz de micro-disco <ol><li> Para continuar, se necesita un total de micro-array de unidades. Si usted todavía no ha construido una, consulte el vídeo de &quot;micro-array de unidades para la crónica en vivo de grabación:. Fabricación de la unidad&quot; En nuestro plan de diseño, el tetrodo se adjuntará en un extremo al conector de hardware, y se ejecutarán a través del tubo portador de poliamida en la unidad de micro-tal que la punta del electrodo se extienden por debajo de la base de la matriz de micro-drive. </li><li> Antes de comenzar, crear un soporte de unidad que se puede conectar a la tarjeta de conexión en un extremo, y en el otro extremo, se pueden fijar por un Panavise. En este ejemplo, el titular de la unidad es un conector de Mill-Max pegado a un extremo de un mango de cuchilla tipo cutter (Figura 1c). </li><li> La celebración de la tetrodo con unas pinzas de punta suave y utilizando un estereoscopio, empuje la punta de la tetrodo en la poliimida tubo portador de una de las unidades micro. Empuje el tetrodo en el tubo hasta que los cables de electrodos individuales están cerca de la tarjeta de conexión en la parte superior de la matriz unidad. Tenga cuidado de no doblar o doblar los alambres, lo que hará que el tetrodo para entrar en el cerebro en un ángulo, en lugar de perpendicular, y se debilita la integridad de la tetrodo. </li><li> Suavemente alimentar al otro extremo de los cuatro cables en sus respectivos agujeros en la placa de interfaz electrodo usando pinzas de punta suave. Una vez más, evitar torceduras o doblar los alambres. Con los cuatro cables en su lugar, empuje los pines de oro en sus agujeros con un par de pinzas que tienen una mandíbula inferior acortado. Cuando se aprietan en el agujero, se tira el aislamiento del cable y crear una conexión eléctrica. </li><li> Para referencia posterior, realizar un seguimiento de la correspondencia entre micro-unidades y la posición del pasador de la tarjeta de interfaz de los electrodos. </li><li> Continuar cargando un total de 18 tetrodos. Las otras tres micro-unidades de la matriz se utilizará para alojar a los electrodos de referencia. Cada electrodo de referencia es de un tetrodo que utiliza sólo uno de los cuatro extremos de los cables no adherentes. Para conectar los electrodos de referencia, siga el procedimiento de carga, pero sólo conectar uno de los cuatro electrodos a la clavija del electrodo de referencia correspondiente en la tarjeta de conexión. </li><li> Si usted está planeando grabaciones multi-sitio, puede ser útil para planificar las conexiones de los tetrodos al conector de la tarjeta antes de tiempo. Esto debería reducir al mínimo la posibilidad de ajustar el tetrodo mal durante los experimentos. </li><li> Una vez que carga tetrodo se ha completado, hacer dos cables de tierra, uno de los animales y otra para el cono de protección. Corte un 6 pies de largo cable aislado de acero (texto: 0,005 &quot;de diámetro) y eliminar 3 mm de aislamiento, con unas pinzas de metal, desde cada extremo del cable. A continuación, corte de 4&quot;Aceros largos cables aislados (texto: 0,005&quot; de diámetro). Eliminar 3 mm de aislamiento en un extremo y 1 cm en el otro extremo. </li><li> Ruta de cable de 6 &#39;del suelo a través del agujero en el lado de la unidad matriz de micro-y hacia la tarjeta de interfaz. Conecte el cable expuesto a la tarjeta de interfaz electrodo con un broche de oro en el hoyo de tierra designado. Este cable se conecta al cráneo del animal. </li><li> Ruta paralela de tierra de 4 &#39;de cable al cable de tierra instalado previamente. Conecte el extremo 3 mm despojado de la tarjeta de interfaz electrodo con un broche de oro a otro hoyo de tierra designado. Este cable luego se conecta a un cono de protección, que actuará como una jaula de Faraday pequeña para reducir la captación de ruido. Ahora estamos terminados los cables de conexión y se puede proceder a refinar nuestra tetrodos. </li></ol> 3. Ajuste de la longitud de la tetrodos <ol><li> Nuestro objetivo en este proceso es cortar todos los tetrodos para que sean ligeramente más largo que la profundidad de la estructura del cerebro de destino. En nuestro ejemplo, las unidades de micro-están diseñados para un recorrido máximo de 6.5 mm, suficiente para llegar a muchas áreas neocorticales y del hipocampo dorsal de una rata adulta. En primer lugar, reducir todas las unidades de micro-para que los tetrodos son máximamente expuesta. Al mismo tiempo cortar todos los tetrodos de longitudes que son aproximadamente 5 mm más largo que la longitud final deseada usando un par de afiladas tijeras finas. </li><li> Para el corte final, preparar un par de tijeras dentadas en un Panavise. Abrazadera de un mango con una ligera inclinación hacia abajo y con dientes hacia arriba, dejando la manija otra colgando. </li><li> Ahora retirarse completamente todas las tetrodos en la cánula guía girando los discos micro-up. </li><li> El uso de un estereoscopio, extienda completamente un tetrodo fuera de su cánula. Con una regla, la posición de las tijeras dentadas a la distancia deseada de la cánula guía. Lenta y suavemente cortar el tetrodo con un movimiento suave. Después de este tetrodo se ha reducido, retirar el micro-disco por 3 a 4 mm. Repita este proceso para cada tetrodo hasta que todos hayan sido cortadas. En este punto, usted está listo para chapado en oro. </li></ol> 4. Oro chapado de tetrodos y control de calidad Blindaje de los cables tetrodo nicrom es fundamental para largas grabaciones de estable a largo plazo. Se evita la corrosión y mejora la biocompatibilidad. <ol><li> Configuración del medidor de impedancia en el modo externo y el generador de corriente en modo de comprobación de CC con salida de audio (Figura 1d). Tocar los dos cables del generador de corriente de los seis posibles pares de canales dentro de cada tetrodo, y utilizar la retroalimentación de audio para determinar si existen cortocircuitos entre pares. Si existe un cortocircuito, vuelva a cortar el tetrodo con tijeras dentadas y prueba de nuevo. Si el problema persiste, deseche el tetrodo y reemplazarlo. </li><li> Cuando no existen cortocircuitos dentro de todos los tetrodos, mover todos los discos micro-down, que se extiende a todos los tetrodos tan lejos como sea posible. </li><li> Modificar la configuración del equipo para el control de impedancia del electrodo (Figura 1e). Ahora moje la punta de todos los tetrodos en un baño de estándar dorado solución. El baño de oro está conectado eléctricamente con el polo positivo del medidor de impedancia. Compruebe la impedancia del electrodo tocando el cable negativo del medidor de impedancia para el correspondiente pin de la tarjeta de conexión. </li><li> Medir y registrar la impedancia de cada cable en la matriz de micro-drive. Los valores normales van de 1.3 Mohm. </li><li> En el generador de corriente, ajuste la corriente entre 3.1 mA. A continuación, fije firmemente el cable negativo del medidor de impedancia para el pin en el conector de la tarjeta. Coloque el equipo en la configuración de galvanoplastia (Figura 1f). En el medidor de impedancia, cambiar rápidamente de modo normal, a modo de bypass, y la espalda. Mientras que en el modo de derivación, la corriente pasará a través del tetrodo y disolución de oro y el oro se sembraron en la punta del electrodo. La impedancia después de cada ronda de las planchas debe ser menor que antes. Repita el impulso de corriente si la impedancia de no caer por debajo de 1 MOhm. Una gran conservador de impedancias aceptables 250kOhm a 350 kOhm. Si la impedancia cae por debajo de 200 kOhm, esto puede indicar un corto circuito. </li><li> Si después de repetidos pulsos de la impedancia no baja lo suficiente, la punta del electrodo puede ser obstruida. Vuelva a cortar el tetrodo, compruebe si hay pantalones cortos, y repetir el proceso de dorado. Si re-corte no resuelve el problema, reemplace el tetrodo y empezar de nuevo. </li><li> Después de sembrar todos los tetrodos Sumerja la punta tetrodo brevemente en etanol, y déjelos secar durante 3 a 5 minutos. </li><li> Prueba de cortocircuitos en tetrodos utilizando el generador de corriente con las puntas tetrodo se expone al aire. Si una conexión de CC existe entre dos o más electrodos de un tetrodo, vuelva a cortar el tetrodo, y la placa de oro de nuevo. </li><li> Después de sobrerregulación de todos los tetrodos es completa, agregar una gota de espesor medio de ciano-acrilato de cola a la interfaz entre cada tetrode y su tubo de poliamida. Esto asegurará la tetrodo a su micro-drive y mantener la longitud de la tetrodo. </li><li> Como paso final, se mueven todos los tetrodos en la unidad girando todos los tornillos de arriba. </li></ol> 5. Colocación del cono de protección El propósito del cono de protección es para proteger a las micro-unidades y el cable tetrodo expuestos desde el medio ambiente. También proporciona soporte para el manejo durante un experimento y reduce el ruido eléctrico. Utilizamos un 3-D cono de plástico impresas (Parte I Referencia: fabricación de la unidad). Sin embargo, es posible hacer el cono de otros materiales, como una parte inclinada de la lata de refresco. <ol><li> Tome el cono de plástico y fijar un poco de cinta de papel de aluminio a la superficie interna o externa. </li><li> A continuación, un agujero pequeño (1,5 mm de diámetro) a través del cono y libremente fijar un tornillo con una arandela y tuerca en el interior del cono. Esto servirá como un paso eléctrico para el conductor de tierra. Le recomendamos que utilice un tornillo de tamaño de 00 a 80 y una combinación de lavadora. </li><li> En primer lugar, insertar y en parte a su vez tres tornillos de tamaño 1-72 (3 / 16 pulgadas de largo) en los lados del cono. Con el array de unidades suspendidas, inserte el cono sobre la unidad. Asegúrese de que tanto los cables de tierra se extienden desde la parte inferior de la matriz unidad. Envuelva la parte expuesta del cable de tierra de 4 &#39;en torno a uno de los tornillos de 1-72 en varias ocasiones y apriete el tornillo firmemente. Fije el cono a la base de la unidad apretando los dos tornillos restantes cono. </li><li> Por último, tome la 1 cm extremo pelado del cable de tierra de corto y el viento que todo el tornillo, en medio de la cinta de papel de aluminio y lavadora. Asegure el suelo apretando el tornillo. Ahora tenemos una serie de micro-unidad que está por fin listo para su implantación quirúrgica. </li></ol> 6. Los resultados representativos <ol><li> Micro-drive de producción conjunto se ha completado. Su micro-array de unidades se ha cargado con 18 tetrodos y 3 canales de referencia. Éste queda encerrado en un cono de protección y la tapa para una mayor durabilidad. El acabado micro-array de unidades con el cono de protección pesa 20 gramos a 25 gramos en promedio. </li><li> La Orden unidad de disco terminado se implanta mediante el procedimiento quirúrgico estándar. Como puede ver, la unidad está conectada a un chip de preamplificador y un manojo de cables que transportan la señal de hardware de adquisición de datos y software. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1098/CompositeFigure1_highqualityn.jpg" alt="la figura 1" /> Figura 1: Esquema) de la configuración de torsión tetrodo. Una barra horizontal suspende los cables de los electrodos no adherentes de la tetrodo por encima del dispositivo tetrodo giro automático. B) La instalación de medición de la impedancia tetrodo y las planchas del electrodo. Al verificar si hay cortocircuitos, el circuito es diferente:. El cable negro se conecta a otro canal de electrodos en la placa de conexión C) Un primer plano de un encargo a micro-disco portaherramientas matriz. La barra cilíndrica es un mango de un cuchillo de X-Acto. El conector es de 26 pines, de dos hileras, Mill-Max conector. Las dos piezas se unen con acrílico dental. D) de configuración para el control de corto plazo. Canal X e Y son dos canales diferentes canales de los cuatro canales tetrodo. E) Configuración para la medición de impedancia del electrodo. La fuente de corriente es &#39;off&#39;. El medidor de impedancia está en &#39;on&#39; y &#39;test&#39;. F) de configuración para chapado en oro de puntas de los electrodos. La fuente actual se establece en &quot;on&quot;, el audio es &quot;on&quot;, el modo es &quot;unipolar&quot;, de prueba de CC está &quot;encendido&quot;, la corriente se establece en 2 microamperios.

<ol><li>Gray, C. M., Maldonado, P. E., Wilson, M., McNaughton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrodes+markedly+improve+the+reliability+and+yield+of+multiple+single-unit+isolation+from+multi-unit+recordings+in+cat+striate+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Tetrodes markedly improve the reliability and yield of multiple single-unit isolation from multi-unit recordings in cat striate cortex.</a> J. Neurosci. Methods. 63 (1-2), 43-54 (1995).</li>
</ol>

Este protocolo es la segunda entrega de un protocolo de dos partes: &quot;Micro-array de unidades de las enfermedades crónicas en vivo la grabación.&quot; La combinación de la matriz de la unidad de micro-y tetrodo es una poderosa herramienta para la obtención de registros simultáneos de muchas neuronas en una vigilia, comporta la preparación de los animales. Esperemos que le hemos proporcionado toda la información necesaria para que usted tendrá que iniciar o mejorar los registros electrofisiológicos en su propio labor...

<table><tbody><tr><td>Panavise</td><td>Herramienta</td><td>Panavise</td><td>Modelo 301</td><td>Sujeta ya sea la matriz de microimpulsión o tijeras dentadas</td></tr><tr><td>Alicates Xcelite 378M modificados</td><td>Herramienta</td><td>Newark Inc</td><td>96F8903</td><td>Para insertar los pines del conector de la placa. Para fabricarlos, retire 2 mm de una punta de los alicates.</td></tr><tr><td>Pegamento de curado lento</td><td>Material</td><td>Great Planes (Champaign, IL)</td><td>GPMR6015</td><td>Para pegar el tetrodo al microimpulsor</td></tr><tr><td>Solución de chapado en oro</td><td>Material</td><td>Neuralynx Inc.</td><td>Sifco Selectron Gold NC</td><td>Contiene partículas de oro para la electrodeposición</td></tr><tr><td>Generador de corriente</td><td>Herramienta</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>A365D-B</td><td>También conocido como Aislador de estímulo. Se utiliza para electrodepositar la solución de oro sobre las puntas de los electrodos.</td></tr><tr><td>Medidor de impedancia</td><td>Herramienta</td><td>BAK Electronics</td><td>IMP-1 / 6662 / 2788</td><td>Para verificar la impedancia de los electrodos</td></tr><tr><td>Soplador de aire caliente</td><td>Herramienta</td><td>Steinel (Alemania)</td><td>HG 3002 LCD</td><td>Para fusionar los electrodos entre sí y formar el tetrodo</td></tr><tr><td>Pinzas Accu-Tek Carbofib con punta</td><td>Herramienta</td><td>Aven</td><td>18768 (Patrón 304)</td><td>Para manipular los tetrodos</td></tr><tr><td>Cable con pinza cocodrilo</td><td>Herramienta</td><td>Fine Science Tools</td><td>18050-35</td><td>También conocido como pinza bulldog. Para sujetar los tetrodos juntos durante el torcimiento</td></tr><tr><td>Tijeras microquirúrgicas</td><td>Herramienta</td><td>Biomedical Research Instruments</td><td>25-1000</td><td>Para cortar generalmente el alambre del tetrodo/electrodo</td></tr><tr><td>Tijeras dentadas Iris Toughcut</td><td>Herramienta</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td>Para el corte final de los tetrodos</td></tr><tr><td>Alambre de acero inoxidable recubierto con teflón</td><td>Material</td><td>A-M Systems</td><td>790500</td><td>Alambre de tierra</td></tr><tr><td>Alambre de nicromo de 12,5 micrones</td><td>Material</td><td>Kanthal Palm Coast</td><td>Rediohm-800 1/4 HARD PAC COATING</td><td>Alambre microscópico recubierto con poliimida para fabricar tetrodos.</td></tr><tr><td>Trenzador de tetrodos</td><td>Herramienta</td><td>Neuralynx Inc.</td><td>Estación de ensamblaje de tetrodos</td><td>Aumenta la velocidad y la consistencia en la fabricación de tetrodos.</td></tr><tr><td>Pintura de plata</td><td>Material</td><td>GC International</td><td>22-023</td><td>Para conectar los alambres microelectrodo del tetrodo a los pines del conector (véase la Discusión)</td></tr><tr><td>Mango de cúter X-Acto</td><td>Material</td><td>MSC Direct</td><td>X3001</td><td>Para construir un dispositivo de sujeción del microimpulsor.</td></tr><tr><td>Conector de 26 pines, 2 filas</td><td>Material</td><td>Mill-Max</td><td>852-10-026-30-001000</td><td>Para construir un dispositivo de sujeción del microimpulsor.</td></tr></tbody></table>

micro-array de unidades de crónicos in vivo grabación: tetrodo asamblea

Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Tetrode Assembly

El tetrodo, un paquete de cuatro electrodos, ha demostrado ser una valiosa herramienta para la grabación simultánea de múltiples neuronas in vivo. La amplitud de la diferencia de las firmas del potencial de acción sobre los canales de un tetrodo permite el aislamiento de la actividad de una sola unidad de las señales de múltiples unidades. La capacidad de controlar con precisión la localización estereotáxica y la profundidad de la tetrodo es fundamental para el estudio de la actividad neuronal coordinada en todas las regiones del cerebro. En combinación con un array de micro-, es posible lograr una colocación precisa y un control estable de tetrodos muchos a lo largo de días o semanas. En este protocolo, se demuestra cómo fabricar y tetrodos condición usando las herramientas básicas y materiales, instalar el tetrodos en una matriz de tetrodo de varias unidades de las enfermedades crónicas en vivo la grabación en la rata, hacer conexiones cable a tierra a la matriz de micro-drive, y colocar un cono de protección en serie de la unidad de micro-con el fin de proteger a los tetrodos de contacto físico con el medio ambiente.

En este protocolo, se muestra cómo fabricar y tetrodos condición para su uso con una amplia micro-drive, que fue diseñado para la crónica registros electrofisiológicos en las ratas. Además, se ilustran las etapas finales de construcción de micro-array de unidad, que incluye la instalación de cables de tierra y un cono de protección.

Micro-array de unidades de crónicos In vivo Grabación: Tetrodo Asamblea

El tetrodo, un haz de cuatro electrodos, ha demostrado ser una herramienta valiosa para el registro simultáneo de múltiples neuronas in vivo. El diferencial...

En este protocolo, describimos la fabricación y colocación de haces de cuatro electrodos Tetro para grabaciones crónicas in vivo en roedores despiertos, con el fin de iniciar la fabricación de tetrodos. Un filamento de alambres de microelectrodos se dobla dos veces sobre sí mismo para formar un haz de cuatro alambres paralelos. Luego, estos alambres se tuercen juntos e infunden con una pistola de aire caliente.Cada tero terminado se coloca en una caja de almacenamiento. Mientras se fabrican más teros, cada uno se inserta por un camino dedicado que entra a través de una abertura en un actuador lineal y sale por la base de la matriz de microimpulsores. Cada uno de los cuatro alambres del tero se conecta a pines separados en una placa conectora de salida fijada en la parte superior de la matriz de microimpulsores.La impedancia de cada canal del tero se reduce mediante un proceso de galvanoplastia con oro. Una vez que todos los teros han sido instalados y galvanizados, se conectan dos cables de tierra a los pines correspondientes en la placa de conexión, y se fija un cono protector al marco de la matriz de microimpulsores para su protección después de que el cono haya sido conectado a

micro-drive-array-for-chronic-in-vivo-recording-tetrode-assembly

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Investigación

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Biología

En este protocolo, se muestra cómo fabricar una serie de micro-disco de crónica registros electrofisiológicos en las ratas.

Micro-array de unidades de crónicos In vivo Grabación: Unidad de Fabricación

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Construcción de Matrices Microdrive para grabaciones neuronales crónicas en Awake Ratones Behaving

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