Fluorescencia In situ (FISH) Protocolo en el esperma humano

El protocolo de hibridación fluorescente in situ en núcleos de espermatozoides humanos se ha incorporado ampliamente en el campo del diagnóstico clínico. Una de las aplicaciones de esta metodología es el cribado de la ploidía de los espermatozoides. Como parte del asesoramiento reproductivo ofrecido a hombres infértiles, la presencia de anomalías numéricas es mayor en estos individuos que en la población general, y con frecuencia presentan parámetros seminales anormales.

Esto representa un riesgo aumentado de transmitir estas anomalías a cualquier descendencia. Hoy vamos a ilustrar el protocolo de hibridación fluorescente in situ en núcleos de espermatozoides descondensados para el análisis de los cromosomas 13, 18, 21, X e Y. Una vez que se ha recolectado la muestra, debe dejarse a temperatura ambiente durante 20 minutos hasta que ocurra la licuefacción. Para comenzar el protocolo, la muestra debe transferirse a un tubo de centrífuga.

Las soluciones que vamos a utilizar en la primera parte del experimento son hipertónicas, precalentadas a 37 grados C, y ácido acético en metanol en la proporción de tres a uno. Estas deben prepararse recién. Luego, la muestra está lista para centrifugar a 1000 G durante cinco minutos.

Ahora, retire suavemente el sobrenadante y agregue la solución hipertónica gota a gota hasta obtener un volumen de aproximadamente 10 mililitros. Este tubo debe permanecer a 37 grados C durante 30 minutos, y luego la muestra debe centrifugarse nuevamente. La centrifugación provoca que los espermatozoides se acumulen en el fondo del tubo, lo que nos permite reemplazar la solución hipotónica con metanol.

La centrifugación con ácido acético debe repetirse para cambiar el metanol-ácido acético tantas veces como sea necesario para obtener un sedimento blanco. Cuando esto ocurra, debe añadirse más metanol-ácido acético. El volumen final debe ajustarse según la dispersión celular que desee obtener en extensiones posteriores.

El paso final consiste en realizar las extensiones dejando caer la muestra fijada sobre portaobjetos Reed almacenados en metanol a menos 20 grados C. Es útil delimitar el área del portaobjetos que contiene la extensión de espermatozoides para futuras relocalizaciones. Esto puede hacerse fácilmente utilizando un lápiz de diamante en el lado opuesto del portaobjetos. Una vez verificada una dispersión celular óptima, los portaobjetos deben almacenarse a menos 20 grados C durante un mínimo de 24 horas.

Antes de continuar con el protocolo. En esta parte del experimento, vamos a utilizar solución de citrato de sodio salina, serie de etanol, DRE fatal y fide. Una vez que los portaobjetos hayan sido descongelados, las muestras fijadas deben lavarse y deshidratarse sumergiéndolas en dos frascos coplin consecutivos que contienen dos veces SSC.

Esto llevará tres minutos para cada coplano. Luego, las laminillas deben sumergirse durante dos minutos en cada uno de los frascos de coplano de etanol en orden de concentración creciente. En este punto, para continuar con las siguientes etapas, las laminillas deben secarse completamente.

Dado que el ADN en el núcleo del espermatozoide está altamente compactado, es necesario descondensar la cromatina antes de desnaturalizarlo. Esto puede hacerse utilizando una solución de DTT a 37 grados C. Este es un producto que actúa rompiendo los puentes de azufre de la protamina que enrolla el ADN en el núcleo del espermatozoide. El tiempo de incubación del portaobjetos en DTT debe ajustarse según la reactividad de la muestra de semen a este producto.

Normalmente, esto es de aproximadamente ocho minutos, aunque puede variar de dos a quince minutos; después de este tiempo, las laminillas deben transferirse inmediatamente a dos veces SSC durante tres minutos y nuevamente durante tres minutos adicionales, seguido de dos minutos en cada uno de los frascos de etanol coplán. Para la hibridación de la sonda, es esencial trabajar con cadenas simples de ADN. Esto requiere una etapa de desnaturalización antes de la adición de las sondas, que implica un período de incubación de cinco minutos en una solución de formamida a 73 grados C. Para concluir el tratamiento de las laminillas, se requiere una transferencia final en la solución de etanol, sumergiendo las laminillas durante un minuto por frasco coplán.

Luego, las láminas están listas para ser hibridadas en los estudios FISH realizados para el diagnóstico clínico. Los cromosomas analizados con mayor frecuencia incluyen los cromosomas sexuales y los cromosomas 13, 18 y 21. Para analizar estos cromosomas, utilizaremos un kit de sondas de ADN multicolor de vices.

Este contiene un vial con una combinación de sondas para la región satélite alfa de los cromosomas X, Y y 18, marcados con origen verde y aqua respectivamente, y otro vial con una combinación de sondas para los cromosomas 13 y 21, marcados verde y naranja respectivamente. El volumen de la mezcla de sonda añadido variará según el tamaño del área que desee hibridar como referencia para una cubierta de 15 por 15. Un volumen de cinco microlitros es suficiente.

Ambas mezclas de sondas se pre-desnaturalizan en un tampón de hibridación para facilitar su uso, por lo que se pueden añadir directamente a las preparaciones de cromosomas condensadas y desnaturalizadas. También existen otras sondas comerciales disponibles para una amplia gama de cromosomas y Loki que pueden utilizarse en estos experimentos. Por lo general, sin embargo, estas sondas requieren un tratamiento de pre-desnaturalización antes de añadir la mezcla a la muestra objetivo.

En estas situaciones, es suficiente seguir las instrucciones del fabricante. La región objetivo debe cubrirse con una laminilla y sellarse con cemento de goma. Luego, los portaobjetos están listos para colocarse en la cámara de hibridación, precalentada a 37 grados C, e incubarse a esa temperatura durante seis a 24 horas.

En la parte final del protocolo, vamos a utilizar estas dos soluciones de lavado compuestas por diferentes concentraciones de solución de citrato de sodio salino y el detergente NP 40. Después del tiempo de incubación, se pueden retirar las laminillas de la cámara de hibridación para eliminar el cemento de goma. Luego se retira cuidadosamente la cubreobjetivo.

Como se muestra, los portaobjetos se sumergen durante dos minutos en la primera solución de lavado, precalentada a 73 grados C. Luego se transfieren a la segunda solución de lavado a temperatura ambiente durante un minuto adicional. Estos dos lavados nos ayudarán a eliminar cualquier señal de hibridación inespecífica. Después de estos dos lavados, debemos esperar a que los portaobjetos se sequen para concluir el último paso del protocolo.

En este momento, se añade un producto de contratincción para facilitar la visualización del núcleo de las células. Uno de los productos más comunes utilizados con este fin es dpi. El volumen añadido también debe ajustarse al tamaño del área hibridada como referencia para una cubreobjetos de 18 por 18.

Un volumen de ocho microlitros de DPI es suficiente. La laminilla puede sellarse con barniz de uñas, y ahora los preparados están listos para ser visualizados. Alternativamente, pueden almacenarse a menos 20 grados C hasta su análisis posterior.

El microscopio que vamos a utilizar para la visualización es un Olympus BX 60 epifluorescente equipado con un filtro de triple banda para dpi, Texas Red, FITC y filtros de banda simple para aqua FITC y Texas Red. A través del filtro de triple banda, la preparación hibridada con x, Y y 18 muestra señales para estos tres cromosomas. Utilizando el filtro de banda simple para aqua, solo podemos visualizar las señales fluorescentes del cromosoma 18. Deberíamos esperar una de estas señales en cada espermatozoide normal.

Sin embargo, al utilizar el filtro de banda única solo para FITC, algunos espermatozoides muestran una señal fluorescente verde correspondiente al cromosoma X. Los espermatozoides que carecen de la señal verde deben mostrar una señal roja para el cromosoma Y, que puede visualizarse específicamente mediante el filtro para Texas red. Al visualizar la hibridación 1321 a través del filtro de triple banda, podemos distinguir las señales de estos dos cromosomas.

La señal verde corresponde al cromosoma 13 y se puede visualizar específicamente utilizando el filtro de banda única para FITC. El filtro de banda única para Texas Red nos permite visualizar específicamente las señales del cromosoma 21. Todos los espermatozoides normales deben mostrar una señal para cada uno de estos dos sondas.

Por tanto, para resumir, estas son las principales etapas del protocolo. Nuevamente, el proceso de fijación debe realizarse con precisión para obtener extensiones de buena calidad mediante la adición gota a gota de ácido acético metanólico. Para evitar la formación de agregados de espermatozoides durante el proceso de descondensación, el tiempo de incubación en la solución de DTT debe ajustarse según la reactividad de la muestra de semen a este producto.

La exposición excesiva de los espermatozoides al DTT daría como resultado señales dispersas al final del protocolo, mientras que una exposición insuficiente provocaría una hibridación nula de la sonda y la ausencia de algunas señales. Si bien la desnaturalización de la muestra espermática es obligatoria, la desnaturalización de la sonda debe adaptarse a las indicaciones del fabricante. Es importante mantener un control estricto sobre el tiempo y la temperatura de los dos lavados posteriores a la hibridación.

Una temperatura más alta o un tiempo de lavado excesivo puede provocar la eliminación de algunas señales, mientras que lo contrario no eliminaría las señales inespecíficas. Finalmente, el uso de un microscopio fluorescente epiluminiscente equipado con filtros específicos adecuados es esencial para una buena visualización e interpretación de las señales. Y eso es todo.

Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.