Name: El aislamiento de protoplastos a partir de tejidos de 14 días de edad de las plántulas Arabidopsis thaliana /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-17T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Aprende a aislar protoplastos intactos a partir de plántulas de Arabidopsis thaliana de 14 días usando digestión enzimática y gradiente de densidad. Este método eficiente mantiene la viabilidad celular por al menos 96 horas para ensayos.

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Este trabajo fue apoyado por la Estación Experimental Agrícola de la Universidad de Cornell (CUAES) NYC-125433 Hatch Grant y Cornell subvención inicial concedida a OKV

Parte 1. Preparación de un medio sólido para el cultivo de plantas. Por lo general las plantas de la cultura en el concentrado Murasige y Skoog (MS) suplementado con 1% de sacarosa y 0,7% de agar. Contiene todos los ingredientes necesarios para mantener las plantas sanas. Para preparar 1 litro de MS, el pH 5,7 <ol><li> Añadir 2,15 g de MS polvo en 800 ml de agua en botella de 2,0 litros de 1,5 autoclavable. </li><li> Coloque una barra de agitación en la botella y disuelva el polvo MS agitando medio de una placa de agitación. </li><li> Mientras se agita, añadir gota a gota, KOH 1N para ajustar el pH del medio MS con 5,7. </li><li> Agregar 10 g de sacarosa, seguir revolviendo. </li><li> Añadir 7 g de agar *. </li><li> Ajustar el volumen final del medio preparado a 1000 ml y esterilizar en autoclave .* </li><li> Coloque el autoclave medio en una placa de agitación y enfriarlo mientras se agita, por lo que el agar no se precipitará en la parte inferior de la botella. Enfriamiento a medio y 60 º C. * </li><li> Vierta 100 mm placas de Petri. Mantenga las placas a 4 ° C. </li></ol> * Tip 1: No intente disolver el agar. Se solubilizan en autoclave. * Tip 2: Mantenga la barra de agitación en una botella durante el tratamiento en autoclave, ya que lo necesitará más adelante. * Consejo 3: Si usted puede mantener las manos en el frasco en un autoclave durante 10 s, significa que el medio se ha enfriado lo suficiente y se puede empezar a verter las placas. Parte 2. Material vegetal y condiciones de crecimiento. <ol><li> Esterilizar las semillas de Arabidopsis thaliana <ol><li> Colocar 100 mg de semillas en tubos de microcentrífuga eppendorf y agregar 1 ml de etanol al 70%. Mezclar bien e incubar durante 2 min. Girar las semillas hacia abajo, aspirar el sobrenadante. </li><li> Añadir 1 ml de solución de lejía al 1,8% * que contiene 0,1% de Tween-20. Mezcla durante 10 minutos. Decantar semillas y solución de cloro aspirado. </li><li> Este paso tiene que ser hecho en una campana de flujo laminar. Añadir 1 ml de agua estéril a las semillas, mezclar bien. De girar las semillas, se aspira el agua. Repita este paso 5 veces. </li></ol></li><li> Difundir las semillas en el preparado en el paso 1 placas (100 semillas / placa). </li><li> Mantenga placas sembradas durante 24-48 horas a 4 ° C en la oscuridad de la estratificación. </li><li> Crecer las plantas durante 14 días en la cámara de crecimiento de 8 h luz/16 h oscuridad fotoperíodo (con una densidad de flujo de fotones fotosintéticos de 250 mmol m -2 s -1) a 23 / ​​19 ° C de luz / oscuridad régimen de temperatura y 75% en relación humedad. </li></ol> * Tip 1: solución de cloro se hace-por dilución de un hogar de Clorox, que contiene 6% de hipoclorito de sodio y la adición de Tween-20 a una concentración final de 0,1%. Parte 3. El aislamiento de protoplastos a partir de plántulas de Arabidopsis. <ol><li> El segmento 2 g de 14 días de edad, las plántulas con una cuchilla de afeitar nueva en 15 ml de solución esterilizada por filtración, líneas de TV. Cortamos el material vegetal en estériles desechables platos de Petri. </li><li> La transferencia de los tejidos cortados en el vaso de 200 ml, 20 ml de solución enzimática esterilizada por filtración, se agita el vaso para que mezcla tejidos con la solución de la enzima, se cubre con parafina y papel de aluminio. </li><li> Agite tejidos de las plantas a 35 rpm en la oscuridad a temperatura ambiente durante 16-18 h. </li><li> Recoge los protoplastos liberados en 50 ml tubo Falcon por tamizado a través de ocho capas de la tela de queso, pre-húmedo en la solución W5. </li><li> Tamiz protoplastos a partir de la gasa una vez más por el lavado de la tela con 15 ml de solución W5. </li><li> Cuidadosamente protoplastos superposición con 10 ml de solución W5, no molestar el gradiente de azúcar; centrifugar durante siete minutos a 100 g. </li><li> Recoger 10 ml de protoplastos en la interfaz de la solución enzimática y W5 solución (Fig. 1B) y traslado a un nuevo tubo Falcon de 50 ml. </li><li> Agregar 15 ml de solución W5, centrifugar durante 5 min a 60 g. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Lavado de protoplastos libre de solución de la enzima por resuspensión protoplastos en 15 ml de solución W5, centrifugar durante 5 minutos a 60 g </li><li> Retire los protoplastos sobrenadante, resuspender en pellets 1-3ml de solución W5. </li><li> Evaluar el rendimiento de protoplastos por conteo de células con un hemocitómetro. </li></ol> Parte 4. Reactivos: TVL: 0,3 M sorbitol, 50 mM de CaCl2 Filtro-esterilizar y almacenar a -20 ° C. Solución de la enzima: 0,5 M de sacarosa, 10 mM MES-KOH [pH 5.7], 20 mM CaCl 2, 40 mM KCl, 1% de celulasa (Onozuka R-10), el 1% Macerozyme (R10). Filtro de esterilización y el uso de recién. W5 Solución: 0,1% (w / v) de glucosa, 0,08% (w / v) de KCl, 0,9% (w / v) NaCl, 1,84% (w / v) CaCl 2, 2 mM MES-KOH pH 5,7. Filtro-esterilizar y almacenar a temperatura ambiente. Parte 5: Resultados del representante: Uso de las condiciones descritas en Arabidopsis cultura partes 1 y 2 hace plántulas sanas, adecuadas para el aislamiento de protoplastos (Fig. 1A). Protoplastos son purificados por gradientes de densidad de sacarosadiferentes centrifugación y se recoge en la interfaz de W5 y soluciones enzimáticas (Fig. 1B). El uso del procedimiento de protoplastos aislamiento descritas en la Parte 3 que por lo general la cosecha 5 al 10 octubre 6 de protoplastos intactos (Fig. 1C) de un gramo de plantas frescas. <img src="/files/ftp_upload/1149/Fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. El aislamiento de protoplastos a partir de plántulas de Arabidopsis. A, los tejidos de 14 días de plántulas de Arabidopsis se recogieron y se convierte en protoplastos mediante un procedimiento modificado de (Chen y Halkier, 2000). B, protoplastos fueron purificados por centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa y se recoge en la interfaz de la solución enzimática y W5 uffer (flechas blancas). C, el microscopio de campo brillante de protoplastos. Microfotografías fueron obtenidos mediante una cámara CCD enfriado interfaz con el Axioscope Zeiss 2 más microscopio.

<ol><li>Cocking, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+the+Isolation+of+Plant+Protoplasts+and+Vacuoles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles.</a> Nature. 187, 962-963 (1960).</li>
<li>Chen, S., Halkier, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+glucosinolate+uptake+by+leaf+protoplasts+of+Brassica+napus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of glucosinolate uptake by leaf protoplasts of Brassica napus.</a> J Biol Chem. 275, 22955-22960 (2000).</li>
<li>Robert, S., Zouhar, J., Carter, C., Raikhel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+intact+vacuoles+from+Arabidopsis+rosette+leaf-derived+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of intact vacuoles from Arabidopsis rosette leaf-derived protoplasts.</a> Nat. Protocols. 2, 259-262 (2007).</li>
<li>Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%3A+a+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat Protoc. 2, 1565-1572 (2007).</li>
<li>Zhai, Z., Sooksa-nguan, T., Vatamaniuk, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+RNAi+as+a+reverse+genetic+approach+for+gene+functional+analysis+in+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Phys%22%5BJournal%5D)">Establishing RNAi as a reverse genetic approach for gene functional analysis in protoplasts.</a> Plant Phys. 149, 642-652 (2009).</li>
</ol>

La patente provisional que describe el procedimiento para su uso en el análisis funcional de genes de plantas han sido presentados ante Cornell Centro para la Empresa de Tecnología y Comercialización (CCTEC), junio de 2008. Expediente n º 50341/015001: Vatamaniuk, en Aceptar y, Zhai, Z. Método rápido para análisis funcional de los genes de la planta.

Para asegurar el alto rendimiento de protoplastos intactos, es muy importante para la puesta en marcha de las plantas sanas. Use un filtro a esterilizar soluciones para el aislamiento de protoplastos. Recuerde que los protoplastos son frágiles. Por lo tanto, cuando usted está manejando protoplastos, no se mezclan, pipeta o vortex vigorosamente ya que les freno. En cambio, la mezcla protoplastos girando lentamente o grabar el tubo de centrífuga. El procedimiento descrito protoplastos intactos rendimiento que son viables ...

<table><tbody><tr><td>Mezcla de Sales Basales de Murashige y Skoog (MS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri (100x15 mm)</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>82-4001</td><td></td></tr><tr><td>Cellulasa (Onozuka R&amp;#8208;10)</td><td>Research Products International Corp.</td><td>C32200</td><td></td></tr><tr><td>Macerozima (R10)</td><td>Research Products International Corp.</td><td>M22010</td><td></td></tr><tr><td>Papel de gasa para queso</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-665-29</td><td></td></tr><tr><td>LabRotator</td><td>Fisher Scientific</td><td>1167152Q</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Allegra X&amp;#8208;15R</td><td>VWR international</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Axioskop 2 Plus</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

el aislamiento de protoplastos a partir de tejidos de 14 días de edad de las plántulas arabidopsis thaliana</em

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Los protoplastos son células vegetales que han tenido sus paredes celulares enzimáticamente eliminado. El aislamiento de protoplastos a partir de tejidos de plantas se registró por primera vez hace más de 40 años<sup&gt; 1</sup&gt; Y desde entonces ha sido adaptado para el estudio de una variedad de procesos celulares, tales como la localización subcelular de las proteínas, el aislamiento de los orgánulos intactos y de genes diana de la inactivación de doble cadena de ARN de interferencia (RNAi)<sup&gt; 2.5</sup&gt;. La mayoría de los protocolos de aislamiento de protoplastos utilizar tejidos de las hojas de Arabidopsis maduros (por ejemplo, 35 días de edad las plantas)<sup&gt; 2.4</sup&gt;. Hemos modificado los protocolos existentes mediante el empleo de 14 días de edad plántulas de Arabidopsis. En este procedimiento, un programa de 14 días de edad plántulas produjeron 5 10<sup&gt; 6</sup&gt; -10<sup&gt; 7</sup&gt; Protoplastos que permanecen intactos por lo menos 96 horas. El rendimiento de protoplastos de plantas es comparable con los preparativos de las hojas de Arabidopsis madura, pero en lugar de 35 a 36 días, el aislamiento de protoplastos se completa en 15 días. Esto permite disminuir el tiempo y el espacio de cámara de crecimiento que se requieren para el aislamiento de protoplastos de plantas adultas cuando se utilizan, y acelera los estudios posteriores que requieren protoplastos intactos.

Este video muestra un procedimiento para aislar protoplastos intactos los tejidos de 14 días de edad, las plántulas de Arabidopsis. Dado que los protoplastos aislados permanecen intactos por lo menos durante 96 horas y están aislados de plantas en vez de un mes de edad, las plantas adultas, este procedimiento acelera pruebas que requieren protoplastos intactos.

El aislamiento de protoplastos a partir de tejidos de 14 días de edad de las plántulas Arabidopsis thaliana</em

Los protoplastos son células vegetales a las que se les ha eliminado enzimáticamente la pared celular. El aislamiento de protoplastos a partir de diferentes tejidos vegetales se realizó por primera vez...

Este procedimiento comienza con la siembra de semillas de arabidopsis en agar MS el día 14. Después de que las semillas germinen, las plántulas se recolectan y seccionan. El material vegetal se digiere entonces en una solución enzimática que degrada la pared celular.La mezcla resultante se filtra a través de un paño de gasa para separar los protoplastos de otros materiales vegetales. Los protoplastos recolectados se purifican adicionalmente mediante un gradiente de densidad de sacarosa al estratificarlos con la solución W cinco. Los protoplastos se concentran en la interfase entre la enzima y la solución W cinco.Se recolectan y lavan antes de experimentar. Hola, soy Jang Ja del laboratorio de Lina Wauk en el Departamento de Ciencias de Cultivos y Suelos de la Universidad de Cornell. Hoy les mostraremos un procedimiento para el aislamiento de fotografías intactas de TH de 14 días de aro Ana.Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la localización subcelular de las proteínas de interés, para el aislamiento de orgánulos intactos y para el análisis funcional de genes mediante interferencia de ARNi de doble cadena. Comencemos. Iniciamos el procedimiento prepara

isolation-protoplasts-from-tissues-14-day-old-seedlings-arabidopsis

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Biología

Un método para el aislamiento de determinados tipos de células a partir de material vegetal se demuestra. Esta técnica emplea las líneas transgénicas que expresan proteínas fluorescentes marcador en los tipos de célula en particular, la disociación y la fluorescencia celular selección de células activadas. Además, un crecimiento de configuración se ha establecido aquí que facilita el tratamiento...

Fluorescencia de células activadas por la clasificación de los protoplastos de la planta

La base molecular de las respuestas específicas de espacio-fitocromo está siendo investigado el uso de plantas transgénicas que presentan los tejidos y órganos específicos deficiencias fitocromo. El aislamiento de células específicas exhibir agotamiento inducido cromóforo fitocromo por fluorescencia de células activadas clasificación seguido por análisis de microarrays se está utilizando para identificar genes implicados en el espacio-las respuestas específicas de fitocromo.

La investigación de los tejidos y órganos específicos de las respuestas fitocromo usando FACS asistida por células de tipo Perfiles de expresión específica en Arabidopsis thaliana</em

Se presenta un método eficiente y simple para aislar embriones en las primeras etapas de desarrollo...

Aislamiento eficaz y rápida de los embriones en etapa temprana de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Semillas

El reloj circadiano regula alrededor de un tercio del transcriptoma de Arabidopsis, pero el porcentaje de genes que se alimentan de nuevo en la hora normal permanece desconocida. Aquí visualizamos un método para evaluar rápidamente los fenotipos circadianos en cualquier línea mutante de Arabidopsis utilizando imágenes luminiscentes de un reportero circadiano transitoriamente expresada en protoplastos.

Análisis rápido de los fenotipos circadianos en Arabidopsis protoplastos transfectadas con un reloj luminiscentes Reportero

Aquí, presentamos un protocolo de captura interactome aplicado a Arabidopsis thaliana protoplastos hoja mesófilo. Este método depende crıticamente de la reticulación UV in vivo y permite el aislamiento e identificación de proteınas de unión a mRNA de plantas desde un entorno fisiológico.

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Como las mitocondrias son sólo un pequeño porcentaje de la célula de la planta, tienen que ser purificado para una gama de estudios. Las mitocondrias pueden ser aisladas de una variedad de órganos de la planta de homogeneización, seguido de centrifugación gradiente diferencial y densidad para obtener una fracción altamente purificada mitocondrial.

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La viabilidad y efectividad de los métodos scRNA-seq de alto rendimiento anuncian una era unicelular en la investigación de plantas. Aquí se presenta un procedimiento robusto y completo para aislar tipos específicos de células de raíz de Arabidopsis thaliana y la posterior construcción y análisis de la biblioteca del transcriptoma.

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El aislamiento de protoplastos a partir de tejidos de 14 días de edad de las plántulas Arabidopsis thaliana

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