Name: Procedimiento murino Trasplante Renal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-10T00:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 48 s
Description: Aprende el procedimiento de trasplante renal en ratones, incluyendo la cosecha del riñón donante, la anastomosis vascular y el monitoreo de creatinina. Este modelo permite estudiar la biología del trasplante y la función del injerto.

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Estos estudios se han apoyado en parte por la financiación de los NIH R01 AI36532 para GAH. Nos gustaría agradecer el apoyo sobresaliente en el trasplante de la patología del Dr. Tibor Nadasdy, y la valiosa orientación y visión de futuro previstas por el fallecido Dr. Carlos G. Orosz en el inicio de este esfuerzo de investigación.

Donantes de órganos de cosecha (2): <ol><li> Anestesiar a los donantes con IP 65mg/kg pentobarbital, la anestesia se mantiene por isoflurano (2.3%). </li><li> Haga una incisión desde el esternón hasta el pubis para entrar en el abdomen de los donantes y exponer el riñón izquierdo, moviendo el intestino lateralmente hacia el lado derecho. </li><li> Aislar el riñón izquierdo por ligar y dividir los vasos suprarrenales y los testículos con una sutura de seda 8-0. </li><li> Movilizar a la aorta por encima de su unión con la arteria y la vena renal. </li><li> Movilizar a la vena cava inferior (VCI) por encima y por debajo de su unión con la arteria y la vena renal. </li><li> Ligar la aorta por debajo de la arteria y vena renal con una sutura de seda 8-0 para minimizar el sangrado. </li><li> Disecar el uréter izquierdo desde el hilio renal hasta la vejiga. </li><li> Exponer la unión ureterovesical con retracción caudal en el domo de la vejiga. </li><li> Los impuestos especiales un pequeño parche, elíptica de la vejiga que contiene la unión ureterovesical izquierda, que se utiliza para la reconstrucción urinaria a través de una anastomosis de la vejiga de la vejiga. El uréter derecho no está incluido en la vejiga. </li><li> Ligar la vena cava inferior por debajo de la arteria y vena renal con una sutura de seda 8-0. </li><li> Ligar la aorta por encima de la arteria y vena renal, y poco a poco perfusión del injerto in situ con 0,4 ml de 0,2 frío, heparinizada solución de Ringer lactato a través de la aorta infrarrenal. </li><li> Ligar la vena cava inferior por encima de la arteria y vena renal con una sutura de seda 8-0. </li><li> Transecto de la vena renal en su unión con la vena cava inferior. </li><li> Divide la aorta oblicuamente, de aproximadamente 2 mm por debajo de la arteria renal. </li><li> Extraer el riñón y su aporte vascular con uréter unido a la revisión de la vejiga en bloque. Tienda en solución de Ringer lactato en el hielo. </li><li> La eutanasia de los donantes del ratón por dislocación cervical bajo anestesia. </li></ol> Receptor Trasplante (2): <ol><li> Anestesiar al destinatario con 65 mg / kg de pentobarbital IP y mantener la anestesia por isoflurano (2.3%). </li><li> Hacer una incisión, la cubierta del intestino con una gasa húmeda y con cuidado retirar a la izquierda. </li><li> Ligar el uréter derecho, la arteria y la vena renal, y quitar el riñón derecho. </li><li> Con cuidado, aislar y cruz de pinza de la aorta infrarrenal y vena cava inferior con dos pinzas de 4 mm microvasular después de la ligadura de las ramas lumbar. </li><li> Colocar una sutura de nylon 10-0 a través de un espesor total de la aorta y se retraen de hacer una aortaotomy elíptica de un solo corte (aproximadamente una quinta parte del diámetro del vaso). </li><li> Hacer una venotomía longitudinal por la perforación de la vena cava inferior con una aguja de calibre 30 y se extienden adecuadamente utilizando micro tijeras. </li><li> Riego de la aorta y vena cava inferior con solución salina heparinizada para limpiar la sangre intraluminal o coágulos. </li><li> Extirpar el riñón de donantes del hielo y colocarlo dentro del abdomen en el costado derecho del ratón. El riñón del donante se mantiene húmedo con una gasa empapada en solución salina fría. </li><li> Coloque dos suturas en el vértice proximal y distal de la aortaotomy los beneficiarios con el manguito de los donantes de aorta. </li><li> Hacer una anastomosis término-lateral entre el manguito aórtica donantes y la pared anterior de la aortaotomy destinatarios, con 2 o 3 continua 10-0 de nylon en el exterior de la aorta. </li><li> A su vez el injerto renal de donante a la banda izquierda del destinatario. repita el procedimiento anterior entre el manguito de la aorta de los donantes y la pared posterior de la aortaotomy destinatarios </li><li> Realizar una anastomosis término-lateral entre la vena renal de donante y la pared posterior de la VCI destinatarios, con 4 a 5 continua 10-0 de nylon en el interior de la vena cava inferior. y luego la pared anterior de la vena renal IVC y los donantes se cierran con 4 ~ 5 puntos de sutura continua fuera de la vena cava inferior. </li><li> La anastomosis de la vena y la arteria tanto debe ser terminado en 20 minutos. </li><li> Enjuague el injerto con solución salina fría veces varias durante la anastomosis. </li><li> Divide la cúpula de la vejiga receptor, y detener la hemorragia con cauterización. </li><li> Haz un pequeño corte en la cúpula. </li><li> Coloque dos suturas de nylon 10-0 para anastomize el parche donantes vejiga pequeña con la cúpula de la vejiga destinatarios. Cada lado de la anastomosis se sutura con 8 ~ 10 puntos de sutura continua. </li><li> Cerrar el abdomen en dos capas con continuas 4-0 estéril, sintético absorbible Vicryl. </li><li> Dar a los ratones receptores 0,4 ml de solución salina caliente durante la operación de inyección IV intermitente. </li></ol> Cuidados post-operatorios del destinatario <ol><li> Después de cerrar el abdomen, una sola inyección intramuscular de penicilina (500U/10g) se administra (2). </li><li> Además, los beneficiarios reciben 0,05 mg / kg por vía intramuscular la buprenorfina en el día 0 y 1 día después de la cirugía para el dolor. Después de la cirugía, los receptores de trasplante recibir el agua que contiene Sulfatrim (100mg/kg) hasta que el experimento se terminated. </li><li> Para las primeras 24 horas después de la operación los ratones se mantienen en una incubadora con temperatura controlada. </li><li> Los ratones se recuperan de la anestesia antes de 1 hora de la operación y se les da la comida regular y agua ad libitum. </li><li> Suturas de la piel se retiró 2 semanas después de la cirugía. </li></ol> Receptor nefrectomía <ol><li> Anestesiar el receptor 4 ~ 7 días después del trasplante renal con 65 mg / kg IP pentobarbital, la anestesia se mantiene con isoflurano (2.3%). </li><li> Abra el abdomen mediante una incisión de línea media. </li><li> Cubrir el intestino con una gasa empapada en solución salina y con cuidado retirar a la derecha. </li><li> Extirpar el riñón izquierdo después de la ligadura de la vena del uréter izquierdo, el riñón y la arteria. </li><li> Cerrar el abdomen en dos capas con continuas 4-0 sintético absorbible Vicryl. </li></ol> Las mediciones de creatinina en sangre entera <ol><li> Semanales para la extracción de sangre cada dos semanas de menos de 0,2 cc se lleva a cabo ya sea submandibularly sin anestesia o retro orbital, bajo anestesia con isoflurano. </li><li> Cuantitativa los niveles de creatinina en la sangre entera se determinó utilizando un analizador de i-STAT Portable Clínica (Heska Corp., Fort Collins, CO). </li><li> Unidades convencionales (mg / dl) se convierten a las unidades de mol / L, multiplicando las unidades convencionales de 88,4. </li></ol>

<ol><li>Russell, P. S., Chase, C. M., Colvin, R. B., Plate, J. M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+transplants+in+mice.+An+analysis+of+the+immune+status+of+mice+bearing+long-term%2C+H-2+incompatible+transplants%5BTitle%5D)+AND+%22JExpMed%22%5BJournal%5D)">Kidney transplants in mice. An analysis of the immune status of mice bearing long-term, H-2 incompatible transplants.</a> JExpMed. 147, 1449-1468 (1978).</li>
<li>Zhang, Z., Schlachta, C., Duff, J., Stiller, C., Grant, D., Zhong, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+techniques+for+kidney+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Improved techniques for kidney transplantation in mice.</a> Microsurgery. 16 (2), 103-109 (1995).</li>
</ol>

Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por la Universidad Estatal de Ohio IACUC.

Hemos llevado a cabo aproximadamente 1200 casos de trasplante renal en ratones con una tasa de éxito técnico de&gt; 90%. En comparación con el trasplante de corazón, la tasa de éxito del trasplante renal es generalmente baja. Sin embargo, nuestro laboratorio ha mantenido una alta tasa de éxito (&gt; 90%) de un trasplante de riñón. Los puntos clave para el éxito son la reducción de las lesiones de reperfusión en los riñones de donantes y receptores de ambos, y minimizar la hemorragia y trombosis durante todo el procedimi...

<table><tbody><tr><td>i-STAT</td><td>Otro</td><td>HESKA</td><td>Cat 5101</td><td></td></tr><tr><td>Cartucho i-STAT</td><td>Otro</td><td>HESKA</td><td>CAT 5110-CREA</td><td></td></tr><tr><td>Sulfatrim</td><td>Otro</td><td>Actavis</td><td>R02109</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Otro</td><td>NOVAPLUS</td><td>CA-0474</td><td></td></tr><tr><td>Sutura 10-0</td><td>Cirugía</td><td>Sharpoint</td><td>AK0100</td><td></td></tr></tbody></table>

procedimiento murino trasplante renal

Murine Renal Transplantation Procedure

El trasplante renal ortotópico en ratones es un procedimiento técnicamente difícil. Aunque los trasplantes de riñón por primera vez en los ratones fueron realizados por Russell et al más de 30 años (1) y refinado por Zhang et al año más tarde (2), muy pocas personas en el mundo han llegado a dominar este procedimiento. En nuestro laboratorio se han realizado con éxito trasplantes de riñón ortotópico de 1200 con una tasa de&gt; supervivencia del 90%. Los puntos clave para el éxito incluyen un estricto control de la reperfusión, hemorragia y trombosis, tanto durante el procedimiento y después del trasplante, y el uso de 10-0 en lugar de 11-0 sutura de la anastomosis. Cuidados post-operatorios y tratamiento del receptor es extremadamente importante para el éxito del trasplante y la evaluación. Todos los receptores de injerto renal recibir antibióticos en forma de una inyección de penicilina inmediatamente después del trasplante y Sulfatrim en el agua potable continuamente. Salud de los animales en general se evalúa a diario y todo análisis de creatinina en la sangre se llevan a cabo habitualmente con un portátil I-STAT máquina para evaluar la función del injerto.

El trasplante renal en ratones es un procedimiento técnicamente difícil que requiere una cuidadosa atención post-operatoria y el tratamiento para el éxito.

Procedimiento murino Trasplante Renal

El trasplante renal ortotópico en ratones es un procedimiento técnicamente complejo. Aunque los primeros trasplantes de riñón en ratones fueron realizados por Russell...

El procedimiento de trasplante de riñón en ratón comienza con la extracción del órgano donante, en la cual se extrae el riñón izquierdo del ratón donante y se almacena en hielo. Se retira el riñón derecho del ratón receptor para dejar espacio al riñón donante. Luego, el riñón donante se saca del hielo y se trasplanta al ratón receptor.Se permite que el ratón se recupere durante cuatro días antes de que se extirpe el riñón nativo restante. Después de siete días, los niveles de creatinina se monitorean mediante un analizador clínico portátil I STAT para evaluar la función del injerto. Hola, soy Sarah Heimer del laboratorio del Dr. Greg Hadley y del Departamento de Cirugía de Trasplantes de la Universidad Estatal de Ohio.Hoy vamos a mostrarle un procedimiento para el trasplante renal en el ratón. La cirugía de trasplante renal que verá hoy será realizada por nuestra neurocirujana experta residente, Jing Wing. Utilice este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar los eventos inmunológicos del rechazo del trasplante, así como las estrategias para prevenir la ocurrencia del rechazo.Así que comencemos. Para iniciar la extracción del órgano donante, se realiza una compresión cutánea para asegurar que el animal esté completamente anestesiado; trabajando dentro de un campo estéril y utilizando instrumentos esterilizados, realice una incisión media en el mouse anestesiado desde el esternón hasta el pubis y exponga el riñón izquierdo desplazando el intestino lateralmente hacia el lado derecho con el fin de realizar la perfusión del riñón donante. Coloque suturas de seda TY 4-0 alrededor de la aorta y la vena cava inferior por debajo y por encima de la arteria y la vena renales.Perfundir lentamente in situ con solución fría de Ringer con lactato heparinizado a través de la aorta infrarrenal. Aislar el riñón izquierdo mediante la ligadura y sección de los vasos suprarrenales y testiculares, así como de algunas ramas lumbares, con una sutura de seda 8-0. A continuación, movilizar la unión de la aorta y la vena cava inferior con la arteria y la vena renales; colocar cuatro suturas de seda 8-0 alrededor de la aorta y la vena cava inferior por debajo y por encima de la arteria y la vena renales.Para minimizar el sangrado, ligue primero la aorta por debajo del vaso renal. Luego, separe el uréter izquierdo desde el hilio renal hasta la vejiga. Exponga la unión del uréter con la vejiga mediante retracción caudal en el domo de la vejiga.Asegurándose de evitar el uréter derecho, extirpe un pequeño parche elíptico de la vejiga que contenga la unión vesicoureteral izquierda. Este parche se utilizará para la reconstrucción urinaria mediante una anastomosis de vejiga a vejiga. A continuación, ligue la aorta por encima de la arteria y la vena renales.Perfusar lentamente la plataforma in situ con solución fría de Ringer con lactato heparinizado a través de la aorta infrarrenal. Dividir la aorta oblicuamente aproximadamente dos milímetros por debajo de la arteria renal. Finalmente, extraer el riñón y su suministro vascular con el uréter unido al parche de la vejiga en el bloque.El riñón debe almacenarse en solución de lactato de Ringer sobre hielo hasta que esté listo para ser injertado en el receptor huésped, y se debe sacrificar al ratón donante mediante dislocación cervical bajo anestesia. Como se ha demostrado previamente, el trasplante en el receptor comienza con un pellizco para asegurar que el animal esté completamente anestesiado. Para iniciar la cirugía, realice una incisión media, cubra el intestino con gasa húmeda y retráigalo cuidadosamente hacia el lado izquierdo.Para completar con éxito este trasplante renal, se debe realizar una anastomosis entre el manguito aórtico del donante y la aorta del receptor. La vena renal del donante con la vena cava inferior del receptor y el parche vesical del donante con la vejiga del receptor se ligan. La arteria y la vena renales del uréter derecho.Retire el riñón tras la ligadura. Aísle cuidadosamente las ramas lumbares y coloque una pinza microvascular de cuatro milímetros en la aorta infrarrenal y otra en la vena cava inferior. Pase una sutura de nylon 10-0 a través del grosor completo de la aorta y retráigala para realizar una incisión aórtica elíptica mediante un único corte de aproximadamente un quinto del diámetro del vaso.A continuación, realice una venotomía longitudinal perforando la vena cava inferior con una aguja de calibre 30 y extiéndala adecuadamente utilizando tijeras microquirúrgicas. Irriague tanto la aorta como la vena cava inferior con solución salina heparinizada para eliminar la sangre o coágulos intraluminales. Retire el riñón donante del hielo y colóquelo en la región flanqueada derecha del ratón.Coloque dos suturas de fijación en el ápice proximal y distal de la aortotomía del receptor con la manga aórtica del donante. Realice una anastomosis de extremo a lado entre la manga aórtica del donante y la pared anterior de la aortotomía del receptor utilizando de dos a tres suturas continuas de nylon 10-0 en la parte externa de la aorta. Después gire el injerto renal del donante hacia la región flanque izquierda del receptor.Repita el procedimiento anterior entre el manguito aórtico del donante y la pared posterior de la aorta del receptor.Otomy. Es importante recordar que la anastomosis de la vena y la arteria debe finalizarse dentro de los 20 minutos. Además, el injerto debe enjuagarse varias veces con solución salina fría durante la anastomosis.Realice una anastomosis de extremo a lado entre la vena renal del donante y la pared posterior de la vena cava inferior del receptor utilizando cuatro a cinco suturas continuas de nylon 10-0 en el interior de la vena cava inferior. Cierre la pared anterior de la vena cava inferior y la vena renal del donante con cuatro a cinco suturas continuas en el exterior de la vena cava inferior. El siguiente paso consiste en dividir la cúpula de la vejiga del receptor.Detenga la hemorragia con cauterización. Una vez completada la fijación, realice un pequeño corte en la cúpula y coloque dos suturas de fijación de nylon 10-0 para anastomosar el parche pequeño de la vejiga del donante con la cúpula de la vejiga del receptor; suture cada lado de la anastomosis con ocho a diez puntos continuos. Finalmente, cierre el abdomen en dos capas con suturas continuas de vicril sintético absorbible estéril 4-0.El cuidado postoperatorio comienza administrando una inyección intramuscular única de penicilina. Al receptor del trasplante también se le administra 0,05 miligramos por kilogramo de buprenorfina por vía intramuscular el día cero y el día uno después de la cirugía para el dolor, así como un suministro continuo de agua que contiene sulfa trim. Las primeras 24 horas posteriores a la operación, el animal se mantiene en un incubador con temperatura controlada.Las suturas de la piel se retiran dos semanas después de la cirugía. La eliminación del riñón nativo restante es esencial para poder monitorear la disminución de la función del injerto renal mediante mediciones de creatinina sérica. Por lo general, se realiza entre cuatro y siete días después del injerto inicial del riñón donante e implica los pasos principales utilizados al extirpar el riñón del ratón donante.La anestesia con isoflurano se utiliza para sedar al animal huésped y poder recolectar muestras de sangre. Los niveles cuantitativos de creatinina en sangre completa mediante punción retroorbital se utilizan como indicador para evaluar la función del injerto y se determinan empleando un analizador clínico portátil I stat. Las unidades convencionales se convierten a unidades SI multiplicando las unidades convencionales por 88,4.La concentración de creatinina se expresa en micromoles por litro. Los animales normalmente se recuperarán entre dos y tres horas después de la cirugía y mostrarán un comportamiento normal de ratón tras la extirpación del riñón nativo restante. La supervivencia del animal depende de la función del injerto renal, que puede evaluarse mediante exámenes diarios del estado de salud general del animal y de la creatinina.Medición de sangre completa mediante un analizador clínico portátil i-STAT como referencia. Un ratón normal no trasplantado tiene un nivel de creatinina cercano a 20 micromolar. Se considera disfunción del injerto renal cuando el ratón presenta signos de enfermedad y el nivel de creatinina se eleva cerca de 100 micromolar.Acabamos de mostrarle el procedimiento para el trasplante renal en el ratón. Aunque este procedimiento es técnicamente difícil, nuestro laboratorio ha tenido un gran éxito realizándolo. Eso es todo.Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.

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Investigación

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