Los métodos electrofisiológicos para la grabación de los potenciales sinápticos de la UNM de larvas de Drosophila

Producir registros electrofisiológicos estables de las uniones neuromusculares de las larvas de Joof. Primero diseccione una larva para exponer la pared del cuerpo, los músculos y el sistema nervioso antes de la grabación. Los axones en la base del SNC se cortan después del ganglio ventral.

A continuación, se coloca un electrodo de registro en el músculo de interés y se coloca un electrodo estimulante cerca de las neuronas motoras inervantes. Los axones cortados de las neuronas motoras son aspirados por la pipeta estimulante. A continuación, se pueden registrar los potenciales de la unión excitatoria.

Hola, soy Wendy MLA del Laboratorio McCabe en el Departamento de Fisiología y Biofísica Celular de la Universidad de Columbia. Hoy te mostraremos un procedimiento para medir la transmisión de tics en la unión neuromuscular de la lava transgénica. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la fisiología sináptica y la neurotransmisión.

Así que comencemos. Para comenzar el experimento, disecciona las larvas errantes de tercera y estrella para exponer la pared del cuerpo. Este protocolo se modifica para experimentos electrofisiológicos mediante el uso de clavijas de disección cortas.

Estos tienen de aproximadamente dos a cuatro milímetros de longitud y es menos probable que golpeen el objetivo del microscopio en los electrodos durante el experimento. Después de exponer la pared del cuerpo, use fórceps para sujetar el SNC y elevarlo ligeramente. A continuación, corte los axones motores de los nervios periféricos y extraiga el cerebro.

Después de retirar el cerebro, lave la preparación diseccionada dos veces con tampón HL 3.1 con un milimolar de calcio. Ahora que la disección se ha completado, se pueden hacer registros intracelulares a partir de las células musculares de las larvas. Coloque la placa de disección en el microscopio de electrofisiología y sumerja la preparación con tampón HL 3.1 más calcio.

A continuación, fije el electrodo de baño para que esté en contacto con la solución. El electrodo de succión se utiliza para estimular los nervios periféricos que inervan el músculo. Coloque primero el electrodo de succión en el plato para evitar vibraciones cuando se coloque el electrodo intracelular en el músculo.

Una vez que el electrodo esté en el plato, colóquelo cerca de la neurona motora que inerva el músculo seis. En el tercer segmento abdominal, aplique una succión suave hasta que el nervio cortado esté dentro de la pipeta de vidrio. Tenga cuidado de no estirar los nervios cuando se aplique la succión.

Levante ligeramente la pipeta para que no toque el músculo. Y luego colóquelo de manera que no tire de las fibras nerviosas cortadas. Una vez que el electrodo de succión esté en su lugar, coloque el electrodo de registro para los registros intracelulares.

Utilice un microelectrodo afilado lleno de cloruro de potasio de tres molares. Coloque el electrodo de registro por encima del centro del músculo seis. Ajuste el desplazamiento de entrada para que lea cero para la solución de baño.

Baje lentamente el electrodo y acérquese al músculo con un gran aumento óptico hasta que toque la superficie muscular. Para confirmar que el músculo ha sido penetrado, observe el osciloscopio. El potencial de membrana en reposo debe ser de al menos 60 milivoltios negativos.

El potencial esporádico de la placa nplate en miniatura debería ser ahora visible. Una vez que el electrodo de registro esté en su lugar, deje que las células se estabilicen durante un minuto. Antes de comenzar las grabaciones, utilice un axón HS dos, una etapa de cabeza en un amplificador de abrazadera de eje dos B para detectar cambios en el potencial de membrana.

La abrazadera del eje dos B es la interfaz de una computadora que ejecuta el software de la abrazadera P a través de los datos de dígitos 1322 A, que digitaliza la señal. Registre el potencial de membrana en una PC. Con el software clamp X, aplique estímulos al axón motor para generar potenciales de membrana excitatoria o ejs.

Una vez que se generan los ejs, registre los ejs en miniatura durante un período de tres minutos sin sinapsis de estímulos. El software de análisis Soft Mini se puede utilizar para analizar las trazas y determinar la amplitud y la frecuencia del mini EJP. Para generar ejs.

Utilice un generador de pulsos maestro de ocho para estimular hasta el extremo cortado de un programa de neurona motora. El generador para entregar pulsos de voltaje cuadrado de 0.3 milisegundos programa. Un intervalo de tiempo de cinco segundos entre estímulos para permitir la recuperación sináptica.

En el NMJ se registran al menos 10 potenciales evocados de cada músculo y se promedian las amplitudes. Esta figura muestra un rastro típico registrado a partir del músculo seis de una larva de sal de tipo salvaje con respuestas EJP evocadas y mini EJ.PS espontáneas Acabamos de mostrarte cómo registrar los potenciales cy de la unión neuromuscular de la lava de Drosophila. Al realizar este procedimiento, es importante recordar completar la disección en un plazo de tres a 10 minutos y comenzar los registros electrofisiológicos de inmediato mientras las células aún están sanas y responden.

Si la disección tarda demasiado, el potencial de membrana en reposo de las células musculares será inferior a menos 60 milivoltios, que es demasiado bajo para registrarlo. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.