Purificación y visualización de la gripe A ribonucleoprotein complejos virales

Este procedimiento comienza eliminando cualquier resto de desecho del virus de la influenza mediante centrifugación. Luego, la membrana viral se rompe con el detergente y los VR nps liberados se separan en un gradiente de glicerol.

Se recogen las fracciones de centrifugación del gradiente y se analiza una alícuota de cada fracción. En un gel SDS-PAGE, los geles teñidos con azul de kumasi permiten determinar las fracciones pico que contienen V NPS. Las fracciones que contienen V NPS luego se concentran mediante centrifugación y los VRP purificados se aplican a una rejilla de muestra para microscopía electrónica de transmisión (TEM) de cobre, que posteriormente se tiñe negativamente para la visualización de los VRP mediante microscopía electrónica de transmisión. Hola, soy WinCo Wu en el laboratorio de la Dra. Nellie Pane en el Departamento de Zoología de la Universidad de British Columbia.

Soy Lindsay Weaver, anteriormente del Laboratorio Pane. Hoy les mostraremos un procedimiento para la purificación de complejos de proteína ribonucleica viral de la influenza. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la importación nuclear del virus de la influenza A en células de cultivo tisular.

Así que comencemos. Para iniciar el experimento, agregue 750 microlitros de tampón MNT a un tubo de centrífuga de policarbonato Beckman de 11 milímetros por 34 milímetros. A continuación, añada 500 microlitros de una solución de virus de la influenza A a 2 miligramos por mililitro al tubo e pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces para mezclar el virus con el tampón MNT.

Después de mezclar, coloque el tubo en un rotor TLA 120.2 y centrifugue en una centrífuga Beckman Optima max E durante 10 minutos a 109.000 × g a 4 grados Celsius. Cuando finalice la centrifugación, retire el sobrenadante y luego resuspenda el sedimento en 500 microlitros de tampón de ruptura. Vortexee vigorosamente la suspensión y agite a 31 grados Celsius durante 20 minutos en un mezclador térmico Einor.

Una vez finalizada la agitación, continúe con la centrifugación de velocidad de sedimentación en gradiente de glicerol. Para preparar el gradiente de glicerol, coloque lo siguiente de glicerol en un tubo de centrífuga Beckman UltraClear de 13 milímetros por 51 milímetros: un mililitro de glicerol al 70% volumen por volumen, 0,75 mililitros de glicerol al 50%, 0,375 mililitros de glicerol al 40% y 1,8 mililitros de glicerol al 33%. Estas soluciones de glicerol se preparan mezclando glicerol puro con tampón NM.

Prepare también un tubo de equilibrio que contenga glicerol y tampón. Luego, vuelva a mezclar la muestra viral disruptada mediante vortex y colóquela sobre el gradiente de glicerol. Coloque el tubo en un rotor oscilante Beckman MLS 50 y centrifugue el gradiente durante tres horas y 45 minutos a 217.000 ×g y 4 °C.

Una vez finalizada la centrifugación, recolecte manualmente alícuotas de 250 microlitros del gradiente comenzando desde la parte superior del tubo. Mantenga las fracciones en hielo o a cuatro grados Celsius. Una vez recolectadas las fracciones, estamos listos para analizarlas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS.

Para comenzar el análisis por electroforesis SDS-PAGE, retire 20 microlitros de cada fracción y colóquelos en un tubo nuevo. Luego añada cinco microlitros de tampón de muestra SDS-PAGE 5× y caliente la muestra a 95 grados Celsius durante cinco minutos. Tras el calentamiento, centrifugue brevemente las muestras y cúrguelas en un gel de poliacrilamida al 10 %, incluyendo marcadores de peso molecular en uno de los pocillos. A continuación, haga migrar las muestras a través del gel hasta que el colorante de carga azul de bromofenol alcance una posición cercana al fondo del gel.

Retire el gel del aparato de electroforesis SDS-PAGE y tiña el gel con azul de kumasi. En función de los resultados de la tinción, identifique las fracciones que contienen principalmente la nucleoproteína de la influenza.

La NP de la influenza A tiene un tamaño aproximado de 56 kilodaltones y es la proteína principal presente en los complejos de ribonucleoproteína viral. Por lo tanto, la banda de NP generalmente es la banda más intensa en las fracciones que contienen los VRNP. En la siguiente parte, concentraremos estas fracciones de VRNP.

Combine las fracciones de glicerol que contienen principalmente NP y distribúyalas en dos tubos de centrífuga de policarbonato Beckman de 11 milímetros por 34 milímetros; llene cada tubo con agua ultrapura tratada con pirofosfato de etilo o DEPC. Luego, pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces para mezclar. Coloque los tubos en un rotor Beckman TLA 120.2 y centrifugue durante cuatro horas y media a 157,000 ×g a cuatro grados Celsius.

Una vez finalizada la centrifugación, retire el sobrenadante y resuspenda el precipitado. En una alícuota de 50 microlitros de agua tratada con DEPC, separe un alícuota del conjunto de V NPS purificado y almacene las demás a 80 grados centígrados bajo cero. Ahora estamos listos para proceder con la tinción negativa de los VRP.

Diluya un microlitro de VRNP purificado en nueve microlitros de tampón PBS recién preparado y filtrado dos veces. Someta una rejilla de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de cobre a una descarga de luz durante 30 segundos. Esta rejilla fue previamente recubierta con una película de Parlow Dion y carbono. Utilizando pinzas para sostener la rejilla de muestra recién sometida a descarga de luz, aplique una gota de cinco microlitros de VRNP diluido sobre la rejilla de muestra.

Deje que la gota se absorba en la rejilla durante ocho minutos mientras espera. Coloque una tira pequeña de parfum en una bandeja, luego dispense sobre el parfum dos gotas que contengan 10 microlitros cada una de tampón PBS, así como una gota de 80 microlitros de la solución de tinción recién preparada, que está compuesta por 1% de melidato de amonio. Lave ahora la rejilla de la muestra bajándola cuidadosamente en las dos gotas de PBS durante un tiempo total de un minuto.

Luego, use un trozo de papel de filtro para absorber parte de la solución de la muestra de la rejilla del espécimen sin dejar que la rejilla se seque. Inmediatamente después de absorber la última gota de tampón de la rejilla del espécimen, sumerja completamente la rejilla dentro de la gota de tinción. Y espere un minuto.

Después de un minuto, utilice un trozo nuevo de papel de filtro para eliminar completamente la solución de tinción de la rejilla de la muestra. Deje secar al aire la rejilla de la muestra durante varios minutos antes de la observación. En un microscopio electrónico de transmisión, a continuación se muestran imágenes representativas de microscopía electrónica de transmisión de NPs de V teñidas negativamente.

Como puede observarse aquí, las V NPS se asemejan a partículas con forma de varilla de longitud variable que miden aproximadamente entre 30 y 120 nanómetros de largo. La NP oligomérica está organizada como una cadena de moléculas de NP que se pliega además en una estructura repetitiva de doble hélice. Por lo tanto, a veces pueden observarse bucles en ambos extremos de estas partículas con forma de varilla.

Acabamos de mostrarle cómo purificar y visualizar el virus de la influenza. Complejos de ribonucleoproteína viral. Al realizar este procedimiento, es importante no usar PBS al diluir los VR mps si está utilizando acetato de uranilo para la tinción negativa.

Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.