Name: Cerca de la medición de la membrana plasmática y Global Dynamics calcio intracelular en los astrocitos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-26T23:27:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Aprende a medir la dinámica del calcio intracelular en astrocitos usando microscopía de fluorescencia y reflexión interna total. Este método permite observar simultáneamente el calcio global y cercano a la membrana plasmática.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Uehara Memorial de Japón (a ES), así como la Fundación de Whitehall, el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares y el Premio Stein-Oppenheimer Fundación (a BSK).

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL El procedimiento experimental consta de dos partes principales que se describen de una manera paso a paso a continuación. Parte 1: preparación de los cultivos de astrocitos del hipocampo En pocas palabras, mezcla de neuronas del hipocampo astrocitos culturas fueron preparados utilizando un protocolo bien establecido 1,2,3. Hemos optimizado el procedimiento para obtener saludable astrocitos cultivados. Todos los procedimientos que se enumeran a continuación deben ser llevadas a cabo en un ambiente estéril, como una campana de flujo laminar. Cubreobjetos de la preparación <ul><li> Cubreobjetos de 22 mm (VWR, 48380-068) </li><li> Poli-D-lisina (PDL, Sigma P0899), alícuotas (1 mg / ml) </li><li> Laminina alícuotas (20 ug / ml): agregar 49 ml de agua estéril a 1 mg / ml de solución de laminina (Sigma L2020), en versión 1.2 ml alícuotas y guardar a -20 ° C </li></ul><ol><li> Disolver PDL en agua estéril (50 mg / ml) </li><li> Autoclave de los cubreobjetos, enjuague con agua estéril y colocar en PDL (20 ml por 100 cubreobjetos). Dejar a temperatura ambiente durante la noche. </li><li> Vuelva a colocar PDL con agua estéril (3 lavados rápidos). Luego secar los cubreobjetos y se almacenan a 4 ° C. </li><li> El día de las placas, los astrocitos, cubreobjetos lugar individual en un pozo estéril en una placa de 6 pocillos (Multiwell placas de fondo plano con tapa, estériles de BD Bioscience). Ponga 400 l de laminina en cada cubreobjetos y se incuba durante la noche, en la incubadora para evitar la evaporación. </li></ol> Disección Medios de disección: <ul><li> 500 ml de Earle solución salina balanceada (EBSS) (1X), líquido (Invitrogen, 14.155-063) </li><li> 5 ml solución HEPES (Sigma, H0887) </li></ul> Los medios de comunicación del hipocampo: <ul><li> 412,5 ml de medio mínimo esencial (MEM) (1X), el líquido contiene sales de Earle, pero no rojo L-glutamina o fenol (Invitrogen, 51200-038) </li><li> 10 ml de glucosa (Sigma, D-(+)-glucosa anhidra SIGMA ULTRA G7528) 1 M en el MEM </li><li> 5 ml penicilina-estreptomicina (Invitrogen, 15140-122) </li><li> 5 ml de sodio piruvato solución (Sigma, S8636) </li><li> 12,5 ml de HEPES solución 1 M (Sigma, H0887) </li><li> 5 ml N-2 Suplemento (100X), líquido (Invitrogen, 17502-048) </li><li> 50 ml de suero de caballo, inactivado por calor (Invitrogen, 26050-088) </li></ul> La papaína solución: <ul><li> Añadir 5 ml de los medios de disección en Worthington papaína-022 vial (LK003178, la concentración final, 20 U / ml) y se incuba a 37 ° C durante 60 min. </li></ul><ol><li> Decapitar a las crías de rata entre P1 (normalmente 2 cachorros) siguiendo las directrices revisadas y aprobadas por los reglamentos nacionales y locales de su cuidado animal institucional y el empleo. </li><li> Quite la piel y el cráneo y el cerebro en lugar de una placa de Petri llena de medios de disección en frío. </li><li> Eliminado meninges, diseccionar los dos hemisferios y diseccionar hipocampo. </li><li> Picar el hipocampo en ~ 1X1 piezas mm y digerir en solución de papaína a 37 ° C durante 11-13 min. </li><li> Una vez que las piezas de tejido se han instalado, retire con cuidado la papaína y añadir 5 ml de medio de hipocampo para eliminar todo rastro de la enzima. Repita este paso y se resuspenden en medio del hipocampo (2 ml). </li><li> Triturar las células unas 5 veces hasta que no queden grumos izquierda, con tres pulido llama pipetas de agujeros cada vez más pequeños (1000 m, ~ 500 ~ 300 micras y micras). </li><li> Una vez triturado, pasar a las células a través de un colador de células (tamaño de poro, 70 m, BD Bioscience). Contar las células en 10 l de suspensión. Ajustar el volumen del hipocampo de medio a fin de tener 400.000 células / ml. </li><li> Aspirar la laminina de la cubreobjetos, y antes de que las tapas se pueden secar, la placa de 200 l de la suspensión de células por cubreobjetos. </li><li> Agregar a conectar durante 60 minutos en la incubadora, y luego agregar 2 ml de medio por pozo del hipocampo. </li><li> Al día siguiente, aspirado medio del hipocampo de edad para eliminar las células muertas y los desechos y añadir 2 ml de pre-calentado medio del hipocampo fresco. </li></ol> Mantenimiento Los medios de comunicación Neurobasal: <ul><li> 500 ml neurobasal (Invitrogen, 12348-017) </li><li> 10 ml de suero libre B27 suplemento (Invitrogen, 17504-044) </li><li> 5 ml penicilina-estreptomicina (Invitrogen, 15140-122) </li><li> 1,25 ml de L-glutamina (Invitrogen, 25030-149) </li></ul> Alimentar a los cultivos de neuronas astrocitos dos veces por semana con el medio neurobasal, comenzando cuatro días después de la siembra. Preincubación de los medios de comunicación alrededor de 30 minutos en la incubadora en un frasco de ventilación para equilibrar la temperatura y el CO 2. Parte 2: imágenes de calcio Búfer de grabación del hipocampo: 110 mM NaCl, 5,4 mMKCl, 1,8 mM CaCl 2, 0,8 mM MgCl2, 10 mM D-glucosa, 10 mM HEPES (Todos los productos químicos de Sigma) pH 7,4 (ajustado con NaOH). Carga de tintes de calcio indicador en los astrocitos <ol><li> Lugar de la cultura en un pozo en una placa de 6 pocillos lleno con 2 ml de tampón de la grabación del hipocampo que contiene 2,5 M Fluo-4, AM (Invitrogen, F-14217) y el 0,05% Pluronic ® solución F-127 del 20% en DMSO (Invitrogen, P-3000MP) e incubar a temperatura ambiente durante 10-30 min. </li><li> Quitar Fluo-4 solución y lave cubreobjetos 3 veces con tampón de grabación del hipocampo e incubar a temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Coloque el cubreobjetos sobre la cámara, y limpiar el otro lado del cubreobjetos con líquido de limpieza de lentes. </li><li> Ponga una pequeña gota de aceite de inmersión (aceite de inmersión DF TIPO de Cargille) sobre el objetivo y poner la cámara (cámara abierta de 25 mm cubreobjetos ronda de Warner Instruments) en la platina del microscopio (Olympus IX71). </li><li> Observar las células con transmisión de la luz para ver cómo se ven las células, y ponerlos en el foco. Luego iluminar las células con 488 nm de un monocromador (V policromada de TILL Vision) y determinar si la señal de fluorescencia de Fluo-4 es uniforme y detectable en los astrocitos. </li><li> El uso del PAI y la iluminación TIRF para medir el calcio en los astrocitos. </li></ol> Microscopía TIRF En pocas palabras, se utiliza un microscopio Olympus IX71 equipado con una cámara de Andor IXON DV887DCS EMCCD. El control de la excitación y la adquisición de imágenes se realiza mediante software TILLVision. Las vigas de 454/488/515 nm argón (100 mW) y 442 nm de estado sólido (45 mW) láser se combinan y se controla con un láser HASTA Polilínea combinador, condensador TIRF de doble puerto y un filtro sintonizable acoustoptical y el controlador (AOTF, todos de TILL Photonics) y se introduce en una fibra de banda ancha Kineflex para la entrada en el condensador TIRF. Utilizamos un lente Olympus 60X 1,45 NA para lograr TIRF. La ganancia de la cámara se ajusta para cada astrocito para ofrecer la mejor relación señal-ruido de las imágenes. El fondo y los principios de la microscopía TIRF se han revisado recientemente 4, 5. La mayoría de los componentes ópticos que utilizamos fueron adquiridos de TILL Photonics, que ahora es parte de Agilent Technologies (http://www.till-photonics.com/). La profundidad de penetración TIR se puede calcular a partir de las siguientes ecuaciones. <img style="float:left;" src="/files/ftp_upload/1142/equation.png" alt="Ecuación" /> d = profundidad de penetración n1 = índice de refracción del vidrio n2 = índice de refracción de las células a = ángulo de incidencia NAi = apertura numérica de la incidencia A fin de asegurar que el láser se alinea de manera óptima para TIRF creemos que es útil para observar 100 nm fluorescente talón (Invitrogen, F8803). Se presentan imágenes fijas y videos de cuentas con EPI y microscopía TIRF. Cuando en el TIRF, se observa un aumento dramático en relación señal-ruido y las cuentas de visualización difusión browniana. Creemos que es útil para observar el comportamiento de 100 nm cuentas con microscopía TIRF sobre una base regular (una vez por semana) para asegurarse de que TIRF óptimo se produce, en lugar de la iluminación oblicua en peligro que se produciría si el ángulo crítico no eran iguales a α (ver Fig. 1). La aplicación de agonistas de la proteína G-receptores acoplados Los astrocitos expresan una variedad de receptores acoplados a Gq 6, 7, incluyendo los receptores metabotrópicos de glutamato y los receptores P2Y (agonista, ATP, ADP). La activación de estos receptores conduce a un aumento significativo en los niveles de calcio intracelular en los astrocitos. Por ejemplo, uno puede fácilmente observar elevaciones de calcio intracelular durante la aplicación de la ATP (30 mM) a 8.10 astrocitos. Utilizamos una solución rápida conmutación de Warner Instrumentos llamado VC-77SP rápido paso del sistema de perfusión (http://www.warneronline.com/index.cfm). Con esta solución se puede aplicar el método en menos de ~ 10 ms. <img src="/files/ftp_upload/1142/Fig 1a.jpg" alt="Figura 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1142/fig1c.jpg" alt="" /> Dibujos Figura 1. Y fotografías de la imagen creada. A. Muestra una fotografía de un microscopio montado en un airtable, mientras que (B) muestra una fotografía de la asamblea de láser, los controladores y las cajas de la viga. C. Muestra una fotografía de la platina del microscopio con la cámara montada para la imagen. A la izquierda del dispositivo de perfusión rápida se puede ver (junto con el motor paso a paso y el tubo de teta). A la derecha de la headstage de un amplificador Axopatch 200A se ve. La caricatura esquematiza la trayectoria de la luz en la puesta en marcha y la forma en TIRF se logra. El láser se centra en el plano focal posterior de la lente del objetivo 60X 1,45 NA y su posición se ajusta fuera del centro por lo que surge en el aceite de inmersión en el ángulo crítico α. En este punto, el rayo sufre de reflexión interna total y se desintegra con una distancia λ (véase la ecuación en el texto principal) en el medio de índice de refracción menor. En este caso, este es el búfer de grabación alrededor de los astrocitos y los propios astrocitos. El resultado es una excitación óptica (y por lo tanto de imagen) de las moléculas dentro de ~ 100 nm de la membrana plasmática. En el dibujo de la célula de esto se muestra en verde los receptores &quot;emocionado&quot; de la membrana, mientras que dentro de la celda o en la superficie superior de la celda, no muy contentos. Un informe completo de la microscopía TIRF ha sido proporcionada por Steyer y Almers 4. <img src="/files/ftp_upload/1142/fig2.png" alt="Figura 2" /> Figura 2. Imágenes de 100 nm cuentas fluorescentes adquiridos con EPI y microscopía TIRF. A. Muestra imágenes del PAI de un campo de visión con perlas de varias docenas de 100 nm fluorescentes. Las flechas señalan a los granos rojos que se han asentado en el portaobjetos de vidrio, mientras que las flechas azules señalan a los granos que se están difundiendo en el agua. B. Muestra una imagen TIRF del mismo campo de visión, como se muestra en A. En este punto de vista sólo las cuentas de adherentes mostrado por las flechas rojas son visibles. Esto es porque estos se habían asentado en el coverlsip de vidrio y fueron por lo tanto dentro del campo de ~ 100 nm evanescente. Las cuentas se muestra en una de las flechas azules no están dentro de esta región y por tanto son invisibles en las imágenes TIRF. Las parcelas inferiores muestran la representación 3D de las imágenes. Es evidente que un gran aumento en relación señal-ruido se produce porque las cuentas en el campo evanescente cuando se observan al microscopio TIRF. De hecho, para estas imágenes la relación señal-ruido de EPI fue de 7,1 ± 0,6, mientras que para TIRF fue de 20 ± 0,7. <img src="/files/ftp_upload/1142/fig3.png" alt="Figura 3" /> Figura 3. Imágenes de los astrocitos cargados con Fluo-4 tinte indicador de calcio adquiridos con EPI y microscopía TIRF. A. EPI imágenes de un campo de visión con cinco astrocitos. B. Un TIRF imagen del mismo campo de visión se muestra en B. Nótese que las imágenes de A y B son significativamente diferentes. Esto es porque con TIRF única iluminación de las regiones membrana plasmática en estrecha aposición a la cubreobjetos se va a examinar. Los paneles inferiores muestran ATP-evocó los transitorios de calcio intracelular con imágenes de EPI y microscopía TIRF.

<ol><li>Richler, E., Chaumont, S., Shigetomi, E., Sagasti, A., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+to+image+activation+of+transmitter-gated+P2X+receptors+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An approach to image activation of transmitter-gated P2X receptors in vitro and in vivo.</a> Nature Methods. 5, 87-93 (2008).</li>
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<li>Steyer, J. A., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+real-time+view+of+life+within+100+nm+of+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A real-time view of life within 100 nm of the plasma membrane.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 268-275 (2001).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Fix, M., Takano, T., Nedergaard, M., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+vesicle+fusion+from+lysis+to+monitor+calcium-triggered+lysosomal+exocytosis+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Resolving vesicle fusion from lysis to monitor calcium-triggered lysosomal exocytosis in astrocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 14151-14156 (2007).</li>
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<li>Bowser, D. N., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+forms+of+astrocyte+single+vesicle+exocytosis+imaged+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Two forms of astrocyte single vesicle exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 4212-4217 (2007).</li>
<li>Bowser, D. N., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+ATP+is+the+predominant+cause+of+intercellular+calcium+waves+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Vesicular ATP is the predominant cause of intercellular calcium waves in astrocytes.</a> J Gen Physiol. 129, 485-491 (2007).</li>
<li>Agulhon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+role+of+astrocyte+calcium+in+neurophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology.</a> Neuron. 59, 932-946 (2008).</li>
<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mystery+and+magic+of+glia%3A+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60, 430-440 (2008).</li>
<li>Lee, S. Y., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+glutamate+targets+NMDA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Astrocytic glutamate targets NMDA receptors.</a> J Physiol. 581, 887-888 (2007).</li>
<li>Shigetomi, E., Bowser, D. N., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+forms+of+astrocyte+calcium+excitability+have+distinct+effects+on+NMDA+receptor-mediated+slow+inward+currents+in+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two forms of astrocyte calcium excitability have distinct effects on NMDA receptor-mediated slow inward currents in pyramidal neurons.</a> J Neurosci. 28, 6659-6663 (2008).</li>
<li>Cahoy, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptome+database+for+astrocytes%2C+neurons%2C+and+oligodendrocytes%3A+a+new+resource+for+understanding+brain+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function.</a> J Neurosci. 28, 264-278 (2008).</li>
</ol>

Es un hecho bien establecido que los astrocitos mostrar elevaciones de calcio intracelular. Esto ocurre de forma espontánea, puede ser desencadenada por la actividad neuronal o por la aplicación de agonistas para activar los receptores en la superficie de los astrocitos 11. Una cuestión importante y polémica es si los astrocitos elevaciones de calcio intracelular puede desencadenar la liberación de moléculas de señalización que activan los receptores en las neuronas 11, 12. Esto es controvertido porque no ha habido evi...

<table><tbody><tr><td>Cubreobjetos microscópicos VWR&amp;#174;, redondos, No. 1</td><td>Herramienta</td><td>VWR international</td><td>48380-068</td><td></td></tr><tr><td>Hidrobromuro de poli-D-lisina</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>Laminina de la membrana basal del sarcoma murino Engelbreth-Holm-Swarm</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Earle&amp;rsquo;s (EBSS) (1X), líquida</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>14155-063</td><td></td></tr><tr><td>Medio mínimo esencial (MEM) (1X), líquido, contiene sales de Earle&amp;rsquo;s, pero sin L-glutamina ni rojo de fenol</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>Solución líquida de penicilina-estreptomicina</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Solución de piruvato de sodio</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Solución de HEPES 1 M</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento N-2 (100X), líquido</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Suero de caballo, inactivado por calor</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>PAPAIN-022</td><td>Reactivo</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK003178</td><td></td></tr><tr><td>Medio Neurobasal&amp;#8482; (1X), líquido sin rojo de fenol</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>12348-017</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento libre de suero B-27 (50X), líquido</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina-200 mM (100X), líquida</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>25030-149</td><td></td></tr><tr><td>Filtros para células</td><td>Herramienta</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Placas múltiples de fondo plano BD Falcon con tapas, estériles</td><td>Herramienta</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; hexahidratado</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21108</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; hexahidratado</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Ácido HEPES libre</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glucosa</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4, AM, solución 1 mM en DMSO</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>F-14217</td><td></td></tr><tr><td>Solución al 20% de Pluronic&amp;#174; F-127 en DMSO</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Aceite de inmersión TIPO DF</td><td>Microscopio</td><td>Cargill Labs</td><td>16242</td><td></td></tr><tr><td>Cámara abierta para cubreobjetos redondos de 25 mm, volumen de 100 &amp;mu;l</td><td>Herramienta</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0362 (RC-21BDW)</td><td></td></tr><tr><td>Plataforma P-2 para cámaras Serie 20, sin calefacción</td><td>Herramienta</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0278 (P-2)</td><td></td></tr><tr><td>Microesferas carboxiladas modificadas FluoSpheres, 0,1 &amp;mu;m, fluorescentes amarillo-verdosas (505/515), 2% de sólidos</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>F8803</td><td></td></tr></tbody></table>

cerca de la medición de la membrana plasmática y global dynamics calcio intracelular en los astrocitos

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

El cerebro contiene células gliales. Los astrocitos, un tipo de célula glial, han sabido de largo para proporcionar una función de apoyo pasivo a las neuronas. Sin embargo, la evidencia creciente sugiere que los astrocitos pueden también participar activamente en la función cerebral a través de interacciones funcionales con las neuronas. Sin embargo, muchos aspectos fundamentales de la biología de los astrocitos siguen siendo controvertidas, poco claras y / o explorar experimentalmente. Una cuestión importante es la dinámica de los transitorios de calcio intracelular en los astrocitos. Esto es importante porque el calcio se ha consolidado como un importante segundo mensajero y como se ha propuesto que las elevaciones de los astrocitos de calcio puede desencadenar la liberación de los transmisores de los astrocitos. Sin embargo, no ha habido ninguna descripción detallada o la satisfacción de calcio cerca de la membrana plasmática de señalización en los astrocitos. Total de fluorescencia de reflexión interna (TIRF) microscopía es una herramienta poderosa para analizar los eventos de señalización fisiológicamente relevantes dentro de unos 100 nm de la membrana plasmática de las células vivas. En este sentido, el uso de microscopía TIRF y describir la manera de supervisar cerca de la membrana plasmática y la dinámica global de calcio intracelular casi al mismo tiempo. El perfeccionamiento y la aplicación sistemática de este enfoque tiene el potencial de dar a conocer los detalles precisos de la señalización del calcio astrocitos. Una comprensión detallada de la dinámica del calcio astrocitos puede proveer una base para entender si, cómo, cuándo y por qué someterse a los astrocitos y neuronas dependientes de calcio interacciones funcionales.

Se describe la forma de medir cerca de la membrana y la dinámica global de calcio intracelular en los astrocitos cultivados usando la reflexión total interna y microscopía de epifluorescencia.

Cerca de la medición de la membrana plasmática y Global Dynamics calcio intracelular en los astrocitos

El cerebro contiene células gliales. Los astrocitos, un tipo de célula glial, han sido conocidos durante mucho tiempo por proporcionar una función de soporte pasivo a las neuronas. Sin embargo, ...

En la primera parte de este video, demostraremos cómo preparar el cultivo celular conjunto de astrocitos y neuronas. Para ello, se recolectan varios hipocampos de ratas P1 en un tubo, se digieren con proteasa, se disocian mediante agitación y luego se siembran sobre cubreobjetos. La segunda sección mostrará cómo medir la dinámica del calcio intracelular en astrocitos, lo que implica la carga del colorante indicador de calcio fluo-4 en astrocitos y la medición de la dinámica global del calcio mediante microscopía epifluorescente, así como la medición de la dinámica del calcio cercana a la membrana mediante microscopía TIRF.Al cambiar automáticamente y rápidamente la iluminación, se pueden observar casi simultáneamente el calcio global y el calcio cercano a la membrana. Hola, soy Aji omi, investigador posdoctoral del laboratorio Budget COS del Departamento de Fisiología de la Universidad de California en Los Ángeles. Hoy les mostraré un procedimiento para la imagen de calcio en asto sitios.Utilizamos este procedimiento en nuestro estudio de laboratorio sobre la dinámica del calcio global y cercana a la membrana en un osteocito. Al cambiar la eliminación de forma automática y rápida, podemos resolver el calcio global y el calcio cercano a la membrana. Casi simultáneamente, mostraré cómo aplicamos un TP para inducir un aumento de calcio en el astrocito.Luego finalizaré resumiendo y discutiendo la barrera con el método para estudiar el astrocito. Así que comencemos el estudio. Para iniciar el cultivo de astrocitos, retire la piel y el cráneo de la cabeza de una cría de rata decapitada.Coloque el cerebro en una placa de Petri llena con medio de disección frío, seccione ambos hemisferios y retire las meninges. A continuación, seccione los hipocampos. Corte los hipocampos en trozos de aproximadamente un milímetro por un milímetro.Digiera en solución Pappa a 37 grados Celsius durante 11 a 13 minutos. Retire el tejido diseccionado del incubador. Luego, una vez que los trozos de tejido se hayan sedimentado, retírelos cuidadosamente de la digestión con propano y agregue cinco mililitros de medio hipocampal para lavar los trozos picados de hippo Campi.Repita este paso y, finalmente, resuspenda en medio hipocampal. Pase las células aproximadamente cinco veces a través de tres pipetas progresivamente más pequeñas y pulidas con llama. Una vez que haya pasado las células a través de un filtro celular con un tamaño de poro de 70 micrómetros, agregue cuatro mililitros de medio al filtro.Contar las células en 10 microlitros de suspensión. Ajustar el volumen del medio hipocampal para obtener 400.000 células por mililitro. Ahora preparar laminillas para sembrar la suspensión celular aspirando el laminado de las laminillas, que han estado expuestas a una solución de laminina durante toda la noche.Antes de que las cubreobjetos sequen, plaque 200 microlitros de la suspensión celular por cubreobjeto. Déjelas adherir durante 60 minutos en el incubador. Después de la incubación, agregue dos mililitros de medio hipocampal por pocillo.Al día siguiente, aspire el medio viejo del hipocampo para eliminar células muertas y restos celulares, y agregue dos mililitros de medio fresco del hipocampo previamente calentado. El mantenimiento del medio en cultivos co-cultivos de astrocitos y neuronas debe comenzar cuatro días después de la siembra, agregando un mililitro de medio neurobasal fresco dos veces por semana. Asegúrese de preincubar los medios aproximadamente 30 minutos en el incubador, en un matraz ventilado, para equilibrar la temperatura y el dióxido de carbono.Antes de estudiar los astrocitos, es útil observar perlas fluorescentes nanométricas para optimizar el ángulo del láser para la técnica TURF. Para ello, coloque 200 microlitros de agua en la placa de Petri y agregue un microlitro de perlas fluorescentes de 100 nanómetros, mezcle y observe las perlas mediante microscopía de fluorescencia epiescopia. A continuación, observe las perlas mediante microscopía TURF.Para la imagen de calcio, coloque el cultivo en un pocillo de una placa de seis pocillos que contenga dos mililitros de tampón de registro hipocampal con 2,5 micromoles de fluo-4 AM y 0,05 % de F127, una solución al 20 % en DMSO, e incube a temperatura ambiente durante 10 a 30 minutos. Recuerde cubrir la placa para evitar el blanqueo del fluoróforo. A continuación, retire la solución de fluo-4 AM y lave las laminillas tres veces con tampón de registro hipocampal. Incube las laminillas lavadas a temperatura ambiente durante 30 minutos.Coloque el cubreobjetos en la cámara, limpie el otro lado del cubreobjetos con líquido limpiador para lentes y agregue 200 microlitros de tampón hipocampal. Ponga una pequeña gota de aceite de inmersión sobre el objetivo y coloque la cámara sobre la platina del microscopio. Observe las células utilizando luz de transmisión para enfocar y ver el aspecto de las células.A continuación, ilumine las células con 488 nanómetros procedentes de un monocromador y determine si la señal fluorescente de flu oh cuatro es uniforme y detectable. En los astrocitos, utilice iluminación epi y de tipo turf para medir el calcio en los astrocitos. Aquí, las microesferas fluorescentes se observan mediante iluminación epi.Además de producir fluorescencia de fondo, también muestran un movimiento browniano significativo según el ángulo de iluminación. Cuando el láser se acerca al ángulo crítico, el haz de láser se refleja completamente en la interfaz entre el vidrio y el agua. Esta reflexión total interna genera un campo electromagnético denominado campo evanescente.Esto tiene una profundidad en la célula de menor índice de refracción de aproximadamente 100 nanómetros. Puede excitar fluoróforos en esta capa delgada sobre la superficie del espécimen. A continuación se muestran perlas fluorescentes observadas mediante iluminación de campo oscuro en comparación con iluminación epifluorescente.La relación señal-ruido de la iluminación aumenta significativamente cuando se disminuye el ángulo. El haz del láser no se refleja en la superficie y atraviesa la cubierta para incidir directamente sobre las perlas fluorescentes. Puede observarse una gran cantidad de fluorescencia de fondo.Ahora aumentamos el ángulo. Nuevamente, el ruido de fondo disminuye significativamente y se pueden observar perlas fluorescentes cerca de la superficie del cubreobjetos. Estas imágenes muestran astrocitos y neuronas cargadas con flu oh cuatro.Los astrocitos son células planas con prolongaciones finas, mientras que las neuronas tienen cuerpos celulares redondos y dendritas gruesas y largas. Tanto los astrocitos como las neuronas se ven sanos y cargados con flu. Oh cuatro adecuadamente.Observar los astrocitos mediante microscopía epifluorescente o confocal es útil para determinar si los astrocitos están sanos y si los indicadores de calcio se han cargado adecuadamente en ellos. En las regiones del astrocito más cercanas al vidrio de cubreobjetos, denominadas huella, se observa que un TP provoca un aumento de calcio cerca de la membrana plasmática. Se sabe que los astrocitos del hipocampo expresan receptores anérgicos puros y que la aplicación de un TP en el baño puede provocar una liberación global de calcio.Acabamos de mostrarle cómo preparar cultivos de osteocitos del hipocampo y cómo medir el nivel de calcio en un osteocito tanto globalmente como cerca de la membrana plasmática. Al realizar este procedimiento, es importante recordar optimizar el ángulo del láser; la mejor manera de asegurarlo en el microscopio es observar el comportamiento a velocidades de flujo de 100 milímetros. El registro simultáneo del calcio global y del nivel de calcio cercano a la membrana nos proporcionará no solo una descripción detallada de la señal de calcio, sino también una nueva perspectiva sobre el mecanismo de regulación del calcio en el astrocito.También se nos ocurrió que el enfoque descrito aquí es útil para medir los niveles de calcio intracelular cercanos a la membrana y globales en otros campos excitables desconocidos. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con su experimento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

La preparación de cortes de cerebro de agudos de hipocampo aislado, así como los registros simultáneos electrofisiológicas de los astrocitos y las neuronas...

Dos registros electrofisiológicos de sinápticamente respuestas evocadas neuronal y astroglial en agudas rodajas de hipocampo

Fuente: Bannai, H., et. al., Disección de señales locales de Ca2+ en células cultivadas por indicadores de Ca2+ dirigidos a la membrana. J. Vis. Exp. (2019)El video demuestra imágenes de fluorescencia para observar la dinámica espontánea del calcio específica del compartimento en los astrocitos mediante el monitoreo secuencial de proteínas sensibles al calcio localizadas en la membrana plasmática y el retículo endoplásmico.

Imágenes espontáneas de calcio para la dinámica específica del compartimento en astrocitos

Aquí se describe una adaptación de los protocolos utilizados para inducir la plasticidad homeostática en las neuronas para el estudio de la plasticidad de los receptores acoplados a proteínas G astrocíticos. Recientemente se utiliza para examinar los cambios en el grupo I mGluRs astrocítica en ratones jóvenes, el método se puede aplicar para medir la escala de varios GPCRs astrocitos, en el tejido de los ratones adultos in situ e in vivo, y para obtener una mejor apreciación de la sensibilidad...

La inducción de la plasticidad de astrocítico Receptores por manipulación de Neuronales cocción Precios

Las propiedades y funciones de las señales intracelulares de Ca2+ de los astrocitos en el cuerpo estriado permanecen incompletamente exploradas. Describimos métodos para expresar indicadores de calcio codificados genéticamente en astrocitos estriados utilizando virus adenoasociados del serotipo 2/5 (AAV2/5), así como procedimientos para obtener imágenes fiables de señales de Ca2+ dentro de astrocitos estriados in situ.

Imaging intracelular de Ca 2 + Las señales en estriatal astrocitos de ratones adultos a través de indicadores de calcio codificados genéticamente-

El protocolo AWESAM descrito aquí es óptimo para el cultivo de astrocitos murinos en aislamiento de otras células del cerebro de una manera rápida, sencilla y de bajo costo. Los astrocitos AWESAM exhibición espontáneo Ca2 + señalización, morfología y gene expresión perfiles similares a los astrocitos en vivo.

Cultivo In Vivo-como astrocitos murinos mediante el protocolo AWESAM rápido, sencillo y barato

Demostrado aquí son protocolos para el aislamiento (1) recién endoteliales cerebrales intactos "tubos" y mediciones (2) simultáneas de calcio endotelial y la membrana potencial durante la hiperpolarización derivados del endotelio. Además, estos métodos permiten ajuste farmacológico de calcio de la célula endotelial y señalización eléctrica como variables experimentales individuales o interactivas.

Medidas simultáneas de calcio intracelular y el potencial de membrana en el endotelio Cerebral de ratón recién aislado e intacto

Aquí presentamos un protocolo de Ca2 + proyección de imagen en neuronas y células gliales, que permite la disección de Ca2 + señales con resolución subcelular. Este proceso es aplicable a todo tipo de celular que permiten la expresión de indicadores de Ca2 + genéticamente codificados.

Disección de Local Ca2 + señales en las células cultivadas por membrana dirigidos Ca2 + indicadores

Aquí describimos un método in vitro de imágenes en vivo para visualizar el transporte intracelular de orgánulos y el tráfico de proteínas de membrana plasmática en astrocitos murinos. Este protocolo también presenta una metodología de análisis de imágenes para determinar los itinerarios de transporte de carga y la cinética.

Visualización y análisis del transporte intracelular de organelos y otros Cargos en astrocitos

Este proctocol tiene como objetivo proporcionar un método para imágenes de Ca2+ mitocondrial in vitro e in vivo en astrocitos y neuronas.

Obtención de imágenes de ca2+ mitocondrial en astrocitos y neuronas utilizando indicadores de Ca2+ codificados genéticamente (GECI)

Los métodos actuales describen un enfoque no ratiométrico para imágenes de calcio subcompartimentales de alta resolución in vivo en Caenorhabditis elegans utilizando indicadores de calcio codificados genéticamente fácilmente disponibles.

Imágenes subcelulares del manejo neuronal del calcio in vivo

Este protocolo proporciona una descripción completa de un método para el registro simultáneo de señales de calcio de neuronas y astrocitos en múltiples regiones cerebrales relacionadas con la memoria y demuestra su aplicación en un paradigma de aprendizaje y comportamiento de la memoria.

Un método de fotometría de fibra bicolor para registrar la actividad de las neuronas astrocitos en múltiples regiones cerebrales durante comportamientos de aprendizaje y memoria

Aprende a medir la dinámica del calcio intracelular en astrocitos usando microscopía de fluorescencia y reflexión interna total. Este método permite observar simultáneamente el calcio global y cercano a la membrana plasmática.

Cerca de la medición de la membrana plasmática y Global Dynamics calcio intracelular en los astrocitos

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