Micro-array de unidades de crónicos In vivo Grabación: Tetrodo Asamblea

En este protocolo, describimos la fabricación y colocación de haces de electrodos Tetro, compuestos por cuatro electrodos, para grabaciones crónicas in vivo en roedores despiertos, con el fin de iniciar la fabricación de tetrodos. Un filamento de alambres de microelectrodos se dobla dos veces sobre sí mismo para formar un haz de cuatro alambres paralelos. Luego, estos alambres se tuercen juntos e infunden con una pistola de aire caliente.

Cada tero terminado se coloca en una caja de almacenamiento. Mientras se fabrican más teros, cada uno se inserta por un camino dedicado que entra a través de una abertura en un actuador lineal y sale por la base de la matriz de microimpulsores. Cada uno de los cuatro alambres del tero se conecta a pines separados en una placa conectora de salida fijada en la parte superior de la matriz de microimpulsores.

La impedancia de cada canal del tero se reduce mediante un proceso de galvanoplastia con oro. Una vez que todos los teros han sido instalados y galvanizados, se conectan dos cables de tierra a los pines correspondientes en la placa del conector, y se fija un cono protector al marco de la matriz de microimpulsores para su protección después de que el cono haya sido conectado a tierra. Matrices de microimpulsores Tero funcionales listas para implante. Hola, soy Dave Nian del laboratorio de Nat Wilson en el Instituto Pickout para el Aprendizaje y la Memoria.

Hoy en el MIT, le mostraremos un procedimiento para fabricar teros, cargar teros y completar las etapas finales de la reconstrucción del microimpulsor. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la actividad neuronal coordinada entre grandes poblaciones de neuronas en una preparación de animal despierto y con comportamiento. Así que comencemos.

Para construir el tero para nuestra matriz estándar de microimpulsores, comenzamos con un tramo de 50 centímetros de alambre micrométrico aislado de 12 micrones. Doble el alambre por la mitad y pase los dedos a lo largo del par para que permanezcan unidos. Asegúrese de que el par de alambres tenga buen contacto a lo largo de toda su longitud.

Doble nuevamente el par sosteniendo juntos los dos extremos. Asegúrese de que el bucle formado en un extremo no presente una curva brusca. Corte los cuatro cables en el extremo sin bucle de modo que las cuatro puntas queden alineadas.

Para el siguiente paso, necesitará un clip de cocodrilo modificado, un dispositivo giratorio motorizado y una barra horizontal sobre el dispositivo giratorio. El clip de cocodrilo se modifica pegando una barra de plástico a la base del clip. Cuando las puntas estén expuestas, sujete los cuatro cables juntos con el clip de cocodrilo modificado.

Cuelgue el lazo de alambre sobre la barra horizontal. Coloque la pinza cocodrilo en la etapa motorizada. Aplique 80 giros en sentido horario seguidos de 40 giros en sentido antihorario al haz de alambre durante aproximadamente tres minutos.

Estos parámetros pueden variarse según sus necesidades. Una vez completada la torsión de los hilos, fusione los cables calentándolos desde tres ángulos diferentes con un soplete de aire caliente, utilizando un flujo medio a bajo para cada ángulo, comenzando uno a dos centímetros por debajo del punto donde se separa el haz de cables. Luego, mueva el soplete de aire caliente hacia arriba y hacia abajo a una distancia de dos centímetros de los cables durante aproximadamente cinco segundos.

Tenga cuidado, ya que las altas temperaturas fundirán completamente el aislamiento y provocarán cortocircuitos. Ahora que los cables se han fusionado, retire el tero del aparato de torsión levantando suavemente la pinza de cocodrilo para aliviar la tensión sobre el tero y corte el tero cerca de la pinza de cocodrilo. En el otro extremo, corte el lazo de manera que queden cuatro hebras de alambre no marcadas de igual longitud. A continuación, separe las hebras individuales en la parte superior doblando suavemente los cables con un par de pinzas de punta blanda.

El tero ya está listo para cargarse en la matriz de microimpulsores. Elabore de 21 a 25 Tet roads más y guárdelos en una caja libre de polvo hasta que sea momento de continuar con el proceso de carga del tero. Necesitará una matriz completa de microimpulsores si aún no ha construido una.

Consulte el video de la matriz de microelectrodos con sistema de avance para la fabricación de la matriz de microimpulsores destinada a grabaciones crónicas in vivo en nuestro plan de diseño. El tero se fijará en un extremo al hardware del conector y pasará a través del tubo portador de poliimida dentro del microimpulsor, de modo que las puntas de los electrodos sobresalgan por debajo de la base de la matriz de microimpulsores. A continuación, demostraremos este proceso de carga para un tero.

Antes de comenzar, construya el soporte del impulsor que puede fijarse a la placa conectora en un extremo y, en el otro extremo, puede sujetarse con un recipiente de hielo. En este ejemplo, el soporte del impulsor es un conector milax pegado a un extremo del mango de un cúter X, que sostiene el tero con pinzas de punta blanda y, utilizando un estereoscopio, empuje la punta del tero dentro del tubo portador de poli-mid de uno de los microimpulsores. Introduzca el Tet road en el tubo hasta que los hilos individuales de los electrodos estén cerca de la placa conectora en la parte superior de la matriz de impulsión; tenga cuidado de no cortar ni doblar los hilos, ya que esto haría que el tetro ingresara al cerebro en un ángulo en lugar de perpendicularmente, lo que debilitaría la integridad del tero.

Ahora, introduzca suavemente el otro extremo de los cuatro cables en sus respectivos orificios de la placa de interfaz de electrodos utilizando pinzas de punta blanda. Evite nuevamente doblar o plegar los cables. Con los cuatro cables en su lugar, inserte los pasadores de oro en sus orificios usando un par de alicates cuya mandíbula inferior ha sido acortada.

Cuando se insertan los pasadores en el orificio, estos pelarán el aislamiento del cable y crearán una conexión eléctrica para referencia posterior. Lleve un registro de la correspondencia entre los microimpulsores y la posición de los pasadores en la placa de interfaz del electrodo. Continúe cargando un total de 18 tetrodos.

Las tres microplataformas restantes del conjunto se utilizarán para alojar los electrodos de referencia. Cada electrodo de referencia está hecho de un tero que utiliza solo uno de los cuatro yns no unidos. Para colocar los electrodos de referencia, siga el procedimiento de carga, pero conecte únicamente uno de los cuatro electrodos al pin correspondiente del electrodo de referencia en la placa conectora.

Si está planeando grabaciones en múltiples sitios, puede ser conveniente planificar con anticipación las conexiones desde los tetrodos hasta la placa conectora. Por ejemplo, agrupe los tetrodos dirigidos a una misma región anatómica en conjunto sobre la placa de interfaz de electrodos. Esto debería minimizar la posibilidad de ajustar accidentalmente el tetropo equivocado durante los experimentos.

Una vez completada la carga de tero, prepare dos cables de tierra, uno para el animal y otro para el cono protector. Corte un alambre de acero aislado de seis pulgadas de largo y retire tres milímetros de aislamiento con pinzas metálicas de cada extremo del alambre. Luego, corte un alambre de acero aislado de cuatro pulgadas de largo.

Retire tres milímetros de aislamiento en un extremo y un centímetro en el otro extremo. Pase el cable de tierra de seis pulgadas a través del orificio en el lateral de la matriz de microimpulsores y hágalo subir hacia la placa de interfaz. Conecte el cable expuesto a la placa de interfaz del electrodo mediante un pasador de oro en el orificio designado para tierra.

Este cable se conectará al cráneo del animal. Enrute el cable de tierra de cuatro pulgadas en paralelo con el cable de tierra previamente instalado. Conecte el extremo pelado de tres milímetros a la placa de interfaz del electrodo utilizando un pasador de oro en otro orificio de tierra designado.

Este cable se conectará más adelante a un cono protector, que actuará como una pequeña jaula de Faraday para reducir la captación de ruido. Ahora hemos terminado de conectar los cables y podemos continuar con el perfeccionamiento de nuestros teros. Nuestro objetivo en este proceso es cortar todos los teros de modo que sean ligeramente más largos que la profundidad de la estructura cerebral objetivo y nuestro ejemplo.

Los microimpulsores están diseñados para un recorrido máximo de cinco a seis milímetros, suficiente para alcanzar muchas áreas de la neocorteza y el hipocampo dorsal de una rata adulta. Primero, baje todos los microimpulsores de manera que los tetrodos queden completamente expuestos simultáneamente. Corte todos los tetrodos a longitudes que sean aproximadamente cinco milímetros más largas que la longitud final deseada, utilizando un par de tijeras finas y afiladas para el corte final.

Prepare un par de tijeras dentadas en un recipiente con hielo, sujete un mango con un ligero ángulo hacia abajo y con las estrías orientadas hacia arriba, dejando el otro mango libre. Ahora, retire completamente todos los electrodos Tet hacia dentro de sus cánulas guía girando los microposicionadores hacia arriba. Utilizando un estereoscopio, extienda completamente un tero fuera de su cánula.

Utilice una regla para colocar las tijeras dentadas a la distancia deseada desde la guía hasta la cánula. Corte lentamente y con suavidad el tero con un movimiento continuo. Después de que se haya cortado este tero, retire el microimpulsor hacia arriba entre tres y cuatro milímetros.

Repita este proceso para cada tero hasta que todos hayan sido cortados. En este momento, está listo para la galvanoplastia con oro. Galvanoplastia con oro.

El ro teros es fundamental para grabaciones estables a largo plazo. Previene la corrosión y mejora la biocompatibilidad. Configure el medidor de impedancia en modo externo en el generador de corriente y en modo de verificación de corriente continua con salida de audio.

Toque los dos cables del generador de corriente con los seis pares posibles de canales dentro de cada tero y utilice la retroalimentación de audio para determinar si existen cortocircuitos entre los pares. Un cortocircuito entre pares de canales suena así. Si existe un cortocircuito, vuelva a cortar el tero con tijeras dentadas y realice la prueba nuevamente.

Si el problema persiste, deseche la carretera Tet y reemplácela. Mueva todas las microplataformas hacia abajo, extendiendo todas las carreteras Tet todo lo posible. Modifique la configuración del equipo para verificar la impedancia del electrodo.

Ahora sumerja las puntas de todos los teros en un baño de solución estándar de plateado de oro. El baño de oro está conectado eléctricamente al cable negativo del medidor de impedancia. Verifique la impedancia del electrodo tocando el cable positivo del medidor de impedancia con el pin correspondiente en la placa de conexión.

Mida y registre la impedancia de cada cable en la matriz de microimpulsores. Los valores normales oscilan entre uno y tres megaohmios en el generador actual. Establezca la corriente entre uno y tres microamperios.

A continuación, asegure firmemente. Conecte el cable positivo del medidor de impedancia al pasador en la placa del conector. En el medidor de impedancia.

Cambie rápidamente del modo normal al modo de derivación y viceversa mientras se encuentra en modo de derivación. La corriente pasará a través del camino de tet y de la solución de oro, y el oro se depositará en la punta del electrodo. La impedancia después de cada ronda de electrodeposición debe ser menor que antes.

Repita el pulso de corriente. Si la impedancia no descendió por debajo de un megaohmio. Un rango conservador de impedancias aceptables es de 250 kiloohmios a 350 kiloohmios.

Si la impedancia desciende por debajo de 200 kiloohmios, esto podría indicar un cortocircuito. Si tras pulsos repetidos la impedancia no disminuye suficientemente, es posible que la punta del electrodo esté obstruida. Vuelva a cortar el tero, verifique la presencia de cortocircuitos y repita el proceso de recubrimiento con oro.

Si volver a cortar no ayuda, reemplace el tero y comience de nuevo. Después de sembrar todos los teros, sumérjalos en etanol y déjelos secar durante tres a cinco minutos. Compruebe la presencia de cortocircuitos dentro de los teros utilizando el generador de corriente con las puntas de los teros expuestas al aire.

Si existe una conexión continua entre dos o más electrodos de un tero, recorte nuevamente el tero y revéstialo con oro una vez más. Una vez que se complete el revestimiento con oro de todos los teros, coloque todos los teros dentro del impulsor. Como paso final en la parte superior de cada microimpulsor, agregue una gota de cola de cianoacrilato de espesor medio en la interfaz entre cada tero y su tubo de polímero.

Esto asegurará el tero a su microimpulsor. El propósito del con protector es proteger los microimpulsores y el alambre expuesto del tero del entorno. También proporciona soporte para manipularlo durante un experimento y reduce el ruido eléctrico.

Utilizamos un cono de plástico impreso en 3D. Sin embargo, es posible fabricar el cono con otros materiales, como un trozo doblado de lata de refresco. Puede tomar el cono de plástico y fijarle cinta de aluminio en la superficie interior o exterior.

Primero inserte y gire parcialmente 3 tornillos del tamaño 72, de tres dieciseisavos de pulgada de longitud, en los lados del cono con la matriz de transmisión suspendida. Inserte el cono sobre la transmisión. Asegúrese de que ambos cables de tierra salgan desde la parte inferior de la matriz de transmisión.

Envuelva la parte expuesta del cable de tierra de cuatro pulgadas alrededor de uno de los tornillos de 1,72 varias veces y asegure firmemente el tornillo. Sujete el cono a la base del accionador apretando los dos tornillos del cono restantes. La producción del conjunto del microaccionador ya está completa. Su conjunto de microaccionador está cargado con 18 teros en tres referencias.

Está encapsulado en un cono y una tapa protectores para mayor durabilidad. La unidad terminada pesa generalmente entre 20 y 25 gramos, en promedio.

El conjunto de electrodos terminado se implanta utilizando un procedimiento quirúrgico estándar. Como puede observarse, el conjunto está conectado a un chip preamplificador y a un haz de cables que transportan la señal hacia el hardware y el software de adquisición de datos. Acabamos de mostrarle cómo fabricar los teros y completar el procedimiento de construcción del conjunto de microelectrodos.

En este video, le mostramos cómo fabricar los teros, cargarlos y acondicionarlos para la grabación in vivo. Además, le mostramos cómo agregar un cono a la matriz de microimpulsores para hacerla más resistente con el tiempo. Hay muchos pasos en la construcción de la matriz de microimpulsores, así que tenga paciencia, trate con cuidado los electrodos y asegúrese de que todos los pasos intermedios se completen adecuadamente.

Gracias por ver el video y mucha suerte con sus experimentos.