Purificación y visualización de la gripe A ribonucleoprotein complejos virales

Este procedimiento comienza con la eliminación de cualquier residuo de la gripe. Una solución viral por centrifugación. A continuación, la membrana viral se rompe con el detergente y la liberación a VR nps se separa en un gradiente de glicerol.

Se recogen las fracciones de centrifugación del gradiente y se ejecuta una alícuota de cada fracción. En una página de SDS, los geles teñidos con azul de kumasi para determinar las fracciones pico que contienen V nps fracciones que contienen V NPS se concentran por centrifugación y los VRP purificados se aplican a una rejilla de muestras TEM de cobre, que luego se tiñe negativamente para la visualización de los VRP mediante microscopía electrónica de transmisión. Hola, soy WinCo Wu en el laboratorio de la Dra. Nellie Pane en el Departamento de Zoología de la Universidad de Columbia Británica.

Soy Lindsay Weaver, anteriormente de Pane Lab. Hoy te mostraremos un procedimiento para la purificación de la influenza, un nucleo de complejos proteicos de costillas virales. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la importación nuclear del virus de la influenza A en células de cultivo de tejidos.

Así que comencemos. Para comenzar el experimento, con 750 microlitros de tampón MNT en un tubo de centrífuga de policarbonato Beckman de 11 milímetros por 34 milímetros. A continuación, agregue 500 microlitros de una solución de dos miligramos por mililitro de virus de la influenza A en la pipeta de tubo hacia arriba y hacia abajo varias veces para mezclar el virus con el tampón MNT.

Después de mezclar, coloque el tubo en un rotor A TLA one 20.2 y centrífugo en una centrífuga Beckman Optima max E durante 10 minutos a 109.000 veces G a cuatro grados Celsius. Cuando termine el centrifugado, retire el sobrenadante, luego resus, suspenda el pellet en un vórtice de tampón de disrupción de 500 microlitros. El pellet se resuspende vigorosamente y luego se agita a 31 grados centígrados durante 20 minutos en una termomezcladora einor.

Una vez finalizado el agitado, proceda con la centrifugación de la velocidad de los sedimentos del gradiente de glicerol. Para preparar el gradiente de glicerol, coloque lo siguiente de glicerol en un tubo centrífugo Beckman UltraClear de 13 milímetros por 51 milímetros, un mililitro 70% volumen por volumen, GLICEROL 0,75 mililitro, 50% glicerol 0,375 mililitro, 40% glicerol y 1,8 mililitros, 33% glicerol. Estas soluciones de glicerol se elaboran mezclando glicerol puro con tampón NM.

Prepare también un tubo de equilibrio que contenga glicerol y tampón. A continuación, vuelva a vorexar la muestra viral interrumpida y cárguela en el gradiente de glicerol. Coloque el tubo en un rotor de cangilón oscilante Beckman MLS 50 y centrifuga el gradiente durante tres horas y 45 minutos a 217.000 veces G a cuatro grados centígrados.

Una vez completada la centrifugación, recoja manualmente 250 alícuotas de microlitros del gradiente comenzando desde la parte superior del tubo. Mantenga las fracciones en hielo o a cuatro grados centígrados. Una vez recolectadas las fracciones, estamos listos para analizarlas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS.

Para comenzar el análisis de la página SDS, retire 20 microlitros de cada fracción y colóquelos en un tubo nuevo. A continuación, añada cinco microlitros de tampón de muestra de cinco veces la página SDS y caliente la muestra a 95 grados centígrados durante cinco minutos Después de calentar, gire las muestras brevemente y cárguelas en un gel de poliacrilamida al 10% que incluya marcadores de peso molecular en uno de los pocillos. A continuación, pase las muestras por el gel hasta que el tinte de carga azul de fenol brom llegue cerca del fondo del gel.

Retire el gel del aparato de páginas SDS y tiña el gel con azul kumasi. Con base en los resultados de la tinción, identifique las fracciones que contienen principalmente influenza. Una proteína nucleo.

La influenza A NP tiene un tamaño aproximado de 56 kilodaltons y es la principal proteína que se encuentra en los complejos de ribonucleoproteínas virales. Por lo tanto, la banda NP generalmente es la banda más fuerte en las fracciones que contienen el VRN ps. En la siguiente parte, concentraremos estas fracciones VRNP.

Combine las fracciones de glicerol que contienen principalmente NP y distribúyalas en dos tubos de centrífuga de policarbonato Beckman de 11 milímetros por 34 milímetros, llene cada tubo con pirocarbonato de etilo o agua ultrapura tratada con DPC. A continuación, pipetea hacia arriba y hacia abajo varias veces para mezclar. Coloque los tubos en un rotor Beckman TLA one 20.2 y centrifugue durante cuatro horas y media a 157.000 veces G a cuatro grados Celsius.

Cuando se complete el centrifugado, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet. En 50 microlitros de alícuota de agua tratada con DPC, el V NPS purificado reserva una alícuota y almacena las demás a menos 80 grados centígrados. Ahora estamos listos para proceder con la tinción negativa de VRPs.

Diluya un microlitro de VRNP purificado en nueve microlitros de tampón de PBS recién hecho y filtrado dos veces, descargue una rejilla de muestra TEM de cobre durante 30 segundos. Esta rejilla estaba previamente recubierta con un Parlow Dion y una película de carbono. Usando pinzas para sostener la rejilla de la muestra de descarga recién incandescente, aplique una gota de cinco microlitros de VRNP diluido sobre la rejilla de la muestra.

Deje que la gota se absorba en la rejilla durante ocho minutos mientras espera. Coloque una pequeña tira de perfume en una bandeja, luego dispense en el perfume dos gotas que contengan 10 microlitros cada una de tampón PBS, así como una gota de 80 microlitros de la solución de tinción recién hecha, que está compuesta por un 1% de dátil memonio al 1%. Ahora lave la rejilla de la muestra bajándola con cuidado en las dos gotas de PBS durante un tiempo total de un minuto.

A continuación, utilice un trozo de papel de filtro para absorber parte de la solución de muestra de la rejilla de la muestra sin dejar que la rejilla de la muestra se seque. Inmediatamente después de absorber la última gota de tampón de la rejilla de la muestra, sumergió completamente la rejilla de la muestra dentro de la gota de mancha. Y espera un minuto.

Después de un minuto, use un nuevo pedazo de papel de filtro para absorber completamente la solución de manchas de la rejilla de la muestra. Deje que la rejilla de la muestra se seque al aire durante varios minutos antes de la observación. Bajo un microscopio electrónico de transmisión, aquí se muestran imágenes representativas de microscopía electrónica de transmisión de V nps teñidos negativamente.

Como puede ver aquí, los V NPS se asemejan a partículas en forma de varilla con longitud variable que tienen aproximadamente de 30 nanómetros a 120 nanómetros de longitud. La NP oligomérica está organizada como una cadena de moléculas NP que se pliega aún más en una estructura de repetición helicoidal doble. Por lo tanto, a veces se pueden ver bucles en ambos extremos de estas partículas en forma de varilla.

Acabamos de mostrarte cómo purificar y visualizar la gripe. Complejos de nucleoproteínas de las costillas virales al realizar este procedimiento. Es importante no usar PBS al diluir el VR mps si está usando acetato de urinario para la tinción negativa.

Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.