La combinación de injerto de nervio periférico y la matriz de modulación para la Reparación de médula espinal de ratas lesionados

La lesión traumática de la médula espinal interrumpe la comunicación con el cerebro. Para restaurar la pérdida de conectividad que utilizan un injerto de nervio periférico para proporcionar un sustrato para la regeneración de las fibras en combinación con factores neurotróficos y las enzimas de la matriz de modulación, para eliminar las moléculas inhibidoras para promover el crecimiento de larga distancia.

La preparación para el injerto de un nervio periférico en el sitio de una lesión de la médula espinal comienza con la predegeneración del PNG de siete a 10 días antes del injerto. Se secciona la rama del nervio tibial de una rata donante. Una hemisección cervical de nivel cinco o C cinco se realiza por aspiración.

El PNG se extrae de la rata donante y se opone a la pared rostral de la cavidad de la lesión y se asegura suturando el aurum a la duramadre. Tres semanas más tarde, se realiza una lesión en el cuadrante dorsal en C, se coloca en la cavidad siete geles de espuma saturada con C-H-A-B-C durante 15 minutos para digerir los proteoglicanos de la cicatriz glial. Dos días después, se microinyecta C-H-A-B-C adyacente al sitio de la lesión y el extremo distal de la PNG se opone a la lesión del cuadrante dorsal.

Hola, soy John Hula. Soy el director del Centro de Investigación de Lesiones de la Médula Espinal en la Facultad de Medicina de la Universidad de Drexel. Soy la Dra. Veronica Tom del laboratorio de hula y soy Martha Mean.

Del laboratorio de hula. Hoy vamos a demostrar un procedimiento de trasplante de un segmento de nervio periférico en la médula espinal lesionada de una rata adulta. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la regeneración de axones y la recuperación de la función después de una lesión de la médula espinal.

Bien, comencemos. Para prepararse para la cirugía microscópica, desinfecte la estación quirúrgica y autoclave todos los instrumentos quirúrgicos. Prepare la barrera térmica y los pequeños trozos cúbicos de menos de dos milímetros de espuma de gel para la micro hemostasia.

Coloque hisopos de algodón, gasas e instrumentos quirúrgicos. Coloque la rata anestesiada en la mesa de preparación después de confirmar con un pellizco en el dedo del pie que el animal está completamente anestesiado. Afeitar una amplia área de pelaje del sitio de la cirugía de lavado de campo quirúrgico previsto siguiendo la técnica de exfoliación aséptica descrita en el protocolo de texto adjunto.

A continuación, coloque la rata en la barrera térmica, cubra su nariz y boca con el cono de inhalación y reduzca el isof de flúor al 3% y el caudal a 0,2 litros por minuto. Administrar la dosis adecuada de antibiótico ampicilina por inyección subcutánea y analgésico buprenorfina por inyección intramuscular. El nervio periférico o PN se secciona de siete a 10 días antes de su extirpación para promover la degeneración, lo que proporciona un entorno más adecuado para el crecimiento axonal que la preparación de un nervio fresco.

Para comenzar la transección del pn, acueste al animal de lado. Cambie a guantes estériles y coloque un paño quirúrgico estéril alrededor del sitio de la cirugía. Hacer una incisión en línea recta desde la cabeza del fémur hasta la rodilla, manteniéndose paralela y aproximadamente a tres milímetros del fémur, cortando a través de los músculos superficiales del bíceps a lo largo de la misma línea que la incisión en la piel para exponer el músculo vasto lateral subyacente.

Una vez que el músculo vasto lateral esté expuesto, use unas tijeras para hacer un pequeño corte cerca de la rodilla y extiéndalo hacia la cabeza del fémur. Separe suavemente con retractores los vastos laterales hasta que se visualicen las ramas unidas de los nervios tibial y perineal del nervio sático corriendo paralelas al fémur. A continuación, trace estas ramas nerviosas hacia la cabeza del fémur hasta que se identifique el tronco principal del nervio ciático.

Justo debajo de la bifurcación del nervio sático, use pinzas finas para separar cuidadosamente el tejido conectivo o epineurio que rodea la rama del nervio tibial. Esta es la rama más grande. Una vez que la rama del nervio tibial esté aislada, deslice una ligadura de seda de seis pulgadas alrededor de ella y apriétela.

Use micro tijeras para atravesar el nervio en carne viva hasta la ligadura. Pase la línea de sutura a través del músculo vasto lateral y átelo con un nudo. Esto proporcionará una línea para facilitar la localización del extremo cortado del nervio tibial.

Cuando se extrae el nervio. Más tarde, cierre el vasto músculo lateral con seis suturas de seda. Después de eso, cierre el músculo PMO del bíceps con seis suturas de seda.

Por último, cierra la piel con pinzas para heridas Michelle. Cierre el flujo de isof flúor y retire el cono nasal de inhalación. Coloque al animal en una jaula de retención sobre una barrera térmica.

Regrese al animal a su jaula de origen. Una vez que está alerta y activo, de siete a 10 días después, el segmento PN está listo para ser cosechado. Para que comience el trasplante, coloque al animal anestesiado en la barrera térmica.

Después de confirmar que el animal está completamente anestesiado, retire las pinzas para heridas y separe la incisión en la piel. Es posible que no sea necesario afeitar el área primero, ya que la piel debe separarse fácilmente para evitar la contaminación. Al eliminar la necesidad de cortar el pelaje, corte a través de la sutura del músculo superficial para exponer los vastos laterales y corte a través de la sutura en este músculo.

Traza la línea de sutura hasta el extremo cortado del nervio tibial y retira la sutura del nervio. Use pinzas finas para diseccionar el epineuro de una longitud de 15 milímetros del nervio tibial y corte a través de este extremo distal. Retire el segmento nervioso y sumérjalo en una solución salina equilibrada estéril de la madeja.

Ahora estamos listos para el siguiente paso, que es inducir una lesión medular para el trasplante de la NP, el trasplante puede ser autólogo o heterólogo. Colocar la rata anestesiada sobre la barrera térmica y administrar antibióticos y analgésicos como se describe en la sección anterior para inducir una lesión medular por hemio. En primer lugar, localice la escotadura occipital y la prominente apófisis vertebral dorsal T dos.

Haga una incisión a lo largo de toda la longitud entre estos puntos de referencia externos. Corta a través de la línea media del músculo trapecio superficial y separa los músculos ardis cervicales subyacentes. Inserte un separador para mantener los músculos separados.

Los músculos supraespinales profundos deben cortarse de las apófisis vertebrales dorsales C, cuatro, C, cinco y C-seis. Usando R, los jurados realizan una laminectomía parcial de C cinco para exponer todo el lado derecho y la porción medial del lado izquierdo de la médula espinal. Use la vena dorsal prominente como punto de referencia para la línea media de la médula espinal.

A continuación, utilice una hoja de microbisturí para perforar la duramadre y extienda la incisión sobre la médula espinal C cinco. Realice una pequeña incisión en la subaracnoidea subyacente y en la P madre con una microcánula de vidrio extraído. Comience a aspirar el lado dorsal derecho de la médula espinal utilizando una presión suave y micro pinzas para separar el tejido y facilitar su extracción.

Continúe a través de las porciones intermedia y ventral de la médula espinal para crear una cavidad de dos milímetros de largo que se completa desde la dorsal hasta la ventral y desde la línea media hasta las meninges laterales. Coloque espuma de gel empapada en solución salina en la cavidad de la lesión de la sección HEMI. Para lograr la hemostasia, extraiga el segmento de nervio periférico previamente extraído de la solución de Hank.

Sentir suavemente el epi desde los tres milímetros proximales del segmento nervioso y oponer este extremo a la pared rostral de la cavidad de la lesión de la sección HEMI. Asegure el segmento con suturas de 10 oh a través del epi uum hasta la duramadre. A continuación, sutura la duramadre cerrada sobre el extremo implantado del injerto y coloca el injerto entre dos piezas de membrana celesteelástica.

Coloque el injerto junto a las apófisis vertebrales C, seis, C, siete y T uno. No oponga el extremo nervioso distal a la médula espinal o al tejido muscular. Cierre los músculos en capas con cuatro suturas y cierre la incisión de la piel con clips para heridas.

Finalmente, coloque al animal en una jaula de retención sobre una barrera térmica y devuélvalo a su jaula de origen. Una vez que está alerta y activo, los axones regenerados que alcanzan el extremo distal del injerto de NP a menudo no logran extenderse hacia la médula espinal. Por lo tanto, utilizamos micro inyecciones de condroitina ACE para degradar el tejido cicatricial que rodea el área de la lesión.

Este procedimiento se realiza 21 días después del trasplante de NP para comenzar, confirmar que el animal está completamente anestesiado. A continuación, retire las pinzas para heridas y administre antibióticos y analgésicos como se ha indicado anteriormente. Corte a través de las suturas superficiales para exponer la membrana elástica que rodea el injerto nervioso con pinzas finas y tijeras de resorte.

Libere con cuidado la longitud del nervio de las membranas elásticas del cel. Reflejar el nervio del campo quirúrgico. Realizar una laminectomía parcial en el lado derecho de la apófisis vertebral C siete.

Perforar las meninges con una hoja de microbisturí y, por aspiración, preparar una cavidad de lesión del cuadrante dorsal cúbico de un milímetro en la médula espinal C siete. Coloque espuma de gel empapada en solución salina en la cavidad de la lesión para lograr la hemostasia. Después de eso, reemplace la espuma de gel por una empapada con condroitina nace.

Un BC. Trate el sitio de la lesión durante 15 minutos, proporcionando condroitina fresca en una espuma de gel empapada cada cinco minutos. Cubrir la longitud externa del injerto nervioso con la membrana escolástica. Cierre los músculos superficiales con cuatro suturas y la incisión cutánea con clips para heridas.

Coloque al animal en una jaula de retención sobre una barrera térmica y devuélvalo a su jaula de origen una vez que esté alerta y activo. Dos días después, 23 días después del trasplante de NP, se vuelve a realizar la cirugía en el animal para microinyectar condroitina NA en la médula espinal. Al igual que antes, se retiran las pinzas de la herida del animal anestesiado y se administran antibióticos y analgésicos.

Corte a través de las suturas superficiales para exponer la membrana elástica que rodea el injerto nervioso. Exponga el sitio del injerto C siete sin alterar el injerto. A continuación, utilice una jeringa Hamilton con una cánula de vidrio extraído para microinyectar un microlitro de condroitina ace A BC en el lado derecho de la médula espinal, aproximadamente un milímetro distal a la aposición del injerto en la médula espinal.

Retire suavemente el EUR de los dos milímetros distales del segmento nervioso y oponga este extremo a la cavidad de la lesión C seven. Asegure el segmento con suturas de 10 oh a través del epi nearium hasta la duramadre. Cierre los músculos superficiales con cuatro suturas de oh, y la incisión de la piel con clips para heridas.

Coloque al animal en una jaula de retención sobre una barrera térmica y devuélvalo a su jaula de origen una vez que esté alerta y activo. Cuando se optimiza este procedimiento, el segmento del nervio periférico se integrará estrechamente con la médula espinal del huésped para visualizar los axones espinales que se regeneran en el injerto. Rellenamos el injerto con dextrina biotinilada amina o BDA ascendente y descendente.

Los axones espinales generalmente ingresarán al injerto, crecerán en una línea relativamente recta paralela a la longitud del injerto y se extenderán hasta el extremo distal del injerto a una velocidad de aproximadamente un milímetro por día. Los axones de los nervios periféricos penetrarán en la médula espinal adyacente. Si la condroitina NACE se ha utilizado para eliminar los proteoglicanos inhibidores del tejido cicatricial circundante al llegar al extremo distal, muy pocos axones de los nervios periféricos se extienden al tejido del huésped después del tratamiento cuando se tratan con vehículo.

Sin embargo, si la interfase distal se trató con condroitina, un número significativamente mayor de axones emergen del injerto para reinnovar la médula espinal. Como se muestra aquí en esta sección de representación de 15 a 20 secciones por animal donde se observa el crecimiento axonal, este gráfico de barras demuestra un aumento significativo en el crecimiento axonal después del tratamiento con BC en combinación con A Nace. La detección inmunoquímica de marcadores sinápticos en las neuronas de la médula espinal en respuesta a la estimulación eléctrica de los axones dentro del injerto se puede utilizar para evaluar la conectividad funcional entre el injerto trasplantado y la médula espinal del huésped.

Esta región de la médula espinal que contiene el sitio de aposición distal fue inmunocitoquímicamente teñida tanto para la dextrina amina biotinilada en verde como para el marcador sináptico sinapsina en rojo. Las puntas de flecha indican áreas en las que hubo colocalización de marcadores, lo que indica que algunas fibras que se regeneraron a partir del injerto formaron contactos sinápticos funcionales. La conectividad funcional entre las neuronas del injerto y de la médula espinal también se demostró mediante un ensayo para la expresión de CFOs. Después de la estimulación sináptica de las neuronas huésped más allá de la interfaz distal, este marcador de activación transsináptica puede ser identificado por muchas neuronas CFO positivas en el tejido ipsilateral al sitio del injerto, y en un aumento mayor, se pueden observar muy pocas neuronas positivas de CFO en el tejido contralateral al injerto.

Acabamos de mostrarle cómo preparar el sitio de una lesión medular en preparación para el trasplante de un injerto de nervio periférico para promover la regeneración después de una lesión medular. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que debe tener suficiente longitud de nervio antes del injerto y tener una aposición cercana del injerto al sitio de la lesión de la médula espinal. Así que eso es todo.

Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.