A neuronales y astrocitos Co-cultivo de ensayo para el análisis de alto contenido de neurotoxicidad

Los sistemas de cribado de alto contenido permiten realizar una variedad de análisis morfológicos y citológicos simultáneamente en muchas muestras. Paralelamente, en este vídeo, se preparan cocultivos de astrocitos neuronales y se colocan en placas de 96 pocillos donde se tratan con un agente neurotóxico y se someten a diversas tinciones de neurotoxicidad. Las placas se cargan en el analizador GE incel y el software del investigador se utiliza para el análisis de estas placas, se pueden obtener lecturas de toxicidad neuro y glial, como el recuento de neuronas de longitud derecha, la expresión de GFAP, un área de astrocitos.

Hola, soy Andrew Ball, científico sénior de Millipore Corporation en Temecula, California. Hoy, Janet Anur, científica investigadora de análisis de alto contenido, demostrará métodos para el cribado de neurotoxicidad de alto contenido utilizando cocultivos de neuronas y astrocitos. Esta técnica emplea reactivos y protocolos del ensayo Neurotox tres desarrollado aquí en Millipore para detectar el crecimiento neurológico, el desarrollo neuronal y de astrocitos y la toxicidad de neuronas y astrocitos.

Espero que disfrutes de las siguientes secuencias. El cribado de neurotoxicidad de alto contenido comienza con la siembra de cocultivos de astrocitos neuronales. En placas de 96 pocillos, una vez que los cocultivos han crecido hasta aproximadamente el 70 al 80%, la fluidez de los pocillos los separa.

Con el uso de células de trippin, se deben contar y ajustar a la densidad adecuada para el ensayo antes de que se siembren en las placas. En 90 microlitros de crecimiento, se debe permitir que las células medianas se asienten en una superficie nivelada durante al menos 15 a 30 minutos para permitir una distribución celular uniforme, lo cual es crítico para este ensayo. Después de esta breve incubación, el medio de crecimiento se sustituye por 90 microlitros, una baja diferenciación sérica de NGF. Medio.

Continúe cultivando estas células hasta que se haya obtenido el grado deseado de cofluidez o diferenciación y luego agregue 10 microlitros de su compuesto neurotóxico de interés a los 90 microlitros de medio de diferenciación presentes. El kit neurotóxico tres contiene las neurotoxinas de control acrilamida K 2 52 o peróxido de hidrógeno uno. Las células han estado expuestas a la toxina durante el tiempo adecuado.

Se pueden teñir y preparar para la obtención de imágenes, que se mostrarán en el siguiente paso I. Cada kit de reactivos contiene los anticuerpos primarios y secundarios y los ojos necesarios para el ensayo, así como una selección de compuestos de control. Todos los tampones necesarios también están incluidos en el kit. En este caso, utilizaremos reactivos para la investigación de neuronas y astrocitos en un sistema de cocultivo al final del período de cultivo antes de la fijación, precalentaremos la solución de fijación de HCS a temperatura ambiente o 37 grados Celsius y una campana de humos químicos.

Agregue 100 microlitros de solución de fijación a cada pocillo y deje que las celdas se fijen a temperatura ambiente durante 30 minutos. Retire la solución fijadora y deséchela de acuerdo con los requisitos de su institución para la eliminación de desechos peligrosos. Si las células se van a teñir más tarde, enjuáguelas dos veces con 200 microlitros de tampón de lavado.

Deje el segundo enjuague en los pocillos herméticamente cerrados y guarde la placa a cuatro grados centígrados. Si las células se van a teñir inmediatamente, enjuague dos veces con 200 microlitros de tampón de inmunofluorescencia HCS am. Es extremadamente importante que no se permita que las células se sequen durante la tinción, así que permita que el lavado final en cualquier serie de lavados permanezca en los pocillos.

Después de preparar una solución de trabajo de anticuerpos primarios anti beta tres tubulina de ratón anti G-F-A-P-H-C-S, retire el tampón de inmunofluorescencia y agregue 50 microlitros de incubación primaria a temperatura ambiente durante una hora. Hacia el final de esta incubación, se puede preparar una solución de trabajo de anticuerpo secundario y ganchos a la solución de tinción nuclear. Esta solución debe mezclarse bien y protegerse de la luz y almacenarse en hielo hasta su uso.

Después de la incubación de una hora, retire el tampón y enjuague tres veces con tampón HCS. A continuación, añada 50 microlitros de la tinción con gancho del anticuerpo secundario HCS y almacene la temperatura ambiente, asegurándose de que las células fijadas estén protegidas de la luz. Después de esta incubación de una hora, realice dos enjuagues de 200 microlitros con el tampón de inmunofluorescencia HCS y dos enjuagues de 200 microlitros con tampón de lavado.

Selle la placa y la imagen inmediatamente o guarde la placa a cuatro grados centígrados hasta que esté lista para tomar imágenes, asegúrese de que la placa esté protegida de la luz mientras se almacena. Para el cribado de HCS, utilizamos el analizador de células GE Healthcare 1000. Este sistema debe estar equipado con divisores de haz que puedan detectar espectros de emisión fluorescente en los rangos azul, verde y rojo, y la adquisición y el análisis de datos se realizan utilizando software de investigación, detección y análisis de alto contenido.

El uso de nuestros reactivos de detección en este paquete de software de instrumentación nos permitirá generar una serie de mediciones de cada uno de nuestros pocillos teñidos para distintos índices de neurotoxicidad. En concreto, los índices que utilizaremos para cuantificar el grado de neurotoxicidad de cada compuesto. R longitud neuronal promedio a recuento de neuronas neuronales, GFAP, intensidad de tinción, área de astrocitos y recuento de astrocitos.

Una vez más, estos datos se adquieren a partir de la fluorescencia, las imágenes generadas por cada pozo y se promedian en todos los pozos múltiples para un análisis de rendimiento extremadamente alto. La configuración de la adquisición de imágenes se produce en el administrador de protocolos de adquisición, donde se puede crear un protocolo de imagen específico de la muestra apropiado para el aumento, la fluorescencia, las longitudes de onda y el número de campos deseados que se van a obtener imágenes por pocillo. En este ejemplo, obtendremos tres longitudes de onda fluorescentes, una para cada uno de nuestros marcadores, los ganchos a la contratinción nuclear, la beta neuronal tres tubulina y la proteína ácida gliofibrilar astrocítica o GFAP.

A continuación, seleccionaremos nuestro aumento 20 veces en este caso y nuestra marca de placa, cada modelo de la cual está asociado a las especificaciones necesarias para la alineación adecuada de las imágenes. A continuación, seleccionamos los pozos que queremos fotografiar. Puede ser un subconjunto o toda la placa.

En este punto, también podemos ajustar la configuración de la cámara. A continuación, seleccionamos los filtros de excitación y emisión adecuados para nuestros marcadores fluorescentes. En este caso hst, FITC y SI tres.

Aquí también podemos optimizar nuestros tiempos de exposición y enfoque para cada canal de fluorescencia. Podemos ajustar la configuración para disminuir cualquier desenfoque en el campo de visión para obtener las imágenes más nítidas posibles. En la ventana de opciones de adquisición, podemos seleccionar cuántos campos queremos crear por pozo y dónde queremos que se ubiquen esas imágenes.

Esto puede variar desde unas pocas imágenes por pocillo hasta muchas, y se pueden ubicar en posiciones centrales y específicas al azar o incluso configurarse para excluir áreas de pocillos donde las células podrían haberse interrumpido debido al pipeteo durante la tinción. En este punto, una vez que esté satisfecho con todos sus ajustes, estará listo para adquirir un conjunto de imágenes para su plato durante la adquisición. Puede monitorear qué pozo se está fotografiando, qué campo de visión y qué longitud de onda el instrumento toma imágenes de cada longitud de onda secuencialmente, y puede ver aparecer cada imagen en tiempo real.

En este diseño, tenemos nuestros ganchos a la tinción nuclear que aparecen en el panel superior, la beta tres tubulina neuronal en el panel central y la GFAP astrocítica en la parte inferior. Las neuronas tienden a tener cuerpos celulares pequeños y numerosas extensiones de neuritas largas y delgadas. Los astrocitos tienden a tener cuerpos celulares más grandes y pueden estar dispersos para cubrir un área grande o pueden mostrar proyecciones para darles una apariencia más parecida a una estrella.

Estos son algunos ejemplos de imágenes superpuestas o fusionadas de los pozos que acaban de adquirir ganchos. Los núcleos de las células de tinción son de color azul, los cuerpos de las células neuronales y las neuritas que expresan beta tres tubulina son de color verde y los astrocitos que expresan GFAP son de color. El análisis de imágenes rojas se realiza utilizando el software de estación de trabajo incel analyzer.

El software viene con varios algoritmos de análisis preprogramados. Un ejemplo es que los parámetros de detección de excrecencia neita se representan para ayudar al software a conocer las dimensiones típicas de la muestra, como el área nuclear, la célula, el tamaño del cuerpo y la longitud neite. Estos valores habilitarán la segmentación de imágenes.

También puede elegir mediciones de interés para su ensayo, incluida la longitud total cerca de la derecha, el recuento cercano a la derecha o el número de núcleos. Los datos se pueden exportar en múltiples formatos, incluso como hojas de cálculo de Excel. Una vez que se ingresa un protocolo, el análisis de la imagen se realiza automáticamente.

Con solo observar el canal de fluorescencia de tubulina beta tres, se puede ver que los núcleos redondos se delinean en verde, los cuerpos de las células neuronales se delinean en azul oscuro y los litros largos y delgados que también se delinean en verde, las mediciones también se muestran a medida que se generan. Otro potente algoritmo de estación de trabajo es el protocolo de análisis multiobjetivo. Hay una variedad de medidas nucleares y citoplasmáticas que se pueden obtener.

Este análisis puede ser útil para la segmentación de astrocitos e incluso es capaz de distinguir entre células y cocultivos que son positivas para la expresión de GFAP delineadas en verde o negativas delineadas en rojo. Aquí puede ver muestras de imágenes representativas de una rata primaria, hipocampo, astrocitos y cultivos neuronales generados por siembra secuencial, sembrando astrocitos primero y luego neuronas en la parte superior de la capa glial. Esta es una imagen fusionada que muestra una tinción nuclear de HCS en forma de gancho, la tinción de beta tres tubulina y GFAP.

El análisis separado del canal de fluorescencia de tubulina beta tres permite la segmentación del crecimiento de neuritas donde los cuerpos celulares se delinean en azul y los derechos cercanos se delinean en verde. A continuación se muestra una curva de dosis-respuesta que ilustra la relación entre la longitud de la neurita y la concentración de acrilamida y un monocultivo primario de hipocampo de rata. Se puede ver que a medida que la concentración de acrilamida aumenta por encima de un milimolar, el crecimiento promedio cerca de la derecha disminuye abruptamente.

Curiosamente, los cultivos de astrocitos y carbón neuronal son más resistentes al tratamiento con acrilamida que los monocultivos. Aquí hay un vistazo a los efectos del tratamiento con peróxido de hidrógeno en el recuento de neuronas. En nuestros cultivos de carbón, tomados usando 10 campos por pozo y promediados en todos los pozos, el recuento de neuronas cae drásticamente un 50% al aumentar la concentración de peróxido de hidrógeno.

En este gráfico, la intensidad de GFAP se representa en función de la concentración de acrilamida. La expresión de GFAP es un indicador conocido de neurotoxicidad, y en este gráfico aumenta a medida que la concentración de acrilamida se eleva por encima de un milimolar. Curiosamente, esta es la misma concentración en la que el recuento de neuronas cae drásticamente.

Los efectos de la exposición a la acrilamida en el área de los astrocitos se demuestran en este gráfico, que compara el área media de los astrocitos en micras cuadradas en el eje Y con la concentración de acrilamida en el eje x. El recuento de astrocitos también se puede determinar utilizando este método. Todos estos datos se pueden extraer de muestras de una sola tinción en varios pocillos de la placa.

Nos preparamos antes. Acabamos de mostrarle cómo se puede utilizar el análisis de alto contenido para realizar una evaluación fiable y sensible de la toxicidad en cocultivos de neuronas y astrocitos. Hemos revisado las técnicas de manejo celular e inmunotinción.

También hemos analizado algunos de los datos representativos que muestran los tipos de análisis utilizados para determinar la neurotoxicidad. Al realizar este procedimiento, es importante asegurarse de que las células fijas no se sequen durante la tinción y también asegurarse de que las células de tinción de anticuerpos secundarios estén protegidas de la luz. Así que eso es todo.

Gracias por mirar y buena suerte con la proyección de alto contenido.