Name: Ratón cromafín aislamiento de células (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-01-05T00:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 30 s
Description: Aprende a aislar células cromafín de la médula suprarrenal mediante disección y digestión enzimática. Este protocolo permite obtener cultivos celulares puros para estudiar el acoplamiento excitación-secreción in vitro.

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Abreviaturas: ACC - adrenal de células cromafines, E. sol. - solución de la enzima, E. DMEM - Modificado enriquecido Dulbecco Medio Eagle <ol><li> Preparación <ol><li> Añadir la papaína a la cantidad deseada de E. sol. (40 unidades de papaína / 1 ml E. sol.).. </li><li> Activar la papaína con carbogen durante unos 15 minutos en hielo. Buffer oxigenar de Locke sobre el hielo también. </li></ol></li><li> Disección <ol><li> El uso del ratón 8-10 semanas. </li><li> Antes de la digestión eliminar oxigenada búfer de Locke y el lugar en el hielo. </li><li> Consulte el vídeo para el procedimiento de disección. </li><li> Una vez eliminado, glándulas lugar en oxigenada búfer de Locke. </li></ol></li><li> Preparación de la glándula <ol><li> Eliminar la grasa de la glándula. </li><li> Franja de la corteza de la glándula. </li></ol></li><li> La digestión enzimática <ol><li> Filtro estéril oxigenada papaína. </li><li> Haz cuatro grupos de la papaína oxigenada sobre una placa de Petri. <ol><li> 3 piscinas debe ser de 100uls. </li><li> Una de las piscinas debe ser de 400uls. </li></ol></li><li> Lave medullae a través de piscinas <ol><li> Primero a través de las 3 piscinas 100ul. </li><li> Luego, a través de la piscina 400ul </li><li> Pippette 300ul E. sol. y la médula piezas de piscina 400ul en el tubo de microcentrífuga. </li><li> Qrap parafina en el tubo de microcentrífuga y el lugar en el 37 ° C baño de agua durante 20 minutos. </li><li> Recuerde que debe seguir para oxigenar restantes sol. E. contienen papaína. </li><li> Después de 20 minutos más filtro estéril E. sol.. </li><li> Sustituir las viejas E. medullae baño sol. con el recién filtrada E. sol.. </li></ol></li></ol></li><li> Trituraciones <ol><li> Aspirar y desechar E. sol.. </li><li> Lave medullae en 1 ml E. DMEM. </li><li> Aspirar y desechar E. DMEM. </li><li> Añadir 300ul E. DMEM y triturar 20 veces con 1 ml punta. </li><li> Corte la punta 200ul con hoja de afeitar estéril. </li><li> Triturar 5-10x con la punta cortada 200ul. </li><li> Deseche E. DMEM piezas medullae baño. Medio contendrán residuos. </li><li> Añadir 300uls DMEM E. medullae piezas. </li><li> Triturar con la punta de 200ul 20x </li><li> Pippette E. DMEM al tubo de microcentrífuga withough piezas medullae. Medio contendrán ACC libre. </li><li> Añadir 300uls DMEM E. medullae piezas. </li><li> Triturar medullae con una aguja de calibre 23,5 jeringa 20x. </li><li> Combine E. DMEM tanto trituraciones. Medullae piezas no deben estar presentes y que ahora debe tener una apariencia featherlike. </li></ol></li><li> Enchapado <ol><li> Microfuga E. DMEM de los pasos trituración dos últimos durante 2,5 minutos a 3,7 g s. </li><li> Resuspender el pellet en 50uls-200 DMEM E., en función de posteriores experimentos. </li><li> Placa 10-30uls en un cubreobjetos. </li><li> Espere 15 minutos para que las células se adhieran. </li><li> Añadir 750uls de E. DMEM. </li></ol></li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

ratón cromafín aislamiento de células

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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