Name: Imágenes en directo de la migración de células gliales en el ojo del disco imaginal de Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Aprende a visualizar la migración de células gliales en el ojo en desarrollo de Drosophila mediante microscopía de fluorescencia en vivo con GFP. Este protocolo permite estudiar la dinámica celular en neurobiología.

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Patrick Cafferty es apoyado por una beca postdoctoral de la Sociedad de Esclerosis Múltiple de Canadá.

Parte 1: Pre-montaje experimental. <ol><li> Una semana de antelación, compañero de moscas para generar larvas que expresan GFP bajo el control de un promotor glial-específica. Para nuestro experimento visualizar GFP etiquetados con una secuencia de localización nuclear expresado en las células gliales con la polaridad invertida (repo) promotor (3, 4). </li><li> Prepare la cubierta se desliza por lo menos un día antes en remojo 18 mm cubreobjetos redondos de 10 minutos en 1% de poli-L-lisina solución y el aire seco durante la noche. </li><li> El día antes del experimento, una cámara limpia Chamlide cultura magnética en remojo toda la noche los componentes en el 70% de etanol. </li><li> En el día del experimento, preparar un medio de cultivo mediante la adición de suero fetal bovino, la solución de penicilina-estreptomicina, y la insulina a 10 ml de medio de insectos de Schneider utilizando una técnica aséptica. Las concentraciones de trabajo son: 1X de suero fetal bovino, penicilina 100U/ml; 0.1mg/ml estreptomicina, y 0,2 mg / ml de insulina en el medio de los insectos de Schneider (modificado a partir de (5)). </li><li> Permita que la cámara de cultivo se seque al aire en una campana de cultivos celulares. Lavar el etanol residual de la cámara de la cultura de un enjuague con medio de cultivo preparado. </li></ol> Parte 2: La disección de la Drosophila ojo-cerebro complejo. <ol><li> Seleccione una larva de tercer estadio vagando de un lado de un vial de volar y el lugar en una gota de medio de cultivo refrigeradas en una placa de Petri en hielo durante varios minutos. El enfriamiento de la larva se recomienda para disminuir las contracciones peristálticas del cuerpo para facilitar la disección. </li><li> Coloque la larva refrigerados en una gota de medio de cultivo en una placa recubierta Sylgard bajo un microscopio de disección. </li><li> Bajo el microscopio de disección, utilice un par de pinzas Dumont bien para agarrar firmemente la larva aproximadamente un tercio de la distancia entre el extremo posterior. Espere hasta que la larva expulsa sus ganchos de la boca el extremo anterior. Sujete los ganchos de la boca con un segundo par de pinzas en toda su extensión. Para diseccionar la larva, tire lentamente de los dos pares de pinzas en direcciones opuestas. El complejo ojo-cerebro, junto con las glándulas salivales, los órganos de grasa y tejido imaginario, se retirará de la cuerpo de la larva. No tire los ganchos de la boca demasiado rápido de lo contrario se desprenda del complejo ojo-cerebro. </li><li> Recorte las glándulas salivales, cuerpos grasos, y los discos imaginal con ultra-finas tijeras podadoras. Los dos hemisferios del cerebro y los discos de ojos se adjuntará a la cordón nervioso ventral y ganchos de la boca. </li><li> Lugar un deslizamiento mm cubren 18 en un portaobjetos de vidrio. Dejar un borde de la hoja de la cubierta colgando del borde de la diapositiva con el fin de recoger más tarde la hoja de la cubierta. Añadir una gota de medio de cultivo en la hoja de cubierta de 18 mm. Transferir el complejo ojo-cerebro en el medio de cultivo agarrando los ganchos de la boca con unas pinzas. No comprenden el complejo ojo-cerebro directamente con las pinzas o el tejido dañado. </li><li> Con la tijera fina disección, corte la boca ganchos del complejo del cerebro, ojos y desechar. La eliminación de los ganchos de la boca es importante para la imagen en vivo, como los ganchos de la boca seguirá contrayéndose en el medio de cultivo provoca que el tejido se mueva durante la microscopía. </li><li> Para visualizar la migración gliales en el disco imaginal del ojo, corte con cuidado el tallo óptico, el tejido fino que conecta el cerebro y el disco de ojo y alejar o descartar el cerebro (ver figura 1A). Para visualizar las células de dentro del tallo óptico, dejar el cerebro, el tallo óptico, y el disco imaginal del ojo intacto (véase la Figura 1E). </li><li> Levante el cubreobjetos con unas pinzas y dibujar un círculo debajo de todo el tejido de interés con un marcador permanente. Este círculo se ayuda en la localización de los tejidos para microscopia en la parte 4. </li></ol> Parte 3: Montar el disco imaginal del ojo de una cámara de cultivo magnético. <ol><li> Con unas pinzas, agarre la punta colgando del cubreobjetos. Transferir el portaobjetos a la placa inferior de la cámara magnética Chamlide sin alterar el tejido de la cultura. </li><li> Coloque el anillo de silicona en el cuerpo principal de la cámara Chamlide. Instalar el cuerpo principal en la parte superior de la placa inferior. </li><li> Poco a poco agregue caldo de cultivo para la cámara. No agregue el caldo de cultivo muy rápido o el tejido de interés va a ser alterado. No llenar completamente la cámara para permitir el intercambio de gases en la cubierta. </li><li> Con cuidado, coloque la tapa invisible en la parte superior de la cámara de Chamlide. </li></ol> Parte 4: Visualización de la migración de las células gliales en el disco de los ojos. <ol><li> Coloque la cámara de cultivo en el escenario de un microscopio confocal o de fluorescencia. Localizar la muestra con el círculo en el cubreobjetos como referencia el bajo aumento. </li><li> Se centran en la muestra usando una lente de 40x. Permitir que el tejido para resolver sobre el cubreobjetos. Captura de imágenes del disco óptico del ojo o el tallo cada 10-15min en 3-4 horas. El tejido puede contracción y se mueven fuera de foco. Manual de enfocar el tejido antes de la captura de imágenes aliviará ªes un problema. </li></ol> Parte 5: Los resultados representativos: Se realiza correctamente, el protocolo nos ha permitido recoger una serie de imágenes de la GFP-etiquetados células gliales que migraron desde el tallo óptica en el disco imaginal del ojo (Figura 1 BD). Mientras que imágenes en vivo durante un período de 60 minutos fue suficiente para observar los cambios en las posiciones de los núcleos gliales dentro de un tipo de disco imaginal del ojo salvaje, núcleos gliales en un mutante de un gen necesario para la migración de células gliales fracasado por completo para salir del tallo óptico (flechas Figura 1 FH). Hemos cultivado el cerebro los ojos complejos para períodos de hasta 240 minutos antes de la observación de un deterioro de los tejidos cultivados. Después de los 240 minutos de duración punto empezamos a observar las células GFP positivos en el medio de cultivo circundantes cerebrales cultivadas ojos complejos (flecha Figura 2 C). Además de las buenas prácticas agrarias se acumulan en los puntos difusos a lo largo de los tejidos lo que sugiere una ruptura de la integridad del tejido. <img src="/files/ftp_upload/1155/figure1.png" alt="" width="589" height="241" /> Figura 1: Imágenes en vivo de la GFP-etiquetados núcleos gliales en el tipo de desarrollo salvaje y mutante sistemas visuales. A, E) Las fotografías tomadas con contraste de interferencia diferencial (DIC) de microscopía de tipo salvaje y mutante cultivadas imaginal ojo-discos (ED). En la de tipo salvaje, las células gliales son nacidos dentro y migran desde el tallo óptico (OS) en el ojo de disco. El cerebro ha sido removido para facilitar el acoplamiento y la imagen del disco imaginal del ojo. BD) microscopia de fluorescencia del disco imaginal del ojo de tipo salvaje cultivadas en (A) a los 0, 30 y 60 minutos de tiempo pone de manifiesto los puntos GFP-etiquetados núcleos gliales migran dentro del disco del ojo. FH) La microscopia de fluorescencia del mutante ojo-cerebro complejo (E) a los 0, 30 y 60 puntos de minutos de tiempo demuestra un estancamiento de la GFP-etiquetados núcleos gliales en el tallo óptico (flecha). El cerebro (BR), ha sido colocada en el tallo óptico para facilitar la obtención de imágenes de células gliales en el tallo. <img src="/files/ftp_upload/1155/Figure_2.png" alt="" width="600" height="156" /> Figura 2: Imágenes en vivo de las buenas prácticas agrarias con etiquetas de las membranas gliales en un tipo de disco imaginal del ojo salvaje. Hemos logrado cerebrales cultivadas ojos complejos para 240 minutos de períodos. Cultivos de tejido más de 240 minutos comienza a descomponerse. El medio de cultivo que rodean el disco imaginal del ojo (ED), tallo óptico (OS), y el lóbulo del cerebro (BR) a 0 (A) y 150 minutos (B), en comparación con los 300 minutos de duración punto (C), es gratis de las buenas prácticas agrarias de células positivas, indica con una flecha.

<ol><li>Aigouy, B., Lepelletier, L., Giangrande, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+chain+migration+requires+pioneer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial chain migration requires pioneer cells.</a> J. Neurosci. 28, 11635-11641 (2008).</li>
<li>Silies, M., Yuva, Y., Engelen, D., Aho, A., Stork, T., Klambt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cell+migration+in+the+eye+disc%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial cell migration in the eye disc.</a> J. Neurosci. 27, 13130-13139 (2007).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Sepp, K. J., Auld, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+lacZ+enhancer+trap+lines+to+GAL4+lines+using+targeted+transposition+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Conversion of lacZ enhancer trap lines to GAL4 lines using targeted transposition in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 151, 1093-1101 (1999).</li>
<li>Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+geometric+order+in+proliferating+metazoan+epitheia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The emergence of geometric order in proliferating metazoan epitheia.</a> Nature. 442, 1038-1041 (2006).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+for+Drosophila+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este protocolo se describe la observación de la migración de células gliales en el disco imaginal del ojo mediante microscopía en vivo. En nuestro ejemplo, de tipo salvaje (figura 1 AD), se utilizó un marcador GFP nuclear para observar el movimiento de células gliales en el disco de los ojos en el transcurso de una hora. En un mutante de un gen candidato requerido para la migración de células gliales en la actualidad objeto de estudio en nuestro laboratorio, hemos observado un estancamiento de los núcleos de...

<table><tbody><tr><td>Polilisina-L</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Medio para insectos de Schneider&amp;rsquo;s</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0146</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458</td><td></td></tr><tr><td>Solución de insulina de páncreas bovino</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0516</td><td></td></tr><tr><td>Cámara magnética Chamlide</td><td>Herramienta</td><td>Live cell Instrument</td><td>CM-R-10</td><td>Cámara tipo placa de 35 mm para cubreobjetos de 18 mm</td></tr><tr><td>Tijeras ultrafinas para cortar</td><td>Herramienta</td><td>Fine Science Tools</td><td>15200-00</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont n.º 5</td><td>Herramienta</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente</td><td>Microscopio</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>Cualquier sistema de imágenes fluorescentes que tenga los filtros y la excitación necesarios para GFP puede utilizarse.</td></tr></tbody></table>

imágenes en directo de la migración de células gliales en el ojo del disco imaginal de drosophila

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Las células gliales de vertebrados e invertebrados organismos deben emigrar a las regiones de destino final para ensheath y apoyar las neuronas asociadas. Si bien el progreso reciente ha sido hecho para describir la migración en vivo de las células gliales en el ala en desarrollo pupal (1), los estudios de<em&gt; Drosophila</em&gt; La migración de células gliales que suelen participar el examen de tejido fijado. Análisis en vivo microscópico de las células móviles ofrece la posibilidad de examinar el comportamiento celular en todo el proceso migratorio, incluyendo la determinación de la tasa y los cambios de dirección del crecimiento. Junto con el uso de herramientas genéticas, imágenes en vivo se puede utilizar para determinar las funciones más precisa de genes específicos en el proceso de desarrollo. El trabajo previo de Silies<em&gt; Et al.</em&gt; (2) ha descrito la migración de las células de origen en el tallo óptico, una estructura que conecta el ojo y el cerebro en desarrollo, en el disco imaginal del ojo en el tejido fijado. Aquí planteamos un protocolo para el examen de la migración en vivo de las células gliales en el<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco imaginal del ojo. Nos aprovechamos de una línea de Drosophila que expresa GFP en las células de desarrollo para seguir la progresión de las células gliales de tipo salvaje y en los animales mutantes.

A continuación se describe un protocolo para examinar la migración de las células gliales en el desarrollo del ojo de Drosophila mediante el análisis microscópico directo emparejado con GFP etiquetados células gliales.

Imágenes en directo de la migración de células gliales en el ojo del disco imaginal de Drosophila

Las células gliales de organismos tanto vertebrados como invertebrados deben migrar hacia las regiones diana finales para envainar y dar soporte a las neuronas asociadas. Mientras que...

Disecamos las larvas sujetando los extremos posterior y anterior, luego separando las pinzas en direcciones opuestas. Se elimina el tejido sobrante utilizando tijeras ultrafinas. Esto revelará los dos hemisferios de los discos imaginales del cerebro larval y del ojo.El cordón nervioso ventral y los ganchos bucales. El complejo de ojo larvario y cerebro se transfiere a una cámara de cultivo. Separamos el lóbulo cerebral del pedículo óptico para visualizar la migración de las células gliales dentro de un disco imaginal de ojo de tipo silvestre.Para observar las células gliales detenidas en el tallo óptico de un mutante, dejamos el lóbulo cerebral unido al tallo óptico. Hola, soy Patrick Cafferty del Laboratorio de Vanessa Als en el Departamento de Zoología de la Universidad de Columbia Británica. Hola, soy Rin.Ella también, hoy les mostraremos un procedimiento para visualizar células gliales migratorias en el ojo en desarrollo de Drosophila. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar el desarrollo de las células gliales. Así que comencemos.Una semana antes del inicio del experimento, se aparean las moscas para generar larvas que expresen GFP bajo el control de un promotor específico de células gliales. Este experimento implica la visualización de GFP marcado con una secuencia de localización nuclear expresada en células gliales. Utilizando el promotor de polaridad invertida, prepare cubreobjetos redondos de 18 milímetros al menos un día antes del experimento, sumergiéndolos durante 10 minutos en una solución de poli-L-lisina al 1 % y luego secándolos al aire durante la noche anterior al experimento.Limpie una cámara de cultivo magnética de cadena colocando sus componentes en remojo durante la noche en etanol al 70 % el día del experimento. Utilice técnicas asépticas para preparar el medio de cultivo. Añada suero bovino fetal, solución de penicilina y estreptomicina, e insulina a 10 mililitros de medio para insectos de Schneider.Deje que la cámara de cultivo magnética con cadena limpia se seque al aire en una cabina de cultivo celular antes de eliminar el etanol residual mediante lavado con medio de cultivo preparado. Una vez realizados estos preparativos, podemos comenzar la disección del complejo ojo-cerebro de drosophila. Para iniciar este procedimiento, seleccione una larva de tercer estadio errante del costado de un frasco de moscas y colóquela en una gota de medio de cultivo frío sobre una placa de Petri en hielo durante varios minutos para enfriarla.Se recomienda enfriar las larvas para ralentizar las contracciones peristálticas del cuerpo y facilitar la disección. A continuación, coloque las larvas enfriadas en una gota de medio de cultivo sobre un plato recubierto con sard, bajo un microscopio de disección. Utilice un par de pinzas finas Dumont para sujetar firmemente la larva. Aproximadamente a un tercio del extremo posterior, espere hasta que la larva saque sus ganchos bucales desde el extremo anterior y, cuando los ganchos bucales estén completamente extendidos, sújelos con un segundo par de pinzas.Para diseccionar las larvas, tire lentamente de los dos pares de pinzas en direcciones opuestas. El complejo ojo-cerebro, junto con las glándulas salivales, los cuerpos grasos y los tejidos imaginales, se separará del cuerpo de la larva. No tire demasiado rápido de los ganchos bucales o se desprenderán del complejo cerebro larval.Elimine las glándulas salivales, los cuerpos grasos y los discos imaginarios. Usando tijeras de corte ultrafino, los dos hemisferios del cerebro y los discos oculares permanecerán unidos al cordón nervioso ventral y a los ganchos bucales. A continuación, coloque un cubreobjetos de 18 milímetros sobre una lámina de vidrio, dejando un borde del cubreobjetos sobresaliendo del borde de la lámina. Para poder recoger el cubreobjetos posteriormente, agregue una gota de medio de cultivo sobre el cubreobjetos.Sujete los ganchos bucales con pinzas y transfiera el complejo iBrain al medio de cultivo sobre el cubreobjetos. Una vez que el complejo cerebro-ocular se haya transferido al cubreobjetos, utilice una disección fina. Tijeras para recortar los ganchos bucales del complejo cerebro-ocular.La eliminación de los ganchos bucales es importante para la imagenología en vivo, ya que los ganchos bucales continuarán contrayéndose en el medio de cultivo, lo que provocará el movimiento del tejido durante la microscopía. Para visualizar el GL dentro del pedúnculo óptico, deje intactos el pedúnculo óptico del cerebro y el disco imaginal del ojo. Para visualizar la migración de los gliocitos dentro del disco imaginal del ojo, corte cuidadosamente el pedúnculo óptico, el tejido delgado que conecta el cerebro y el disco del ojo, y separe o deseche el cerebro.Finalmente, tome el cubreobjetos con pinzas y dibuje un círculo debajo alrededor del tejido de interés con un marcador permanente. Este círculo ayudará a localizar el tejido para la microscopía más adelante. Ahora el disco imaginario del ojo está listo para ser montado en una cámara de cultivo magnética.Para montar el disco imaginal del ojo en una cámara magnética de cultivo, use pinzas para sujetar el borde sobresaliente del cubreobjetos y transfiera el cubreobjetos a la placa inferior de la cámara magnética de cadena sin perturbar el tejido en cultivo. A continuación, coloque la junta tórica de silicona en el cuerpo principal de la cámara de cadena. Coloque cuidadosamente el cuerpo principal encima de la placa inferior.Agregue medio de cultivo a la cámara. No agregue el medio de cultivo demasiado rápido o el tejido se alterará, lo que permitirá el intercambio de gases bajo la cubierta. No llene completamente la cámara; coloque suavemente la cubierta invisible encima de la cámara con línea de cadena.Para visualizar las células gliales en migración, coloque la cámara de cultivo sobre la platina de un microscopio confocal o de fluorescencia. Localice la muestra utilizando el círculo en la cubeta como referencia con aumento bajo. Enfoque la muestra utilizando un objetivo de 40 aumentos.Deje que el tejido se asiente y capture imágenes del disco ocular o del pedúnculo óptico cada 10 a 15 minutos durante un período de tres a cuatro horas, si se realiza correctamente. Este protocolo dará como resultado una serie de imágenes de células gliales marcadas con GFP que migran desde el pedúnculo óptico hacia el disco imaginal del ojo. Aunque el registro por imagenología en vivo durante un período de 60 minutos fue suficiente para observar cambios en las posiciones de los núcleos gliales con un disco imaginal del ojo de tipo salvaje, los núcleos gliales en un mutante para un gen necesario para la migración de las células gliales no lograron salir completamente del pedúnculo óptico.Hemos cultivado complejos cerebro-oculares durante períodos tan largos como 240 minutos antes de observar deterioro del tejido cultivado. Tras el punto temporal de 240 minutos, comenzamos a observar células positivas para GFP en el medio de cultivo que rodea a los complejos cerebro-oculares cultivados. Además, el GFP se acumulará en manchas difusas a lo largo de los tejidos, lo que sugiere una pérdida de la integridad tisular.Acabamos de mostrarle cómo cultivar discos imaginales para estudiar la migración de células gliales. Gracias por vernos y mucha suerte con sus experimentos.

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