Un In Vitro Prueba de irritación (SIT) con la epidermis humana reconstruida epidérmico (CHE) Modelo

Epiderm es un modelo reconstruido in vitro del epidermis humano, derivado de células humanas normales, desarrollado por la Corporación Matt Tech. El protocolo validado EC VM del ensayo de irritación cutánea con Epiderm sustituye las pruebas tradicionales basadas en animales para productos como cosméticos, materias primas y agentes industriales que entrarán en contacto con la piel humana. Este ensayo comienza en el día cero, cuando el kit de irritación cutánea y el tejido Epiderm llegan al laboratorio y posteriormente se preincuban en un medio de ensayo tras una incubación nocturna.

El día uno, la superficie atípica del tejido epidérmico se expone durante una hora a un compuesto irritante putativo y luego el irritante se elimina mediante un paso de lavado el día dos. Tras una incubación de 24 horas, el inserto de cultivo se coloca en medio fresco y el medio antiguo puede utilizarse para el análisis de citocinas y quimioquinas liberadas. El tejido se trata con un compuesto conocido como MTT, que es convertido por la reductasa mitocondrial en una sal de formazán de color púrpura oscuro.

Proporciona un indicador de viabilidad celular. La ausencia de color púrpura oscuro en la muestra indica una viabilidad reducida. Cuando la lectura colorimétrica de un compuesto de prueba es inferior al 50 % de los controles negativos, el compuesto de prueba puede clasificarse como un irritante.

Hola, soy Helena Kava de Matt Corporation. Hoy les mostraré el procedimiento para la prueba de irritación cutánea in vitro utilizando el modelo de epidermis humana reconstruida epiderm. Este procedimiento, según los requisitos regulatorios, puede utilizarse como reemplazo total o parcial de la prueba in vivo de irritación cutánea rápida.

Este nuevo procedimiento in vitro puede utilizarse para la identificación de peligros y el etiquetado de productos químicos y materiales cosméticos crudos. Así que comencemos. Epiderm se deriva de cultivos de queratinocitos epidérmicos humanos para formar un modelo tridimensional, multicapa y altamente diferenciado de la epidermis humana.

Los tejidos son mitótica y metabólicamente activos, imitan estrechamente a sus contrapartes in vivo tanto estructural como bioquímicamente, y lo hacen con una reproducibilidad garantizada, como el epitelio humano. Epiderm consta de capas basales, espinosas y granulosas organizadas y una capa córnea estratificada. Esta última contiene capas lipídicas laminares intercelulares de Miller dispuestas en patrones análogos a los encontrados in vivo.

Estos tejidos se cultivan en medio libre de suero. Cada tejido crece en un inserto individual para cultivo celular. Otras configuraciones están disponibles, incluyendo un formato de alto rendimiento de 96 pocillos.

La producción del tejido tarda aproximadamente tres semanas en completarse. En un punto específico de este proceso, el tejido se eleva hasta la interfase aire-líquido y se elimina todo el líquido de la superficie APIC del tejido. Los tejidos son alimentados únicamente a través de la superficie basolateral, que permanece en contacto con el medio de cultivo exclusivo de Mat Tek. Un kit Epiderm típico contiene 24 tejidos, cada uno de nueve milímetros de diámetro, en su propio inserto para cultivo de tejidos, además del medio de ensayo suficiente para realizar esta prueba de irritación cutánea.

Los 24 insertos están firmemente colocados sobre gel de AGA rosa infundido con medio, con un tejido en cada pocillo de una placa estándar de 24 pocillos. El envío se realiza mediante mensajería nocturna a una temperatura de tres a cuatro grados centígrados antes de comenzar las pruebas con productos químicos. Utilizando el sistema de prueba EPIDERM, prepare y esterilice todos los instrumentos y herramientas utilizados en el ensayo según se describe en el protocolo escrito. Una parte de los materiales, como los bastoncillos de algodón, debe venir en envases estériles o ser autoclavada.

Se debe usar etanol al 70 % para esterilizar instrumentos como pinzas y se debe usar irradiación UV o gamma para esterilizar los frascos de lavado. Dos soluciones críticas utilizadas en el ensayo deben prepararse previamente: DPBS y una solución de SDS al 5 %. En agua destilada, se utilizarán aproximadamente dos litros de DPBS estéril con pH siete en el ensayo, utilizando un kit que contiene 24 tejidos epiderm.

El DPBS estéril sirve como control negativo así como solución de lavado. Se debe preparar y utilizar SDS al 5 % como control positivo. El ensayo de irritación cutánea comienza tras la recepción del kit EPIDERM EPI 200 SIT.

Asegúrese de verificar la integridad de todos los componentes del kit y comuníquese inmediatamente con la corporación Mat Tech si tiene alguna inquietud; si todo está presente, continúe con el siguiente paso. Para comenzar la prueba, deje que el medio de ensayo suministrado con el kit alcance la temperatura ambiente. No precaliente dentro de la cabina de flujo laminar.

Prepare una placa estéril de seis pocillos por cada tres insertos de tejido epidérmico y pipetee 0,9 mililitros del medio de ensayo en cada pocillo bajo condiciones estériles. Abra la bolsa de plástico que contiene la placa de 24 pocillos con los tejidos epidérmicos bajo flujo de aire estéril. Retire la gasa estéril y utilice fórceps estériles para extraer cuidadosamente cada inserto que contenga el tejido epidérmico.

Elimine cualquier resto de aros que se adhiera a los lados externos del inserto mediante un suave secado sobre gasa estéril o papel de filtro. Luego, coloque los tejidos en una placa estéril de 24 pocillos vacía dentro de los siguientes cinco minutos. Inspeccione visualmente los insertos.

Registre cualquier defecto del tejido y exceso de humedad en la superficie. No utilice tejidos defectuosos ni tejidos completamente cubiertos con líquido.

Insertos de tejido óptimos. Deben tener una superficie seca y estar libres de desprendimientos, partes irregulares o exceso de líquido en la superficie. A continuación, utilizando un hisopo estéril de algodón, seque cuidadosamente la superficie de los tejidos.

Trate de no tocar directamente el tejido. Los efectos capilares son suficientes para eliminar la humedad de la superficie después de secarla. Transfiera tres tejidos a la fila superior de cada seis.

Placa de pocillos precargada con 0,9 mililitros de medio de ensayo. Libere cualquier burbuja de aire atrapada debajo de los insertos. A continuación, coloque las placas de seis pocillos que contienen los insertos en el incubador durante una hora.

Preincubación a 37 grados Celsius. Al finalizar el primer período de preincubación, transferir los insertos de los pozos superiores a los pozos inferiores de la placa de seis pozos. Volver a colocar las placas en el incubador para una preincubación nocturna.

Coloque el resto del medio de ensayo en el refrigerador. Tras la preincubación nocturna, se pueden aplicar los productos químicos de prueba a los insertos de tejido epidérmico. Antes de comenzar el ensayo de exposición a productos químicos, coloque todos los dispositivos, soluciones y productos químicos de prueba necesarios a temperatura ambiente.

En la cabina de flujo laminar, limpie con etanol al 70 % todos los frascos de materiales no estériles antes de colocarlos dentro de la cabina. El control negativo DPBS estéril, el control positivo con SDS al 5 % y el agua destilada deben colocarse dentro de la cabina a temperatura ambiente. Se debe apartar un frasco grande para residuos.

Prepare una placa de seis pocillos para cada producto químico, llenando solo la fila superior con 0,9 mililitros de medio de ensayo por pocillo. Etiquete cada placa con el número de tejido y el nombre del producto químico.

Aproximadamente cinco minutos antes de la exposición prevista a los productos químicos, retire las placas de seis pocillos que contienen los tejidos acondicionados del incubador. Luego, evalúe visualmente la superficie de los tejidos.

Elimine cualquier humedad utilizando hisopos de algodón estériles y no presione sobre la superficie del tejido. Finalmente, etiquete las tapas de la placa de seis pocillos con los códigos o nombres de los materiales de prueba. No pruebe más de seis productos químicos, incluyendo controles negativos y positivos, cada uno en triplicado, en un solo ensayo.

Utilice una aplicación química y un intervalo de lavado de un minuto para manipular sustancias de prueba conocidas. Siga las instrucciones proporcionadas en la hoja de datos de seguridad de materiales o MSDS para muestras codificadas o desconocidas. Siga las directrices de seguridad química y utilice un gabinete ventilado.

Use guantes y proteja sus ojos y rostro. Aplique los tejidos con productos químicos a intervalos de un minuto para facilitar el enjuague de los productos químicos de prueba después de la exposición; mantenga las placas con los tejidos tratados en la cabina de flujo laminar hasta que se haya aplicado el último tejido. A lo largo del procedimiento se utilizará una pipeta con punta de bulbo para manipular el tejido y los compuestos de prueba. Puede utilizarse la flama de un mechero Bunsen para generar la punta en forma de bulbo para probar productos químicos líquidos.

Dispense 30 microlitros del artículo de prueba líquido directamente sobre el tejido y comience inmediatamente el cronómetro para que cuente hacia adelante. Coloque la malla de nailon sobre la superficie del tejido cuando el cronómetro alcance un minuto, agregue el segundo compuesto líquido. Utilice tres tejidos por producto químico de prueba, recordando agregar cada compuesto a intervalos de un minuto.

Para probar semisólidos, utilice una pipeta de desplazamiento positivo para dispensar 30 microlitros directamente encima del tejido. Si es necesario, extienda el producto químico con una pipeta Pasteur para que coincida con el tamaño del tejido. Poco antes de la aplicación de la sustancia sólida, humedezca la superficie del tejido con 25 microlitros de DPBS estéril para mejorar el contacto entre la superficie del tejido y el producto químico de prueba; llene una cuchara afilada de aplicación de 25 miligramos con el material de prueba finamente molido.

Aplique el producto químico de prueba sólido sobre la superficie del tejido. Si es necesario, utilice una perilla estéril en la punta de su pipeta para vaciar completamente la cucharilla. Agite suavemente los insertos para mejorar la distribución del sólido sobre la superficie.

También puede utilizar la punta de bulbo de su pipeta para ajustarse al tamaño del tejido. No presione sobre la superficie del tejido. Finalmente, aplique DPBS como control negativo y 5 %SDS como control positivo a los insertos de tejido, también por triplicado, después de administrar la última dosis al tejido, y transfiera todas las placas a un incubador húmedo a 37 grados Celsius durante 35 más o menos un minuto.

Durante esta incubación, asegúrese de colocar todos los materiales necesarios para los pasos de lavado en la cabina. Tras la incubación de 35 minutos, retire todas las placas del incubador. Colóquelas en la cabina estéril y espere un período de 60 minutos para que se complete la exposición química en el tejido de la primera dosis.

A continuación, inicie el procedimiento de lavado. Enjuague los tejidos con DPBS estéril 15 veces. Para eliminar cualquier material de prueba residual, llene el inserto de tejido utilizando un flujo constante de DPBS suministrado a 1,5 centímetros de distancia de la superficie del tejido y luego vacíelo.

Asegúrese de que el flujo de DPBS no sea demasiado débil, ya que de lo contrario la sustancia de prueba no se eliminará. Recuerde mantener el intervalo de tiempo de un minuto para lavar cuatro tejidos con una malla de nailon cinco veces y retire cuidadosamente la malla con la pinza fina y puntiaguda. A continuación, continúe con los 10 lavados restantes después del 15.º, enjuague utilizando la botella de lavado, sumergiendo completamente el inserto tres veces con 150 mililitros de DPBS y agite para eliminar el resto del material de prueba.

Finalmente, enjuague el tejido. Inserte una vez desde el interior y otra desde el exterior con DPBS estéril. Elimine cualquier exceso de DPBS del tejido agitando suavemente el inserto y secándolo sobre papel absorbente estéril.

A continuación, transfiera los insertos de tejido transferidos a la nueva placa de seis pocillos previamente llenada con medio de ensayo. Recuerde nuevamente que todos estos pasos deben realizarse dentro del intervalo de un minuto para mantener el tiempo de exposición de 60 minutos para cada muestra expuesta. Después de enjuagar el último tejido, seque cuidadosamente la superficie de cada tejido con un hisopo estéril con punta de algodón.

Si aún hay trazas de la sustancia química en la superficie, intente eliminarlas utilizando el hisopo de algodón estéril. Por último, incube los tejidos en la incubadora durante las próximas 24 horas. Registre la hora de inicio de la incubación en la hoja de documentación de métodos.

Registre también todas las aplicaciones diferentes en la hoja de documentación del método. Anexe al procedimiento operativo estándar proporcionado por Mat Tech Corporation el movimiento de las placas en la cabina. Transfiera el inserto a la parte inferior de la placa de seis pocillos previamente llenada con 0,9 mililitros de medio.

Recolecte el medio de la fila superior y transfiera mediante pipeta a una placa de 24 pocillos previamente etiquetada, la cual luego se coloca a menos 20 grados Celsius. Hasta el análisis, el análisis de citocinas y/o quimiocinas liberadas en el medio de cultivo es un paso opcional. Continúe con la incubación durante otras 18 más o menos tres horas para el ensayo de MTT; etiquete 2 placas de 24 pocillos con los nombres químicos o códigos.

Recuerde que el MTT es tóxico, por lo que debe usar guantes de protección al manipularlo. Prepare la solución de MTT descongelando el concentrado de MTT y diluyéndolo con el diluyente de MTT.

Proteja de la luz ya que el MTT es sensible a la luz y utilícelo dentro de las dos o tres horas siguientes. Dado que el MTT se degrada con el tiempo, pipete 300 microlitros de medio con MTT en cada pocillo de la placa de 24 pocillos. Ahora retire las placas de 6 pocillos del incubador.

Seque el fondo de los insertos sobre un papel absorbente y transfiéralos a la placa de 24 pocillos previamente llenada con MTT. Coloque la placa de 24 pocillos en el incubador e incube durante tres horas. No olvide registrar la hora de inicio de la incubación con MTT en el MDS; cumpla estrictamente con el tiempo de incubación de tres horas para evitar obtener lecturas diferentes de MTT. Cuando finalice la incubación con MTT, utilice una bomba de succión con trampa para residuos tóxicos para aspirar suavemente el medio de MTT de todos los pocillos.

Rellene nuevamente los pocillos con DPBS y aspire. Repita este lavado otras dos veces y asegúrese de que los tejidos estén secos tras la última aspiración. Después de los lavados, transfiera los insertos a una nueva placa de 24 pocillos e introduzca los insertos agregando cuidadosamente con pipeta dos mililitros de solución extractora en cada uno.

El nivel ascenderá por encima de los bordes superiores del inserto, cubriendo así completamente los tejidos por ambos lados. Selle la placa de 24 pocillos utilizando un sellador térmico o parafina para inhibir la evaporación del extracto. Registre la hora de inicio de la extracción en la hoja de documentación de métodos y realice la extracción durante al menos dos horas a temperatura ambiente con agitación suave en un agitador de placas. Una vez finalizado el período de extracción, perfore los insertos con una aguja de inyección o con la punta de bulbo de su pipeta y permita que el extracto fluya hacia el pocillo del que se extrajo el inserto.

Deseche los insertos perforados y pipete la solución en el pocillo arriba y abajo tres veces hasta que esté homogénea. También se puede usar un agitador de placas ajustado a 120 rpm por cada tejido. Transfiera dos alícuotas de 200 microlitros de la forma azul y la solución a una placa microtituladora de fondo plano de 96 pocillos.

Transfiera los duplicados según el diseño fijo de la placa indicado en la hoja de cálculo que acompaña este protocolo en video para los blancos. Utilice isopropanol, lea la densidad óptica o DO en un espectrofotómetro para placas de 96 pocillos utilizando una longitud de onda de 570 nanómetros sin emplear un filtro de referencia. Ingrese los resultados en la hoja de cálculo para el cálculo automático de los mismos.

Téngase en cuenta las correcciones debidas a la interferencia del producto químico de prueba según se describe en el protocolo adjunto; un producto químico de prueba se clasifica como irritante. Si el porcentaje de viabilidad del tejido es igual o menor al 50 % tras el análisis espectrofotométrico, la DO a 570 de los tejidos del control negativo (NC) es mayor o igual a 1 y menor o igual a 2,5, y la viabilidad media de los tejidos del control positivo (PC), expresada como porcentaje de los tejidos del control negativo, es menor al 20 %, y la desviación estándar (SD) calculada a partir de las viabilidades tisulares porcentuales individuales de tres réplicas tratadas de forma idéntica es menor al 18 %. Los compuestos que arrojan valores de viabilidad celular inferiores al 50 % pueden considerarse irritantes.

Acabamos de mostrarle cómo realizar la prueba validada de irritación cutánea de 60 minutos y 42 horas con el modelo de piel humana reconstruida Epiderm. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que la mayor parte de la prueba se lleva a cabo bajo condiciones estériles o asépticas. Si existe la necesidad de alguna modificación del método o si necesita una explicación más detallada de cualquiera de los pasos del procedimiento, no dude en contactarnos para obtener ayuda y asesoramiento.

Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.