Name: Dendra2 Photoswitching a través de la ventana de imágenes mamarias (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-05T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Aprende el protocolo de fotoconmutación intravital de células tumorales marcadas con Dendra2 en el tejido adiposo mamario de ratón. Esta técnica permite rastrear la dinámica celular y el comportamiento metastásico en microambientes tumorales específicos durante varios días.

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Este trabajo fue apoyado por los EE.UU. Departamento de Defensa (BC075554 a BG y BC061403 a DK), EE.UU. Institutos Nacionales de Salud (U54GM064346 a JvR; CA100324 a JC, JES y JW, CA77522 a JES, U54CA126511 a JC y BG). Damos las gracias a D. Entenberg para ayudar con el microscopio, M. Rottenkolber para ayudar en la fabricación de la caja de imagen y J. Pollard (Albert Einstein College of Medicine) para el anticuerpo F4/80.

1. Generación de tumores fluorescente mediante la inyección de células tumorales en la almohadilla de grasa mamaria: <ol><li> Cultivar una línea celular que expresa Dendra2 proteínas (como un marcador citoplasmático) a 40 - 80% de confluencia. </li><li> Enjuague los platos por lo menos 3 veces con PBS w / o Ca 2 + o Mg 2 +. </li><li> Añadir 3 ml de tripsina por plato de 10 cm y se incuba a 37 ° C hasta que la mayoría de las células de separar y volver a golpear el plato sobre una superficie plana para que temblar. </li><li> Enjuague todas las células de la placa, y el uso de un raspador (goma de policía) para recoger la matriz también. Agregar los 5 ml de PBS. Tomar una alícuota de contar durante el centrifugado. </li><li> Centrifugar a 800 g por 5 min. </li><li> Aspirar y volver a suspender en PBS a una concentración de 5 - 10 x 10 6 / ml. Almacenar en el congelador hasta inyectado (inyección a los 30 minutos). </li><li> Coloque una jaula que contiene 4-5 semanas de edad ratones inmunodeficientes (SCID, por ejemplo) dentro de una campana estéril. </li><li> Rocíe el área alrededor de la cuarta (abdominal) pezón con etanol al 70%. </li><li> Inyectar 0,1 ml en la almohadilla de grasa mamaria. Si un asistente se puede encontrar, una persona puede ocupar el ratón en su lugar mientras se inserta otra aguja dentro de la almohadilla de grasa mamaria. Si se inyecta usted mismo, ponga el ratón bajo anestesia ligera con isoflurano. </li><li> Una vez que el tumor ha crecido a 5.7 mm, la ventana de imagen Mamaria (MIW) debe ser insertado. Nota: Como alternativa, para algunas aplicaciones, la MIW pueden ser insertados en la parte superior de la almohadilla de grasa mamaria sana y las células se pueden inyectar después. Este enfoque permite que imágenes de las células transfectadas transitoriamente en un entorno fisiológico. </li></ol> 2. Manual de fabricación de la ventana de imágenes mamarias (MIW): <ol><li> MIWs (Figura 1) son de plástico tejido de grado para garantizar la biocompatibilidad. Para la construcción manual, usamos cinco o platos de 10 cm. </li><li> Poner los guantes de látex en. </li><li> Calentar un plato de cultivo de tejidos y creando una superficie curva, empujando un objeto redondo, duro contra el plato caliente (usamos un poco de 1 pulgada dremmel para esto). </li><li> Cortar el centro del plato con una hoja de afeitar caliente. </li><li> Use una pequeña, en forma de cono poco dremmel para hacer un agujero en el centro de la cúpula en forma de base de plástico (6-7mm de diámetro). </li><li> Hacer que los bordes de la base de plástico completamente lisa por el lijado con la dremmel y continuar con su presentación. </li><li> Archivo de la parte superior de la base de plástico que hace una superficie plana para el cubreobjetos. El diámetro de la presentada, superficie plana debe ser de 9-10mm. </li><li> Pegue la circular de 8 mm cubreobjetos (número 1) en la superficie plana con el pegamento (adhesivo de cianoacrilato). </li><li> Espere a que el pegamento se seque (15 minutos). </li><li> Use una aguja 26G con calefacción para hacer ocho agujeros de perforación de sutura desde el exterior (donde el vidrio es) en el interior de la base. Los agujeros deben ser distribuidas uniformemente alrededor del cubreobjetos, 0,5-1m m de distancia desde el borde del cubreobjetos. </li><li> Ampliar los orificios con una aguja de sutura 5-0. </li><li> Perforar agujeros en la base de plástico hará que la superficie interna irregular. Con papel de lija, hacen de esta superficie totalmente lisa. </li><li> Cambiar de guantes y un cepillo de pequeñas partículas de plástico de la MIW con un pequeño cepillo. </li><li> Lave el MIW con agua destilada. </li><li> Lave el MIW con etanol al 70%. Usar un Q-tip para limpiar el cristal por lo que es completamente transparente. Si hay manchas de niebla presente en el vapor de pegamento, use cuidadosamente la acetona con un Q-tip. </li><li> Esterilizar el MIW por exposición a rayos UV durante 3 horas a cada lado. </li></ol> Semi-manual de fabricación de la ventana de imágenes mamarias (MIW): Para fabricar la base de plástico, que actualmente estamos utilizando silicona moldes de goma creados con hechos a mano MIWs. El molde se compone de dos partes de caucho de silicona que hacer una réplica exacta de la parte delantera y trasera de la original, cuando se llena con resina de poliéster y de inmediato se unieron. La resina de poliéster líquido se mezclan las 9:10 y resulta en una estructura dura cuando está totalmente curado en 48 horas. El plástico es con protección UV y de archivo, sin descomponerse o ser amarillo con el tiempo. Después de la base se cura, 2.8-2.16 pasos se llevan a cabo la misma manera que para MIWs manualmente a medida. 3. La inserción de la MIW: <ol><li> El área alrededor del pezón 4 º debería haber un pequeño (diámetro de 5-7 mm), tumor de varios días / semanas después de la inyección de células tumorales en función del tipo de células (fig. 1B). ¿Cuánto tiempo ha pasado después de la inyección de células que expresan proteínas Dendra2 photoswitchable u otras proteínas fluorescentes depende de la línea celular utilizada. El tumor no se deberá presentar una apariencia necrótica, y debe tener una piel intacta con el pelo en la parte superior del tumor. Los ratones con tumores necróticos debe ser sacrificado. </li><li> Preparar el espacio estéril para la cirugía, establecer un trozo de tela estéril dentro de una campana estéril. Ponga un pedazo de estériles gauze en el medio, y sentar las MIWs pocos instrumentos estériles alrededor de él: que utilizamos pequeñas tijeras estándar, tijeras de primavera, pinzas microdissecting, pinzas microdissecting, porta-agujas. Mantener estériles Q-tips, una botella de etanol al 70% y guantes estériles en la esquina de la campana. </li><li> El ratón es anestesiado en la campana estéril mediante inyección IP de 2,5% avertina (20 l / g) en HBSS, o bien 10 mg / kg de ketamina + 10 mg / g xilazina (en contacto con su Instituto de Atención de Animales para la aprobación y hacer el pedido). Nota: La solución Avertin debe estar preparado dos veces por semana, usando un filtro esterilizado 0,22 micras filtro y se almacena hasta 500 alícuotas a 4 ° C (en la oscuridad). </li><li> Eliminar el vello por el afeitado de la zona por encima del tumor usando una máquina de afeitar de pequeños animales. </li><li> Retire el resto del pelo con el pelo Nair crema del retiro (disponible en cualquier farmacia). Limpie la piel con etanol por inmersión en Q-tips. </li><li> La transferencia de los animales en la gasa estéril y aplique una pomada oftálmica de los ojos para evitar que se sequen y las infecciones. </li><li> Esterilizar la piel con Betadine y limpia con etanol al 70%. </li><li> Transferencia del animal sobre un paño quirúrgico estéril dentro de la campana estéril. </li><li> Tire de la piel inmediatamente medial al pezón con unas pinzas de corte y la incisión de 2 mm ~ en la piel. </li><li> Separar la almohadilla de grasa mamaria subyacente de la piel con unas tijeras y pinzas de disección. La piel y para hueco durante esta etapa de separación a un tamaño que tendrá en cuenta la inserción de la MIW. </li><li> Si por accidente de un buque se ve afectado durante sugery, utilice un recipiente estéril Q-tips para eliminar la sangre que se produce / para detener la hemorragia sea excesiva. </li><li> Inserte el MIW de tal manera que no es la piel en la parte superior de la base de MIW y sutura en su sitio que no se usen hilo absorbible y revertir el corte de la aguja. </li><li> El uso de tejido adhesivo de cianoacrilato o para rellenar los agujeros de sutura y asegurar el MIW a la piel. </li><li> Añadir TMP-SMX combinación de antibióticos: (sulfametoxazol 0,6 mg / ml, Trimetoprim 0,12 mg / ml) en la botella de agua para la jaula de 3 días antes y después de la cirugía. </li><li> El animal se mantiene bajo anestesia para 1-4h después de la inyección IP avertina. Dado que la cirugía generalmente lleva alrededor de 45 minutos, es importante para ayudar a los animales se recuperan después: </li><li> Colocar una compresa caliente a mano (37 ° C) (disponible en farmacias) en la parte inferior de la jaula y cúbrala con una gasa. </li><li> Mantener al animal en la parte superior de la almohadilla hasta que se convierte en su estómago y comienza a caminar. </li><li> Si el animal está inconsciente por más de 3 horas, inyecte 0,3 ml de HBSS por vía intraperitoneal para la rehidratación. </li><li> El animal se le permite recuperarse en los próximos 3-4 días antes de la sesión de imágenes primero se lleva a cabo. </li></ol> 4. Estructura de la caja de imagen El cuadro de imagen asegura que el MIW está sentado plano, justo por encima del objetivo del microscopio. También facilita el control de temperatura y flujo de aire constante a través de la anestesia de isoflurano. La caja está fabricada en plexiglás y se pegan entre sí mediante soldadura de plástico. Sean aptas para la platina del microscopio específico y por lo tanto la forma de su parte inferior varía en función del microscopio usado (Figura 2 muestra el esquema de la caja instalados en fase microscopio Leica SP5). Dimensiones de la caja en centímetros son l = 11,4 cm, w = 7,6 cm, h = 4,4 cm (Figura 2). La parte inferior del cuadro se compone de una placa hueca, 12.7x8.4 cm de tamaño, que cabe dentro de la platina del microscopio Leica SP5, y dos correderas &quot;puertas&quot; de 5,7 x 5,7 cm_each, que forman una abertura circular (d = 2,22 cm ) cuando está cerrado. El MIW se ajusta a esta apertura. La pieza frontal contiene el orificio de entrada para la aplicación de anestesia, mientras que una de las piezas laterales contiene un orificio de salida que conduce al vacío. Tenga en cuenta que el condensador y el soporte de diapositivas deben ser removidos antes de la colocación de cuadro de imagen. 5. Caja de imagen Uso <ol><li> Colocar el animal bajo anestesia con isoflurano y aplicar ungüento oftálmico para los ojos. </li><li> Conecte el tubo de escape isoflurano de la máquina de anestesia al frente de la caja de imagen, en la parte exterior del orificio de entrada (Figura 2B). </li><li> Conecte un segundo tubo en el orificio de salida de la caja de imagen. Este tubo debe ser conectado al filtro de gas y luego al vacío. </li><li> Abra la tapa de la caja y abrir las puertas de la caja y colocar el animal, MIW lado frente a la parte inferior, y el deslizamiento de las puertas en la caja. </li><li> Mantenga la caja y ajustar las puertas abajo para que la base MIW se lleva a cabo y se inmovilizan entre ellos. La base de MIW debe estar en el mismo nivel que las puertas de imágenes caja, mientras que el cubreobjetos MIW debe ser sólo unos pocos milímetros por debajo de este nivel. Asegúrese de que el posicionamiento de la MIW entre la parte inferior las puertas corredizas se asegura de que el cubre (parte de vidrio de la MIW) quede plano, paralelo a la puerta inferior de la caja. Esto asegurará un enfoque apropiado. </li><li> Baje el objetivo de microscopio, para dejar espacio para la colocación de la caja enparte superior de la platina del microscopio. </li><li> Coloque la caja sobre la platina del microscopio, y ajustar el escenario para que el cubreobjetos MIW está por encima del objetivo. </li><li> Enfoque el objetivo y comenzar a imágenes. </li><li> Durante el uso de isoflurano, el animal debe ser supervisada por la inspección visual de la frecuencia respiratoria. Esto se puede hacer visualmente, o mediante el control de la frecuencia de los artefactos de respiración que aparecen durante la exploración de recogida (que puede interferir con la adquisición de datos). El sistema MouseOx la oximetría de pulso (Starr Ciencias de la Vida Corp) ha sido utilizado con éxito. De esta manera los datos pueden ser recogidos de manera continua sin encender las luces en la habitación para comprobar sobre el animal. Nota: Después de cada sesión de imágenes, recuperación de animales debe ser facilitado por envolver una almohadilla de calefacción pequeña gasa o Kimwipes y ponerlo en el animal en la jaula. Nota: Si un objetivo de inmersión se utiliza para la imagen a través de la MIW, el medio de la inmersión (glicerina, agua, aceite) se debe limpiar fuera de la ventana de imagen. El MIW deben ser inspeccionados para detectar posibles grietas u otros daños que pudiera haber ocurrido durante la exploración. Esto es crítico para la recogida de datos durante las sesiones de formación de imágenes múltiples. </li></ol> 6. Photoswitching y la imagen de Dendra2 células marcadas con El procedimiento se describe en el microscopio confocal Leica SP5, la potencia del láser en el plano focal, objetivos y opciones disponibles puede variar cuando se utilizan otros microscopios confocal o imágenes multifotónica establecido, y por lo tanto el protocolo descrito a continuación deben ser utilizadas como una guía para optimizar la prueba en su microscopio. <ol><li> Al observar el tumor a través del ocular (10x) con el filtro verde fluorescente, localizar los principales vasos sanguíneos que están visiblemente fluye y tumbado en el mismo plano focal. </li><li> La posición de uno de los buques en el centro del campo y pasar a la detección de PMT. </li><li> Establezcan sistemas de recogida de imágenes secuenciales para dos canales. Uno de los canales utiliza 488 nm láser de línea (10% de potencia), y recoge la dispersión de la matriz extracelular (480-495nm) y emisiones de la forma verde de Dendra2 (505-540nm). El segundo canal utiliza la línea del láser 543nm (90% de potencia) y recoge las emisiones de la forma roja de Dendra2 (555-600nm). Recoge imágenes en 3D photoswitching pre-. </li><li> Utilice la opción ROI escanear a PHOTOSWITCH una población elegida de las células con la línea de láser de 405 nm (30% de potencia, las exploraciones 20-40). Recoger emisiones de la forma roja de la proteína para controlar el cambio. </li><li> Utilizando la misma rutina secuencial como en 6.3, recoger después de cambiar las imágenes en 3D. </li><li> Si photoswitching más de una región en el tumor, se recomienda para tomar fotografías a través de los oculares con una cámara digital, en los canales verde y rojo (Figura 3A, B). Esto le ayudará en la orientación durante las sesiones de formación de imágenes posteriores. Nota: Además, los vasos sanguíneos puede ser temporalmente etiquetados con cola-vena de inyección de dextrano fluorescentes (Cascada Azul o Alexa Fluor 647, ambos 10kDa). Unas pocas horas después de la inyección, dextranos dejará los vasos sanguíneos y permanentemente la etiqueta de los macrófagos. </li></ol> Los resultados representativos: La figura 3C muestra una región rectangular photoswitched (rojo) orientados ortogonalmente con respecto a los vasos sanguíneos (no fluorescencia). No photoswitched células son de color verde, mientras que la dispersión de la matriz extracelular es de color púrpura. La imagen es una proyección de intensidad máxima de cuatro imágenes a lo largo del eje Z (20-50 m de profundidad).

<ol><li>Farina, K. L., Wyckoff, J. B., Rivera, J., Lee, H., Segall, J. E., Condeelis, J. S., Jones, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+motility+of+tumor+cells+visualized+in+living+intact+primary+tumors+using+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cell motility of tumor cells visualized in living intact primary tumors using green fluorescent protein.</a> Cancer Res. 58, 2528-2532 (1998).</li>
<li>Naumov, G. N., Wilson, S. M., MacDonald, I., Schmidt, E. E., Morris, V. L., Groom, A. C., Hoffman, R. M., Chambers, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+expression+of+green+fluorescent+protein%2C+coupled+with+high-resolution+in+vivo+videomicroscopy%2C+to+monitor+steps+in+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cellular expression of green fluorescent protein, coupled with high-resolution in vivo videomicroscopy, to monitor steps in tumor metastasis.</a> J Cell Sci. 112, 1835-1842 (1999).</li>
<li>Brown, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurement+of+gene+expression%2C+angiogenesis+and+physiological+function+in+tumors+using+multiphoton+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy.</a> Nature Med. 7, 864-868 (2001).</li>
<li>Wang, W., Wyckoff, J. B., Frohlich, V. C., Oleynikov, Y., Huttelmaier, S., Zavadil, J., Cermak, L., Bottinger, E. P., Singer, R. H., White, J. G., Segall, J. E., Condeelis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+behavior+in+metastatic+primary+mammary+tumors+correlated+with+gene+expression+patterns+revealed+by+molecular+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Single cell behavior in metastatic primary mammary tumors correlated with gene expression patterns revealed by molecular profiling.</a> Cancer Res. 62, 6278-6288 (2002).</li>
<li>Sidani, M., Wyckoff, J., Xue, C., Segall, J. E., Condeelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+microenvironment+of+mammary+tumors+using+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Probing the microenvironment of mammary tumors using multiphoton microscopy.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 11, 151-163 (2006).</li>
<li>Wyckoff, J. B., Wang, Y., Lin, E. Y., Li, J. F., Goswami, S., Stanley, E. R., Segall, J. E., Pollard, J. W., Condeelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+macrophage-assisted+tumor+cell+intravasation+in+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors.</a> Cancer Res. 67, 2649-2656 (2007).</li>
<li>Egeblad, M., Ewald, A. J., Askautrud, H. A., Truitt, M. L., Welm, B. E., Bainbridge, E., Peeters, G., Krummel, M. F., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+stromal+cell+dynamics+in+different+tumor+microenvironments+by+spinning+disk+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy.</a> Dis Model Mech. 1, 155-167 (2008).</li>
<li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., von Adrian, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-159 (2004).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+T+cell+trafficking+examined+in+vivo+with+intravital+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 2604-2609 (2003).</li>
<li>Kedrin, D., Gligorijevic, B., Wyckoff, J., Verkhusha, V. V., Condeelis, J., Segall, J. E., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+metastatic+behavior+through+a+mammary+imaging+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window.</a> Nat. Methods. 5, 1019-1021 (2008).</li>
<li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+intracellular+protein+movements+using+photoswitchable+fluorescent+proteins+PS-CFP2+and+Dendra2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2.</a> Nat. Protocols. 2, 2024-2032 (2007).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>PBS sin Ca, Mg</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>Medio DMEM (células MDA-MB-231)</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano (Aerrane)</td><td>Baxter International Inc.</td><td># NDC 10019-773-40</td><td></td></tr><tr><td>Ratón SCID</td><td>Instituto Nacional del Cáncer</td><td>N/D</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td>Pedido personalizado</td></tr><tr><td>Cubreobjetos circulares de 8 mm</td><td>Scientific, Inc.</td><td>8CIR-1-FIS</td><td></td></tr></tbody></table>

dendra2 photoswitching a través de la ventana de imágenes mamarias

Dendra2 Photoswitching through the Mammary Imaging Window

En la última década, la microscopía intravital de los tumores de mama en ratones y ratas en una sola célula de resolución<sup&gt; 4.1</sup&gt; Ha dado lugar a importantes conocimientos sobre los mecanismos de comportamiento metastásico como la migración, invasión y intravasation de las células tumorales<sup&gt; 5, 6</sup&gt;, La angiogénesis<sup&gt; 3</sup&gt; Y la respuesta de las células inmunes<sup&gt; 9.7</sup&gt;. Recientemente hemos informado de una técnica de imagen de mama carcinomas ortotópico a través de múltiples sesiones de imagen intravital en ratones vivos<sup&gt; 10</sup&gt;. Para ello, hemos desarrollado una ventana de imagen Mamaria (MIW) y los parámetros optimizados de imagen para Dendra2<sup&gt; 11</sup&gt; Photoswitching e imágenes<em&gt; In vivo</em&gt;. Aquí se describe el protocolo para la fabricación de MIW, la inserción de la MIW en la parte superior de un tumor y la imagen de las células tumorales Dendra2 marcado con una caja de encargo construido de imágenes. Este protocolo se puede utilizar para la imagen del comportamiento metastático de las células tumorales en diferentes microambientes en los tumores y permite obtener imágenes a largo plazo de los vasos sanguíneos, las células tumorales y las células huésped.

Photoswitching intravital y el seguimiento de Dendra2 marcado con las células tumorales a través de la ventana de imagen mamaria es una técnica que nos permite la imagen del comportamiento metastático de las células tumorales en los microambientes tumor elegido por un plazo de días.

Dendra2 Photoswitching a través de la ventana de imágenes mamarias

En la última década, la microscopía intravital de tumores mamarios en ratones y ratas con resolución de célula única1-4 ha permitido obtener conocimientos importantes sobre...

Este video ilustra un protocolo que comienza con la inyección de una línea celular tumoral que expresa una proteína fluorescente en la almohadilla de grasa mamaria del ratón. Se construye una cámara especializada para imágenes in vivo y luego se implanta quirúrgicamente en el animal, momento a partir del cual se pueden obtener datos de imagen. Hola, soy el Dr. Vic del laboratorio del Dr. John Conde y el Dr. Jeffrey Siegel del Centro de Biofotónica del Colegio de Medicina Albert Einstein.Hoy les mostraremos un procedimiento para el cambio fotónico intravital y la obtención de imágenes de células cancerosas marcadas con DRA dos mediante la ventana de imagenología de memoria. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la influencia del microambiente tumoral sobre la motilidad de las células tumorales. Así que comencemos, usando guantes de látex.Comience la fabricación de la ventana de imagen mamaria, o MIW, calentando un recipiente de cultivo de tejidos de cinco a 10 centímetros y creando una superficie curva al presionar un objeto duro redondeado, como una punta de Dremel de una pulgada, contra el recipiente. Corte el centro del recipiente usando una cuchilla de afeitar caliente. Ahora utilice una punta pequeña de Dremel en forma de cono para hacer un orificio de seis a siete milímetros de diámetro en el centro de la base plástica con forma de cúpula.Lije los bordes de la base de plástico hasta que queden completamente lisos utilizando la Dremel y luego alíjalos aún más. Alise la parte superior de la base de plástico para crear una superficie plana para el cubreobjetos de vidrio. El diámetro de la superficie plana alisada debe ser de nueve a diez milímetros.A continuación, pegue la cubierta circular de vidrio de ocho milímetros. Deslícela sobre la superficie plana utilizando pegamento instantáneo y déjela secar durante 15 minutos. Utilizando una aguja calentada de 26 G, haga ocho orificios para sutura perforando desde el exterior hacia el interior de la base; los orificios deben distribuirse uniformemente alrededor de la cubierta.Deslice de 0,5 a un milímetro de distancia del borde del cubreobjetos. Lave el MIW con agua desionizada y luego nuevamente con etanol al 70%. Utilice un hisopo para limpiar el vidrio hasta que quede completamente transparente.Utilice acetona para eliminar cualquier mancha turbia residual del vapor del pegamento. Finalmente, esterilice el MIW exponiéndolo a luz ultravioleta durante tres horas por cada lado. Antes de insertar el MIW, en la zona alrededor del cuarto pezón debería haberse desarrollado un pequeño tumor de cinco a siete milímetros de diámetro como resultado de la inyección de células tumorales.En la primera parte, verifique que el tumor no presente necrosis visible. Debe haber piel intacta con pelo en la zona circundante. Para comenzar, prepare un espacio estéril para la cirugía colocando un trozo de tela estéril dentro de una campana estéril.Coloque un trozo de gasa estéril en el centro y reúna los elementos que necesitará para la cirugía. Necesitará un par de tijeras de disección pequeñas y un par de tijeras de disección grandes con muelle, pinzas para microdisección y fórceps, y un portaagujas. Después de anestesiar al ratón con avertina al 2,5 %, use una afeitadora para animales pequeños para afeitar la zona por encima del tumor. Utilice una crema depilatoria para eliminar el resto del vello y limpie la piel.Utilizando hisopos con etanol. Transfiera el animal a la gasa estéril y aplique una pomada oftálmica en los ojos para evitar que se sequen y se infecten. Esterilice la piel con Betadine y luego límpiela con etanol al 70%.Con la tela quirúrgica anual y estéril, tire de la piel inmediatamente medial al pezón usando pinzas y realice una incisión de aproximadamente dos milímetros. Separe la almohadilla de grasa mamaria subyacente de la piel mediante disección, tijeras y pinzas. Una vez separada, la piel y el orificio se estiran hasta un tamaño que permita la inserción del MIW.Inserte el MIW de manera que haya piel sobre la base del MIW y sujételo con puntos de sutura. Utilice adhesivo tisular o cianoacrilato para rellenar los orificios de sutura y asegurar el MIW a la piel. Ahora se debe dejar al animal recuperarse durante los próximos tres o cuatro días antes de realizar la primera sesión de imágenes.Como preparación para la sesión de imagen, podemos describir la caja de imagen para aprovechar al máximo la caja de imagen. Primero, anestesie al animal con isoflurano y aplique una pomada oftálmica en los ojos. Conecte el escape de isoflurano del equipo de anestesia a la parte frontal de la caja de imagen.En el exterior del orificio de entrada. Conecte un segundo tubo al orificio de salida de la caja de imagen. Este tubo debe conectarse al filtro de gas y luego al vacío.A continuación, coloque al animal de manera que el MIW quede orientado hacia abajo. Sujete la caja y ajuste las puertas inferiores para que la base del MIW quede fija e inmovilizada entre ellas. La base del MIW debe estar al mismo nivel que las puertas de la caja de imagen. Aunque la laminilla del MIW debe estar apenas unos milímetros por debajo de este nivel, asegúrese de que la colocación del MIW entre las puertas deslizantes inferiores garantice que la laminilla quede plana y paralela a las puertas inferiores de la caja. Esto permitirá enfocar adecuadamente al bajar el objetivo del microscopio para dejar espacio y colocar la caja encima del platino del microscopio. Ajuste el platino de manera que la laminilla del MIW quede sobre el objetivo.Ahora podemos enfocar el objetivo e iniciar la obtención de imágenes. El procedimiento de obtención de imágenes descrito aquí es para el microscopio confocal Leica SP cinco y debe utilizarse como una guía para optimizar el experimento con el microscopio específico que se esté usando. Comience observando el tumor a través del ocular con un filtro fluorescente verde.Localice los vasos sanguíneos principales que estén visiblemente permeados y dispuestos planos en el mismo plano focal. Coloque uno de los vasos en el centro del campo y cambie a la detección de PMT. Configuraremos la adquisición secuencial de imágenes para dos canales.Un canal utiliza la línea láser de 488 nanómetros y recoge la dispersión de la matriz extracelular y la emisión de la forma verde de dendra dos. El segundo canal utiliza la línea láser de 543 nanómetros y recoge la emisión de la forma roja de dendra dos. Adquiera imágenes 3D antes del cambio fotoinducido.A continuación, utilice la opción de escaneo de la región de interés para activar fotoquímicamente una población seleccionada de células con la línea láser de 405 nanómetros. Recolecte la emisión de la forma roja de la proteína para monitorear el cambio. Ahora, recolecte imágenes tridimensionales posteriores al cambio mediante el mismo método utilizado para obtener las imágenes anteriores al cambio.Vale, entonces con el uso de un 20 % de potencia láser en el ultravioleta para activar o convertir esta zona en fotoconmutable, seleccione más de una región en el tumor e tome imágenes a través de los oculares utilizando una cámara digital en los canales verde y rojo. Esto ayudará a la orientación durante las sesiones posteriores de adquisición de imágenes. En esta imagen, se observa una región rectangular fotoconmutable, orientada ortogonalmente respecto al vaso sanguíneo, que no exhibe fluorescencia.Las células no fotoswitch aparecen verdes, mientras que la dispersión del matriz extracelular es púrpura. La imagen es una proyección de intensidad máxima de cuatro imágenes a lo largo del eje Z. Acabamos de mostrarle cómo realizar el fotoswitch y obtener imágenes de células marcadas con RA tool a través de la ventana de imagen de memoria.Utilizar este procedimiento es importante para comparar los comportamientos de las células tumorales en diferentes áreas del tumor durante varios días. Eso es todo. Gracias por verlo y buena suerte con su experimento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este video, realizamos imágenes intravitales de células cancerosas preinyectadas en un modelo de ratón a través de una ventana craneal implantada. Esta técnica de imagen de lapso de tiempo de alta resolución permite el estudio del comportamiento dinámico de las células cancerosas en el ratón vivo.

Imágenes intravitales basadas en ventanas craneales en un modelo de ratón: una técnica de imagen para estudiar el comportamiento de las células cancerosas preinyectadas en el cerebro de un modelo murino

Aquí, describimos una técnica para la administración localizada de reactivos a la glándula mamaria del conejo a través de una inyección intraductal. Además, describimos un protocolo para la visualización y la confirmación de la administración mediante ecografía de alta resolución de agentes de contraste.

Intraductal La entrega al conejo Glándula Mamaria

Aquí se presenta un enfoque para imágenes intravitales a largo plazo utilizando ventanas de silicona ópticamente transparentes que se pueden pegar directamente al tejido / órgano de interés y la piel. Estas ventanas son más baratas y versátiles que otras utilizadas actualmente en el campo, y la inserción quirúrgica causa inflamación y angustia limitadas a los animales.

Imágenes intravitales longitudinales a través de ventanas de silicona transparente

Este protocolo describe una nueva ventana de imágenes mamarias con una tapa reemplazable (R.MIW). La microscopía intravital después de la implantación del R.MIW permite obtener imágenes longitudinales y de varios días de la glándula mamaria sana y enferma con una resolución celular durante las diferentes etapas del desarrollo.

Microscopía intravital longitudinal con una ventana de imágenes mamarias con tapa reemplazable

El método de imágenes intravitales descrito aquí utiliza la segunda generación armónica de colágeno y la fluorescencia endógena del cofactor metabólico NAD(P)H para segmentar de forma no invasiva un microambiente tumoral no etiquetado en compartimentos tumorales, estromales y vasculares para un análisis en profundidad de imágenes intravitales 4D.

Un enfoque de segmentación sin etiquetas para imágenes intravitales del microambiente tumoral mamario

El presente protocolo describe una técnica sencilla para la obtención de imágenes intravitales de la glándula mamaria de ratón lactante mediante microscopía confocal y multifotónica de barrido láser.

Microscopía subcelular intravital de la glándula mamaria

Presentamos un protocolo para la implantación quirúrgica de una ventana óptica permanente estabilizada para la obtención de imágenes de resolución subcelular del páncreas murino, que permite realizar estudios seriados y longitudinales del páncreas sano y enfermo.

Ventana estabilizada para la obtención de imágenes intravitales del páncreas murino

Cortical dinámica del flujo de sangre se pueden estudiar en vivo por la proyección de imagen fluorescente tintes dextrano se inyecta en la vena de la cola de los roedores con dos fotones microscopía. Este vídeo muestra cómo la dinámica de la imagen del flujo sanguíneo en la corteza cerebral de los ratones a través de una cubierta de vidrio preparación ventana craneal.

Un método para el 2-Photon imágenes del flujo sanguíneo en la neocorteza a través de una ventana craneal

El microscopio de luz es una herramienta básica para el biólogo celular, que debe tener un conocimiento profundo de cómo funciona, cómo debe ser alineado para diferentes aplicaciones, y cómo se debe mantener como sea necesario para obtener la máxima capacidad de formación de imagen y resolución. Los componentes del microscopio se describen en detalle aquí.

Los componentes principales del microscopio de luz

Mamaria células tumorales que expresan luciferasa se implanta de forma subcutánea en ratones y se visualizan con imágenes ópticas para controlar el crecimiento tumoral y el desarrollo de forma no invasiva en un estudio longitudinal.

En vivo bioluminiscente de imágenes de tumores de mama mediante el espectro de IVIS

Aprende el protocolo de fotoconmutación intravital de células tumorales marcadas con Dendra2 en el tejido adiposo mamario de ratón. Esta técnica permite rastrear la dinámica celular y el comportamiento metastásico en microambientes tumorales específicos durante varios días.

Dendra2 Photoswitching a través de la ventana de imágenes mamarias

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