Name: Obtener altamente purificada Toxoplasma gondii Los ooquistes por un gradiente de cloruro de cesio discontinua (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-03T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Aprende a purificar ooquistes de Toxoplasma gondii mediante un gradiente discontinuo de cloruro de cesio. Este método mejora la pureza para experimentos de biología molecular y cultivo de tejidos.

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Nos gustaría dar las gracias a Nichole Brinkman y Michael Ware para la revisión técnica del manuscrito y el doctor Abu Sayed y Ransick Linda de apoyo técnico y administrativo. La Agencia Estadounidense de Protección Ambiental a través de su Oficina de Investigación y Desarrollo parcialmente financiado y colaborado en la investigación que se describe aquí bajo el contrato número EP-D-06-096 a Dynamac, Inc. y un número de convenio interinstitucional DW-12-92289801-0 a USDA. Se ha sometido a revisión de la agencia y aprobado para su publicación. La mención de marcas o productos comerciales no constituye un endoso o recomendación para su uso. MJS dirección actual: Dynamac, Inc. Cincinnati, OH.

<p class="jove_title"&gt; 1. Precauciones generales de seguridad cuando se trabaja con<em&gt; T. gondii</em&gt; Ooquistes</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Es importante que siga todas las precauciones de seguridad cuando se trabaja con<em&gt; T. gondii</em&gt; Ooquistes. En la mayoría de los individuos sanos,<em&gt; T. gondii</emInfección&gt; es fácilmente controlado por el sistema inmune, sin embargo, una vida de duración presenta la infección. Las personas inmunodeprimidas son particularmente susceptibles a la toxoplasmosis y no deben manipular<em&gt; T. gondii</em&gt; Ooquistes. Las mujeres embarazadas no deben manipular<em&gt; T. gondii</em&gt; Ooquistes, ya que la infección puede causar defectos de nacimiento graves<sup&gt; 8</sup&gt;.</li&gt;<li<em&gt; T. gondii</em&gt; Ooquistes sólo deben ser manejados en un área designada y con personal capacitado. Las señales que indican<em&gt; T. gondii</em&gt; Trabajo de ooquistes en curso debe ser enviado a alertar a los demás entrar en el área designada.</li&gt;<li&gt; Use equipos de protección personal (EPP), como una bata de laboratorio, bata desechable, guantes desechables, y protección para los ojos o un protector de cara al manejar<em&gt; T. gondii</em&gt; Ooquistes.</li&gt;<liCambios&gt; frecuente de guantes son recomendables. No maneje ningún equipo de laboratorio con<em&gt; T. gondii</em&gt; Ooquistes contaminada guantes.</li&gt;<li&gt; Siempre use bandejas de metal forrado con un autoclave revestimientos absorbentes desechables cuando se trabaja con<em&gt; T. gondii</em&gt; Ooquistes. Asegúrese de que todos los bastidores, tubos, etc utilizados son desechables o autoclave.</li&gt;<li&gt; Todos los<em&gt; T. gondii</em&gt; Residuos deben ser esterilizados en autoclave dos veces por lo menos una hora.</li&gt;<li&gt; Todos los equipos no desechables (bastidores, bandejas, etc) también deben ser esterilizados en autoclave dos veces por lo menos una hora.</li&gt;<li&gt; Líneas de vacío usado para aspirar líquidos debe estar conectado a una Vacushield ™ filtro para evitar la contaminación de la bomba de vacío.</li&gt;<li&gt; Todos los laboratorios afectados banco tapas deben ser desinfectados después de completar el trabajo con<em&gt; T. gondii</em&gt; Ooquistes. Hipoclorito recién hecho el 10% debe ser libremente aplicados a la zona de trabajo y permitió seco. El área entonces se deben enjuagar bien con agua.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 2. Preparación de tampones y soluciones</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Prepare una solución de 1 L 2,2 M de sacarosa mediante la disolución de 752,66 g de sacarosa en 600 ml ddH<sub&gt; 2</sub&gt; O. Agitar y calentar suavemente con una placa de agitación se calienta para disolver la sacarosa. Una vez disuelto por completo, alcanzar un volumen de 1 L con ddH<sub&gt; 2</sub&gt; O. Esto debe ser seguido por la esterilización en autoclave la solución por lo menos durante 20 minutos.</li&gt;<li&gt; Prepare un 1L buffer TE (50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA), pH 7,2 mediante la adición de 6,05 g de Tris-HCl y 3.7 g de EDTA en 700 ml de ddH<sub&gt; 2</sub&gt; O, ajustar el pH a 7.2 a continuación, llevar el volumen a 1 L con ddH<sub&gt; 2</sub&gt; O.</li&gt;<li&gt; Para el gradiente de CsCl, preparar una solución madre de CsCl con una gravedad específica de 1.15 (1.15-CsCl) mediante la adición de 21,75 g de CsCl con 103,25 ml de buffer TE. Para una solución, mezclar 30 ml de TE con 20 ml de 1.15-CsCl. Para la solución B, mezclar 20 ml de TE con 30 ml de CsCl 1,15 y 12,5 l de solución de rojo fenol. Para la solución C, mezclar 10 ml de TE con 40 ml de CsCl 1,15 (Tabla 1).</li&gt;<li&gt; Prepare una solución de 1 litro 1 N de hidróxido de sodio (NaOH) por disolución de 40 g de NaOH en 800 ml de padecer esta enfermedad<sub&gt; 2</sub&gt; O. Una vez disuelto, alcanzar un volumen de 1 L con ddH<sub&gt; 2</sub&gt; O.</li&gt;<li&gt; Prepare una solución de L 1 2% (en volumen) de H<sub&gt; 2</sub&gt; SO<sub&gt; 4</sub&gt; Mezcla de 20 ml de H<sub&gt; 2</sub&gt; SO<sub&gt; 4</sub&gt; Con 980 ml de padecer esta enfermedad<sub&gt; 2</sub&gt; O.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 3. Sacarosa flotar</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Añadir 10 ml de una suspensión fecal de<em&gt; T. gondii</em&gt; Ooquistes, en el 2% H<sub&gt; 2</sub&gt; SO<sub&gt; 4</sub&gt;, En un tubo de 50 ml de centrífuga cónico. Cabe señalar que la suspensión fecal se refiere a las muestras que han sido pre-procesadas a través de un procedimiento de flotación sacarosa como se describió previamente<sup&gt; 8</sup&gt;. Cuando las muestras fecales son inicialmente cosechado de los gatos infectados se procesan a través de un flotador de sacarosa como se describe en la referencia 8. Este flotador sacarosa adicional es necesaria para minimizar aún más los desechos fecales prorrogada para el proceso de purificación de CsCl y obtener el más puro<em&gt; T. gondii</em&gt; Ooquistes posible.</li&gt;<li&gt; Neutralizar el H 2%<sub&gt; 2</sub&gt; SO<sub&gt; 4</sub&gt; Mediante la adición de 6 ml (3 / 5 volúmenes) de NaOH 1 N a la suspensión fecal. Mezclar bien por agitación.</li&gt;<li&gt; Añadir un volumen igual (16 ml) de sacarosa 2,2 M la creación de una concentración final de 1,1 M a la suspensión fecal y mezclar bien por agitación.</li&gt;<li&gt; Cuidado de superposición de la sacarosa / suspensión fecal con 10 ml ddH<sub&gt; 2</sub&gt; O usando una pipeta de 10 ml. Centrifugar la suspensión a 1.200 g durante 20 minutos a temperatura ambiente sin ningún freno.</li&gt;<li&gt; Recoger cuidadosamente el agua de encima y las capas de la interfase y la transferencia a un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml cónicos con la pipeta de la interfase aire-agua sin remolinos de la pipeta. Es importante minimizar el arrastre de sacarosa durante la percepción de la capa de interfase.</li&gt;<li&gt; Mezclar el resto de sacarosa / fecal solución pellet por agitación del tubo.</li&gt;<li&gt; Repetir los pasos 3.4 y 3.5.</li&gt;<li&gt; Lleve el volumen de las dos soluciones de interfase de ooquistes de 50 ml con ddH<sub&gt; 2</sub&gt; O y centrifugar los tubos a 2000 xg durante 10 minutos a temperatura ambiente.</li&gt;<li&gt; Aspirar el sobrenadante de cada tubo y volver a suspender las pastillas con 5 ml de buffer TE y la piscina de la suspensión de ooquistes juntos. El volumen total combinado debe ser de 10 ml.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 4. Gradiente CsCl</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Prepare un gradiente de CsCl discontinuo en un tubo de 50 ml canto de policarbonato de roble cuidadosamente underlaying cada capa con una jeringa de 50 ml con un calibre 18 con extremos romos, autoclavable, aguja de acero, y una llave de paso de 2 vías. Nota: El rojo de fenol se agrega a la solución B para distinguir fácilmente entre las capas de gradiente (Tabla 1).</li&gt;<li&gt; Poco a poco agregue las siguientes soluciones para el tubo en el orden que se indica a continuación. Cabe señalar que el caudal no debe exceder de más de 0,5 ml / seg.<ol&gt;<li&gt; 10 ml de la muestra de la suspensión TE / ooquistes</li&gt;<li&gt; 8 ml de solución A</li&gt;<li&gt; 8 ml de solución B</li&gt;<li&gt; 8 ml de solución C</li&gt;</ol&gt;</li&gt;<li&gt; Centrifugar el tubo de Oak Ridge, a 12.000 xg durante 60 min a 4 ° C sin freno. El uso de un rotor de ángulo fijo es aceptable, pero una alta velocidad de balanceo resultados cubo en una mejor separación de los ooquistes de la muestra de la suspensión con un mínimo de frotis de restos fecales en el lateral o el tubo. La extensión de las manchas depende de la composición de la suspensión fecal y por lo tanto puede ser necesario llevar a cabo dos gradientes de CsCl si la suspensión fecal está muy sucio.</li&gt;<li&gt; Después de la centrifugación, recoge la banda de ooquistes opaco / blanco que contiene entre las soluciones A y B. Para reducir al mínimo la contaminación con residuos fecales, vaya directamente a la banda de ooquistes sin alterar el gradiente y recoger la interfase de ooquistes con una pipeta de 10 ml. Transferencia de la interfase de ooquistes a un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml cónicos. Trate de minimizar la cantidad de solución de CsCl aspirado, mientras que la recogida de los ooquistes de interfase, ya que puede suponer un problema en la granulación los ooquistes durante la etapa de lavado.</li&gt;<li&gt; Lave los ooquistes con 30-40 ml de padecer esta enfermedad<sub&gt; 2</sub&gt; O. Centrifugar el tubo a 2000 xg a temperatura ambiente durante 10 minutos sin freno. Con cuidado, aspirar el sobrenadante sin perturbar el precipitado de ooquistes. Repita el lavado dos veces más.</li&gt;<li&gt; Al final del último lavado, aspirado con cuidado el sobrenadante y resuspender el precipitado en 10 ml de ácido sulfúrico al 2% y se almacenan a 4 ° C hasta su uso. Ooquistes Ahora está listo para su posterior manipulación. La pureza de ooquistes puede ser controlado microscópicamente por la ausencia de restos fecales en la muestra.</li&gt;</ol

<ol><li>Dubey, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+viable+Toxoplasma+gondii+in+beef%2C+chicken%2C+and+pork+from+retail+meat+stores+in+the+United+States%3A+risk+assessment+to+consumers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Prevalence of viable Toxoplasma gondii in beef, chicken, and pork from retail meat stores in the United States: risk assessment to consumers.</a> J. Parasitol. 91, 1082-1093 (2005).</li>
<li>Tenter, A. M., Heckeroth, A. R., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+from+animals+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: from animals to humans.</a> Int. J. Parasitol. 30, 1217-1258 (2000).</li>
<li>Bowie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outbreak+of+toxoplasmosis+associated+with+municipal+drinking+water%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Outbreak of toxoplasmosis associated with municipal drinking water.</a> Lancet. 350, 173-177 (1997).</li>
<li>Moura, L. de <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waterborne+toxoplasmosis%2C+Brazil%2C+from+field+to+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Waterborne toxoplasmosis, Brazil, from field to gene.</a> Emerg. Infect. Dis. 12, 326-329 (2006).</li>
<li>Jones, J. L., Dubey, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waterborne+toxoplasmosis+-+Recent+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Waterborne toxoplasmosis - Recent developments.</a> Exp. Parasitol. doi: 10.1016/j.exppara.2009.03.013, (2009).</li>
<li>Dumetre, A., Darde, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+detect+Toxoplasma+gondii+oocysts+in+environmental+samples%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">How to detect Toxoplasma gondii oocysts in environmental samples.</a> FEMS Microbiol. Rev. 27, 651-661 (2003).</li>
<li>Dumetre, A., Darde, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Toxoplasma+gondii+oocysts+by+cesium+chloride+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification of Toxoplasma gondii oocysts by cesium chloride gradient.</a> J. Microbiol. Methods. 56, 427-4230 (2004).</li>
<li>Dubey, J. P. Toxoplasmosis of Animals and Man. , 2nd Edition, CRC Press, Inc. Boca Raton, FL. (2009).</li>
</ol>

obtener altamente purificada toxoplasma gondii los ooquistes por un gradiente de cloruro de cesio discontinua

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Toxoplasma gondii es un patógeno protozoario intracelular obligado que comúnmente infecta a los seres humanos. Se trata de un apicomplejo bien caracterizados asociados con la causa de los brotes de los alimentos y por el agua-enfermedad. El huésped definitivo es la especie de felino en la replicación sexual se produce como resultado el desarrollo de los ooquistes altamente infecciosa y resistente al medio ambiente. La infección se produce a través de la ingestión de quistes en los tejidos de la carne contaminada o los ooquistes del suelo o del agua. La infección suele ser asintomática en individuos sanos, pero los resultados de una infección latente de por vida que puede reactivarse causando encefalitis toxoplásmica y la muerte si el individuo se convierte en inmunocomprometidos. La carne contaminada con T. quistes gondii han sido la fuente principal de infección en Europa y los Estados Unidos, pero los cambios recientes en el manejo de los animales y las prácticas de cría y manejo de alimentos y procedimientos mejorados de procesamiento han reducido significativamente la prevalencia de T. gondii quistes en la carne de 1, 2. Sin embargo, la seroprevalencia en los seres humanos sigue siendo relativamente alta lo que sugiere que la exposición del suelo ooquistes o agua contaminada es probable. De hecho, los brotes de agua de la toxoplasmosis se han reportado en todo el mundo el apoyo a la exposición de la teoría a la forma de ooquistes del medio ambiente representa un riesgo significativo para la salud 5.3. Hasta la fecha, la investigación en la comprensión de la prevalencia de T. ooquistes gondii en el agua y el medio ambiente son limitados debido a la falta de herramientas para detectar ooquistes en el medio ambiente 5, 6. Esto se debe principalmente a la falta de protocolos de purificación eficientes para la obtención de un gran número de alta pureza T gondii ooquistes de gatos infectados con fines de investigación. Este estudio describe el desarrollo de un método modificado de CsCl que fácilmente purifica T. gondii ooquistes provenientes de heces de gatos infectados que son adecuados para la biología molecular y la manipulación de cultivo de tejidos 7.

Este estudio describe el desarrollo de un método modificado de CsCl que fácilmente se purifica T. gondii ooquistes en las heces de gatos infectados que son adecuados para la biología molecular y la manipulación de cultivo de tejidos

Obtener altamente purificada Toxoplasma gondii Los ooquistes por un gradiente de cloruro de cesio discontinua

Toxoplasma gondii es un patógeno protozoario intracelular obligado que infecta comúnmente a los seres humanos. Es un apicomplejo bien caracterizado asociado con...

Los oocistos de Toxoplasma gondii generalmente se obtienen de heces de gatos infectados y se aíslan mediante un procedimiento de flotación que resulta en una suspensión parcialmente purificada, para estudios moleculares y de cultivo celular. Sin embargo, los experimentos con este parásito requieren oocistos altamente purificados para lograrlo. Los oocistos se purifican adicionalmente mediante un paso de flotación en sacarosa, en el cual se resuspenden los oocistos, se sobrepone sacarosa con agua y se centrifuga para separar los oocistos de la mayor parte de la materia fecal.La capa de osis se transfiere luego a un nuevo tubo sobrepuesto con cesio, cloruro y se centrifuga. La banda OSIS resultante, bien definida, se recoge y se lava, lista para usar en experimentos que requieran teon io altamente purificado para asistir. Hola, soy la Dra. Sarah Staggs, empleada de Dynam, un contratista del Laboratorio Nacional de Investigación sobre Exposición de la Agencia de Protección Ambiental de EE. UU.Hoy les mostraremos un procedimiento para purificar Toxoplasma Gandhi io Oasis a partir de las heces de gatos de laboratorio infectados, utilizando un gradiente discontinuo de cloruro de cesio. Este procedimiento se utiliza rutinariamente en nuestro laboratorio para aislar OSI, útil para experimentos de biología molecular y cultivo de tejidos. Así que comencemos.Antes de comenzar cualquier trabajo con TG O Osis, deben tenerse en cuenta consideraciones importantes sobre seguridad. Las personas que estén inmunodeprimidas, embarazadas o intentando activamente quedar embarazadas no deberían manipular el patógeno debido al riesgo de adquirir toxoplasmosis, que puede causar enfermedad y defectos congénitos graves. X.Para reducir el riesgo de infección, designe un espacio específico para este procedimiento y coloque letreros para advertir a otras personas antes de que entren en la habitación.Recuerde usar una bata de laboratorio, una bata desechable, guantes desechables y protección ocular adecuada o un protector facial al manipular quistes T-One IO. Asegúrese de cambiar los guantes con frecuencia y evite tocar cualquier equipo con guantes contaminados. También es importante trabajar sobre bandejas metálicas autoclavables forradas con protectores absorbentes desechables.Y en esa línea, tómese un minuto para asegurarse de que todas las gradillas, tubos y demás equipos que planea utilizar sean desechables o autodesechables. Si está utilizando artículos no desechables, asegúrese de autoclavarlos después de su uso durante dos ciclos de una hora. También deberá conectar todas las líneas de vacío a un filtro protector de vacío para evitar contaminar la bomba de vacío.Una vez finalizada la aislación de los quistes, deberá aplicar una solución fresca de hipoclorito al 10 % sobre la superficie de trabajo. Deje que se seque y luego enjuague el área varias veces con agua. Una vez que se hayan tomado las medidas de seguridad adecuadas, puede continuar con sus experimentos.Antes de la recolección de T Guni OYS, primero se deben preparar todas las soluciones necesarias para el gradiente de sacarosa, flotación y cloruro de cesio, así como los pasos de centrifugación. Las soluciones que necesitará incluyen una solución 2,2 molar de sacarosa esterilizada mediante un ciclo de 20 minutos en el autoclave, un litro de tampón TE con pH 7,2, una solución normal de hidróxido de sodio, una solución al 2% de ácido sulfúrico y una solución stock de cloruro de cesio con una densidad específica de 1,15.La solución stock de cloruro de cesio 1,15 se utilizará para preparar las soluciones A, B y C, que se emplearán para elaborar el gradiente de cloruro de cesio. La solución A se prepara mezclando 30 mililitros de TE con 20 mililitros de la solución stock de cloruro de cesio 1,15; la solución B se prepara mezclando 20 mililitros de TE con 30 mililitros de la solución stock de cloruro de cesio 1,15 y luego añadiendo 12,5 microlitros de solución de fenol rojo. Finalmente, la solución C se prepara mezclando 10 mililitros de TE con 40 mililitros de la solución de cloruro de cesio 1,15.Comenzaremos la preparación del gradiente de sacarosa tomando una suspensión fecal de 10 mililitros de T osis en ácido sulfúrico al 2% y transfiriéndola a un tubo cónico de centrífuga de 50 mililitros. La fuente del material fecal proviene de heces de gatos infectados que ya han sido procesadas mediante un procedimiento de flotación en sacarosa descrito previamente en un libro de texto escrito por el Dr. JP Duby, titulado Toxoplasmosis of Animals and Humans. Este paso adicional reduce aún más la cantidad de restos fecales en el proceso de purificación con cloruro de cesio y ayuda a obtener la mayor pureza posible de los quistes de T goi.A continuación, neutralizamos el ácido sulfúrico añadiendo tres quintas partes del volumen de una solución normal de hidróxido de sodio a la suspensión fecal. Mezcle bien la suspensión mediante vortex. A continuación, añada un volumen igual de sacarosa y mezcle bien la suspensión mediante vortex.Utilizando 10 mililitros por muestra, superponga cuidadosamente la suspensión fecal en sacarosa con 10 mililitros de agua doblemente destilada. Una vez finalizado con cuidado, coloque los tubos en el centrifugador y centrifugue a 1200 × g durante 20 minutos a temperatura ambiente, sin frenado al finalizar la centrifugación. Teniendo cuidado de no perturbar la interfase, aspire suavemente con una pipeta desde la interfase aire-agua para recolectar las capas superior acuosa e interfase.Es muy importante tratar de minimizar la cantidad de la capa de sacarosa que se arrastra mientras se recoge la capa de interfase. Transfiera estas capas a un nuevo tubo cónico de centrífuga de 50 mililitros. Vortexee el tubo para mezclar la solución restante del pellet fecal con sacarosa.Repita una vez más la superposición de agua anterior en los pasos de centrifugación. Después de la centrifugación, recoja las capas superior acuosa y de interfase y transfiéralas a un nuevo tubo. Utilice agua doblemente destilada para llevar el volumen de las soluciones de interfase de los dos oh oh quistes a 50 mililitros.Luego, centrifugue los tubos a 2000 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, aspire el sobrenadante S de cada tubo. Re suspenda los pellet en cinco mililitros de tampón TE y prepare las suspensiones de ósmosis.Los osis ya están listos para el paso del gradiente de cloruro de cesio. Comenzaremos preparando un gradiente discontinuo de cloruro de cesio en un tubo de roble de policarbonato de 50 mililitros. Agregue 10 mililitros de la suspensión que contiene TE y osis utilizando una jeringa de 50 mililitros con una aguja de acero autoclavable romo de calibre 18 al tubo de policarbonato.Y mediante una llave de paso de dos vías, agregue lentamente las siguientes soluciones directamente al fondo del tubo. Ocho mililitros de la solución A, ocho mililitros de la solución B y ocho mililitros de la solución C. Asegúrese de que el caudal no supere 0,5 mililitros por segundo. También es importante tener en cuenta que el rojo de fenol en la solución B ayuda a distinguir las capas del gradiente.Ahora está listo para centrifugar el tubo Oak ridge a 12.000 × g durante 60 minutos a cuatro grados Celsius sin frenado, utilizando un rotor de ángulo fijo de alta velocidad. Una vez finalizada la centrifugación, recogemos la banda blanca opaca entre las soluciones A y B. Esta banda contiene los ooquistes. Utilizando un pipeta de 10 mililitros, diríjase directamente a la banda de ooquistes sin perturbar el gradiente y recoja los ooquistes.Intente minimizar la cantidad de solución de cloruro de cesio que aspira mientras recoge el quiste, ya que el exceso de cloruro de cesio podría dificultar la formación del pellet de quistes durante el lavado. Posteriormente, transfiera el OSIS a un nuevo tubo cónico de centrífuga de 50 mililitros. Lave ahora los quistes O con 30 a 40 mililitros de agua doblemente destilada y luego centrifugue el tubo a 2000 ×g a temperatura ambiente durante 10 minutos sin freno; aspire cuidadosamente el sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el pellet de quistes O.Repita el lavado otras dos veces. Una vez que los lavados finales hayan terminado, aspire cuidadosamente el sobrenadante y resuspenda el sedimento en 10 mililitros de ácido sulfúrico al 2%. Examine el OSIS al microscopio para asegurarse de que todos los restos fecales hayan sido eliminados con éxito de la muestra.Los osis ya están listos para manipulaciones posteriores, o puede almacenarlos a cuatro grados Celsius hasta que esté listo para usarlos. A continuación se muestra cómo se ven los osis no purificados utilizando un microscopio de contraste de interferencia diferencial con un aumento de 400 x. Observe la presencia de grandes cantidades de contaminantes fecales en el campo, lo que dificulta mucho identificar los asistentes OSI.Aquí es cómo se ven los OISS a 400 x después del protocolo de purificación mediante gradiente de cloruro de cesio. Observe la ausencia de restos fecales. Acabamos de mostrarle cómo purificar Toxoplasma Gandhi Iasis a partir de las heces de gatos infectados en laboratorio utilizando un gradiente discontinuo de cloruro de cesio.Al realizar este procedimiento, es importante recordar seguir todas las normas de seguridad y tener siempre cuidado al colocar la capa inferior del gradiente de cloruro de cesio, agregando cada capa muy lentamente y tratando de no perturbar ni mezclar el gradiente. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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