La combinación de injerto de nervio periférico y la matriz de modulación para la Reparación de médula espinal de ratas lesionados

La preparación para el injerto de un nervio periférico en un sitio de lesión de la médula espinal comienza con la predegeneración del NGP entre siete y diez días antes del injerto. Se realiza la sección del ramo tibial del nervio de una rata donante. Se efectúa una hemisección a nivel cervical cinco o C cinco mediante aspiración.

El PNG se extrae de la rata donante y se coloca adyacente a la pared rostral de la cavidad de la lesión, fijándolo mediante sutura de oro a la duramadre. Tres semanas después, se realiza una lesión en el cuadrante dorsal en C7 y se coloca espuma de gel saturada con C-H-A-B-C en la cavidad durante 15 minutos para digerir los proteoglicanos de la cicatriz glial. Dos días después, se inyecta microscópicamente C-H-A-B-C adyacente al sitio de la lesión y el extremo distal del PNG se coloca frente a la lesión del cuadrante dorsal.

Hola, soy John Hula. Soy director del Centro de Investigación sobre Lesiones de la Médula Espinal en la Facultad de Medicina de la Universidad Drexel. Soy la doctora Veronica Tom del laboratorio de Hula y soy Martha Mean.

Del laboratorio de hula. Hoy demostraremos un procedimiento de trasplante de un segmento de nervio periférico en la médula espinal lesionada de una rata adulta. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la regeneración axonal y la recuperación de la función tras una lesión de la médula espinal.

Vale, comencemos. Para prepararse para la cirugía microscópica, sane el área quirúrgica y esterilice todos los instrumentos quirúrgicos en autoclave. Prepare la barrera térmica y los pequeños trozos de espuma de gel de menos de dos milímetros cúbicos para lograr la hemostasia microquirúrgica.

Prepare hisopos de algodón, compresas de gasa e instrumentos quirúrgicos. Coloque la rata anestesiada sobre la mesa de preparación tras confirmar mediante un pellizco en el dedo del pie que el animal está completamente anestesiado. Afeite una amplia zona de pelo del campo quirúrgico previsto y lave el sitio quirúrgico siguiendo la técnica de aseo aséptico descrita en el protocolo de texto adjunto.

A continuación, coloque la rata sobre la barrera térmica, cubra su nariz y boca con el cono de inhalación y reduzca el isoflurano al 3 % y el caudal a 0,2 litros por minuto. Administre la dosis adecuada del antibiótico ampicilina mediante inyección subcutánea y del analgésico buprenorfina mediante inyección intramuscular. El nervio periférico o PN se secciona de siete a diez días antes de su extracción para favorecer la degeneración, lo que proporciona un entorno más adecuado para el crecimiento axonal que una preparación de nervio fresco.

Para comenzar la sección del pn, coloque el animal de lado. Cambie a guantes estériles y coloque un campo quirúrgico estéril alrededor del sitio quirúrgico. Realice una incisión rectilínea desde la cabeza del fémur hasta la rodilla, manteniéndose paralelo y aproximadamente a tres milímetros del fémur, cortando a través de los músculos biceps femorales superficiales a lo largo de la misma línea de la incisión cutánea para exponer el músculo vasto lateral subyacente.

Una vez expuesto el músculo vasto lateral, use tijeras para hacer un pequeño corte en él cerca de la rodilla y extiéndalo hacia la cabeza del fémur. Separe suavemente con separadores el vasto lateral hasta visualizar los nervios tibial y perineal conjuntos del nervio ciático, que corren paralelos al fémur. A continuación, siga estos ramos nerviosos hacia la cabeza del fémur hasta identificar el tronco principal del nervio ciático.

Justo debajo de la bifurcación del nervio ciático, use pinzas finas para separar cuidadosamente el tejido conectivo o epineurio que rodea el ramo del nervio tibial. Este es el ramo más grande. Una vez aislado el ramo del nervio tibial, pase una ligadura de seda de seis ceros alrededor de él y apriétela.

Utilice tijeras microquirúrgicas para seccionar el nervio justo hasta la ligadura. Pase la sutura a través del músculo vasto lateral y anúde en un nudo. Esto proporcionará una guía para localizar fácilmente el extremo seccionado del nervio tibial.

Cuando se extrae el nervio. Posteriormente, cierre el músculo vasto lateral con seis suturas de seda de calibre 0. Después de eso, cierre el músculo de los PMO del bíceps con seis suturas de seda de calibre 0.

Finalmente, cierre la piel con clips de herida Michelle. Apague el flujo de isoflurano y retire el cono de inhalación nasal. Coloque el animal en una jaula de contención sobre una barrera térmica.

Devuelva el animal a su jaula de alojamiento. Una vez que esté alerta y activo, siete a 10 días después, el segmento de PN estará listo para ser extraído. Para iniciar el trasplante, coloque al animal anestesiado sobre la barrera térmica.

Tras confirmar que el animal está completamente anestesiado, retire los clips de la herida y separe la incisión en la piel. Es posible que no sea necesario afeitar la zona previamente, ya que la piel debería separarse fácilmente, evitando así la contaminación. Al eliminar la necesidad de cortar a través del pelo, corte la sutura del músculo superficial para exponer el vasto lateral y corte a través de la sutura en este músculo.

Siga la línea de sutura hasta el extremo cortado del nervio tibial y retire la sutura del nervio. Utilice pinzas finas para disecar el epineuro de un segmento de 15 milímetros de longitud del nervio tibial y corte a través de este extremo distal. Retire el segmento nervioso y sumérjalo en solución salina equilibrada de Hank estéril.

Ahora estamos listos para el siguiente paso, que consiste en inducir una lesión de la médula espinal para el trasplante del PN, el cual puede ser autólogo o heterólogo. Coloque la rata anestesiada sobre la barrera térmica y administre antibióticos y analgésicos según se describió en la sección anterior para inducir una lesión espinal de sección HEMI. Primero, localice la muesca occipital y el proceso vertebral dorsal prominente T dos.

Realice una incisión a lo largo completo entre estos puntos de referencia externos. Corte a través de la línea media del músculo trapecio superficial y separe los músculos cervicales ardis subyacentes. Inserte un separador para mantener los músculos separados.

Los músculos supraespinales profundos deben seccionarse desde las apófisis vertebrales dorsales de C cuatro, C cinco y C seis. Utilizando R jurados, realice una laminectomía parcial de C cinco para exponer todo el lado derecho y la porción medial del lado izquierdo de la médula espinal. Utilice la vena dorsal prominente como punto de referencia para la línea media de la médula espinal.

A continuación, utilice una hoja de bisturí microquirúrgica para perforar la duramadre y extender la incisión sobre la médula espinal del nivel C cinco. Realice una pequeña incisión en la aracnoides y la piamadre subyacentes con una microcánula de vidrio estirada. Comience a aspirar el lado dorsal derecho de la médula espinal aplicando presión suave y utilizando fórceps microquirúrgicos para separar el tejido y facilitar su extracción.

Continúe a través de las porciones intermedias y ventrales de la médula espinal para crear una cavidad de dos milímetros de longitud que sea completa desde dorsal hasta ventral y desde la línea media hasta las meninges laterales. Coloque espuma de gel empapada en solución salina en la cavidad de la lesión de la sección HEMI. Para lograr la hemostasia, retire el segmento previamente obtenido de nervio periférico de la solución de Hank.

Sienta suavemente la epineuro desde los tres milímetros proximales del segmento nervioso y oponga este extremo a la pared rostral de la cavidad de la lesión en la sección HEMI. Fije el segmento con suturas de 10 oh a través del epineuro hasta la duramadre. A continuación, cierre con sutura la duramadre sobre el extremo implantado del injerto, intercalando el injerto entre dos piezas de membrana elástica cel.

Coloque el injerto junto a las apófisis vertebrales C seis C siete y T uno. No coloque el extremo distal del nervio en oposición a la médula espinal ni al tejido muscular. Cierre los músculos en capas con suturas 4-0 y cierre la incisión cutánea con clips quirúrgicos.

Finalmente, coloque el animal en una jaula de contención sobre una barrera térmica y devuélvalo a su jaula de origen. Una vez que esté alerta y activo, los axones regenerados que llegan al extremo distal del injerto de NP a menudo no logran extenderse nuevamente hacia la médula espinal. Por ello, utilizamos microinyecciones de condroitinasa ACE para degradar el tejido cicatricial que rodea el área de la lesión.

Este procedimiento se lleva a cabo 21 días después del trasplante de PN para comenzar, confirmando que el animal esté completamente anestesiado. Luego retire las pinzas de la herida y administre antibióticos y analgésicos como se ha mostrado previamente. Corte las suturas superficiales para exponer la membrana elástica que rodea el injerto nervioso utilizando pinzas finas y tijeras de resorte.

Liberar cuidadosamente la longitud del nervio de las membranas elásticas cel. Reflejar el nervio desde el campo quirúrgico. Realizar una laminectomía parcial en el lado derecho del proceso vertebral C siete.

Perfore las meninges con una hoja de bisturí microscópico y, mediante aspiración, prepare una cavidad de lesión cuadrante dorsal de un milímetro cúbico en la médula espinal C7. Coloque espuma de gel impregnada con solución salina en la cavidad de la lesión para lograr la hemostasia. Posteriormente, reemplace la espuma de gel con otra impregnada con condroitina nace.

Trate el sitio de la lesión durante 15 minutos, proporcionando espuma de gel recién empapada en condroitina cada cinco minutos. Cubra la longitud externa del injerto nervioso con membrana escolar. Cierre los músculos superficiales con cuatro suturas de punto y la incisión cutánea con clips para heridas.

Coloque el animal en una jaula de contención sobre una barrera térmica y devuélvalo a su jaula de origen una vez que esté alerta y activo. Dos días después, 23 días tras el trasplante de PN, se realiza nuevamente una cirugía en el animal para microinyectar ácido condroitínico en la médula espinal. Como antes, se retiran los clips de la herida del animal anestesiado y se administran antibióticos y analgésicos.

Corte las suturas superficiales para exponer la membrana elástica que rodea el injerto nervioso. Exponga el sitio del injerto C siete sin alterar el injerto. Luego, utilice una jeringa Hamilton con una cánula de vidrio estirada para inyectar microscópicamente un microlitro de condroitinasa ABC en el lado derecho de la médula espinal, aproximadamente un milímetro distal a la unión del injerto con la médula espinal.

Retire suavemente la EUR de los dos milímetros distales del segmento nervioso y coloque este extremo frente a la cavidad de la lesión en C siete. Sujete el segmento con suturas de 10 oh a través del epineuro hasta la duramadre. Cierre los músculos superficiales con suturas de cuatro oh y la incisión cutánea con grapas quirúrgicas.

Coloque el animal en una jaula de contención sobre una barrera térmica y devuélvalo a su jaula de origen una vez que esté alerta y activo. Cuando este procedimiento se optimiza, el segmento del nervio periférico se integrará estrechamente con la médula espinal del huésped para visualizar axones espinales que regeneran dentro del injerto. Rellenamos por difusión el injerto con dextrina aminada biotinilada o BDA ascendente y descendente.

Los axones espinales generalmente entrarán en el injerto, crecerán en línea relativamente recta paralela a la longitud del injerto y se extenderán hasta el extremo distal del injerto a una velocidad de aproximadamente un milímetro por día. Los axones del nervio periférico penetrarán en la médula espinal adyacente. Si se ha utilizado NACE de condroitina para eliminar los proteoglicanos inhibidores del tejido cicatricial circundante al alcanzar el extremo distal, muy pocos axones del nervio periférico se extienden hacia el tejido hospedador después del tratamiento cuando se administra el vehículo.

Sin embargo, si la interfaz distal se trató con condroitina, emerge un número significativamente mayor de axones del injerto para volver a inervar la médula espinal. Como se muestra aquí en esta sección representativa de entre 15 y 20 secciones por animal donde se observa el crecimiento axonal, este gráfico de barras demuestra un aumento significativo en el crecimiento axonal tras el tratamiento con conjoin nace A BC. La detección inmunoquímica de marcadores sinápticos en neuronas de la médula espinal en respuesta a la estimulación eléctrica de los axones dentro del injerto puede utilizarse para evaluar la conectividad funcional entre el injerto trasplantado y la médula espinal del huésped.

Esta región de la médula espinal que contiene el sitio de aposición distal fue teñida inmunocitoquímicamente tanto para la dextrina aminada biotinilada en verde como para el marcador sináptico sinapsina en rojo; las flechas indican áreas en las que hubo colocalización de marcadores, lo que indica que algunas fibras que regeneraron fuera del injerto formaron contactos sinápticos funcionales. La conectividad funcional entre las neuronas del injerto y de la médula espinal también se demostró mediante el ensayo de expresión de CFOs. Tras la estimulación sináptica de neuronas del hospedador más allá de la interfase distal, este marcador de activación transsináptica puede identificarse en numerosas neuronas positivas para CFOs en el tejido ipsilateral al sitio del injerto, y en mayor aumento, se pueden observar muy pocas neuronas positivas para CFOs en el tejido contralateral al injerto.

Acabamos de mostrarle cómo preparar un sitio de lesión de la médula espinal para el trasplante de un injerto de nervio periférico con el fin de promover la regeneración tras una lesión medular. Al realizar este procedimiento, es importante recordar contar con una longitud suficiente del nervio antes del injerto y lograr una aproximación estrecha entre el injerto y el sitio de lesión de la médula espinal. Eso es todo.

Gracias por ver el video y buena suerte con sus experimentos.