Imágenes en directo de la migración de células gliales en el ojo del disco imaginal de Drosophila

Disecamos las larvas sujetando los extremos posterior y anterior, luego separando las pinzas en direcciones opuestas. Se elimina el tejido sobrante utilizando tijeras ultrafinas. Esto revelará los dos hemisferios de los discos imaginales del cerebro larval y del ojo.

El cordón nervioso ventral y los ganchos bucales. El complejo de ojo larvario y cerebro se transfiere a una cámara de cultivo. Separamos el lóbulo cerebral del pedículo óptico para visualizar la migración de las células gliales dentro de un disco imaginal de ojo de tipo silvestre.

Para observar las células gliales detenidas en el tallo óptico de un mutante, dejamos el lóbulo cerebral unido al tallo óptico. Hola, soy Patrick Cafferty del Laboratorio de Vanessa Als en el Departamento de Zoología de la Universidad de Columbia Británica. Hola, soy Rin.

Ella también, hoy les mostraremos un procedimiento para visualizar células gliales migratorias en el ojo en desarrollo de Drosophila. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar el desarrollo de las células gliales. Así que comencemos.

Una semana antes del inicio del experimento, se aparean las moscas para generar larvas que expresen GFP bajo el control de un promotor específico de células gliales. Este experimento implica la visualización de GFP marcado con una secuencia de localización nuclear expresada en células gliales. Utilizando el promotor de polaridad invertida, prepare cubreobjetos redondos de 18 milímetros al menos un día antes del experimento, sumergiéndolos durante 10 minutos en una solución de poli-L-lisina al 1 % y luego secándolos al aire durante la noche anterior al experimento.

Limpie una cámara de cultivo magnética de cadena colocando sus componentes en remojo durante la noche en etanol al 70 % el día del experimento. Utilice técnicas asépticas para preparar el medio de cultivo. Añada suero bovino fetal, solución de penicilina y estreptomicina, e insulina a 10 mililitros de medio para insectos de Schneider.

Deje que la cámara de cultivo magnética con cadena limpia se seque al aire en una cabina de cultivo celular antes de eliminar el etanol residual mediante lavado con medio de cultivo preparado. Una vez realizados estos preparativos, podemos comenzar la disección del complejo ojo-cerebro de drosophila. Para iniciar este procedimiento, seleccione una larva de tercer estadio errante del costado de un frasco de moscas y colóquela en una gota de medio de cultivo frío sobre una placa de Petri en hielo durante varios minutos para enfriarla.

Se recomienda enfriar las larvas para ralentizar las contracciones peristálticas del cuerpo y facilitar la disección. A continuación, coloque las larvas enfriadas en una gota de medio de cultivo sobre un plato recubierto con sard, bajo un microscopio de disección. Utilice un par de pinzas finas Dumont para sujetar firmemente la larva. Aproximadamente a un tercio del extremo posterior, espere hasta que la larva saque sus ganchos bucales desde el extremo anterior y, cuando los ganchos bucales estén completamente extendidos, sújelos con un segundo par de pinzas.

Para diseccionar las larvas, tire lentamente de los dos pares de pinzas en direcciones opuestas. El complejo ojo-cerebro, junto con las glándulas salivales, los cuerpos grasos y los tejidos imaginales, se separará del cuerpo de la larva. No tire demasiado rápido de los ganchos bucales o se desprenderán del complejo cerebro larval.

Elimine las glándulas salivales, los cuerpos grasos y los discos imaginarios. Usando tijeras de corte ultrafino, los dos hemisferios del cerebro y los discos oculares permanecerán unidos al cordón nervioso ventral y a los ganchos bucales. A continuación, coloque un cubreobjetos de 18 milímetros sobre una lámina de vidrio, dejando un borde del cubreobjetos sobresaliendo del borde de la lámina. Para poder recoger el cubreobjetos posteriormente, agregue una gota de medio de cultivo sobre el cubreobjetos.

Sujete los ganchos bucales con pinzas y transfiera el complejo iBrain al medio de cultivo sobre el cubreobjetos. Una vez que el complejo cerebro-ocular se haya transferido al cubreobjetos, utilice una disección fina. Tijeras para recortar los ganchos bucales del complejo cerebro-ocular.

La eliminación de los ganchos bucales es importante para la imagenología en vivo, ya que los ganchos bucales continuarán contrayéndose en el medio de cultivo, lo que provocará el movimiento del tejido durante la microscopía. Para visualizar el GL dentro del pedúnculo óptico, deje intactos el pedúnculo óptico del cerebro y el disco imaginal del ojo. Para visualizar la migración de los gliocitos dentro del disco imaginal del ojo, corte cuidadosamente el pedúnculo óptico, el tejido delgado que conecta el cerebro y el disco del ojo, y separe o deseche el cerebro.

Finalmente, tome el cubreobjetos con pinzas y dibuje un círculo debajo alrededor del tejido de interés con un marcador permanente. Este círculo ayudará a localizar el tejido para la microscopía más adelante. Ahora el disco imaginario del ojo está listo para ser montado en una cámara de cultivo magnética.

Para montar el disco imaginal del ojo en una cámara magnética de cultivo, use pinzas para sujetar el borde sobresaliente del cubreobjetos y transfiera el cubreobjetos a la placa inferior de la cámara magnética de cadena sin perturbar el tejido en cultivo. A continuación, coloque la junta tórica de silicona en el cuerpo principal de la cámara de cadena. Coloque cuidadosamente el cuerpo principal encima de la placa inferior.

Agregue medio de cultivo a la cámara. No agregue el medio de cultivo demasiado rápido o el tejido se alterará, lo que permitirá el intercambio de gases bajo la cubierta. No llene completamente la cámara; coloque suavemente la cubierta invisible encima de la cámara con línea de cadena.

Para visualizar las células gliales en migración, coloque la cámara de cultivo sobre la platina de un microscopio confocal o de fluorescencia. Localice la muestra utilizando el círculo en la cubeta como referencia con aumento bajo. Enfoque la muestra utilizando un objetivo de 40 aumentos.

Deje que el tejido se asiente y capture imágenes del disco ocular o del pedúnculo óptico cada 10 a 15 minutos durante un período de tres a cuatro horas, si se realiza correctamente. Este protocolo dará como resultado una serie de imágenes de células gliales marcadas con GFP que migran desde el pedúnculo óptico hacia el disco imaginal del ojo. Aunque el registro por imagenología en vivo durante un período de 60 minutos fue suficiente para observar cambios en las posiciones de los núcleos gliales con un disco imaginal del ojo de tipo salvaje, los núcleos gliales en un mutante para un gen necesario para la migración de las células gliales no lograron salir completamente del pedúnculo óptico.

Hemos cultivado complejos cerebro-oculares durante períodos tan largos como 240 minutos antes de observar deterioro del tejido cultivado. Tras el punto temporal de 240 minutos, comenzamos a observar células positivas para GFP en el medio de cultivo que rodea a los complejos cerebro-oculares cultivados. Además, el GFP se acumulará en manchas difusas a lo largo de los tejidos, lo que sugiere una pérdida de la integridad tisular.

Acabamos de mostrarle cómo cultivar discos imaginales para estudiar la migración de células gliales. Gracias por vernos y mucha suerte con sus experimentos.