Name: Mesoscópica fluorescencia Tomografía por En vivo Imágenes de desarrollo Drosophila /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Aprende tomografía de fluorescencia mesoscópica para visualización 3D in vivo de discos imaginales alares GFP en Drosophila melanogaster. Esta técnica supera los límites de la microscopía tradicional mediante iluminación multiproyección.

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C. Vinegoni reconoce el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) de subvención 1-SR1-EB006432.

Las poblaciones de Drosophila melanogaster utilizados en este experimento son los siguientes: <ul style="list-style-type:none;"><li> elav-Gal4 (FBti0002575) </li><li> AP-Gal4md544 (FBal0051787) </li><li> UAS-srcEGFP (FBti0013990) </li><li> w1118 (FBal0018186) </li></ul> Para todos los experimentos, el sistema UAS-Gal4 se utilizó para sobreexpresar las buenas prácticas agrarias en el tejido de interés (es decir, las glándulas salivares o los discos del ala). Más específicamente, las moscas hembras transgénicas con la adecuada Gal4 fueron cruzadas a UAS-EGFP compañeros de transgénicos. Las cruces fueron criados a 25 ° C en un incubador humidificado. Cuando las pupas de comenzar a llenar los viales (aproximadamente 5-6 días después del inicio de la cruz), que fueron seleccionados para la fluorescencia de GFP en la etapa de blanco prepupal (0-1 horas después de la formación pupa) y recogidos por tomografía. <ol><li> Establecer cruzamientos apropiados y posterior a 25 ° C </li><li> 5-6 días después del inicio de la cruz, seleccione la progenie fluorescentes para imágenes. Utilice una brocha húmeda para la eliminación suave de la prepupas blancos desde los laterales del vial. </li><li> Ponga prepupas en una gota de agua o PBS coloca en una placa de Petri para eliminar las partículas de alimentos y el pegamento que se refiere al caso de pupa y hace que la muestra autofluorescentes. Limpie suavemente con un pincel. Si el envejecimiento de las pupas es necesario, lugar elegido prepupas blanco en una placa de Petri con una toalla de papel húmeda (una cámara húmeda) o en los lados de una cubeta limpia con la comida volar. Esto asegurará que no hay suficiente humedad, para permitir el desarrollo adecuado de los animales. </li></ol> Drosophila montaje <ol><li> Pegue la parte inferior de la caja de pupa en un tubo capilar de vidrio (800 micras de diámetro) de tal manera que la mosca anterior / posterior del eje se orienta paralelo al tubo. </li><li> Fijar el tubo capilar verticalmente en un escenario de rotación. </li><li> Ajuste el eje de inclinación de la fase de rotación para que el eje de rotación de modo que sea paralelo a las columnas de píxeles de la imagen CCD. </li></ol> Determinación adelante Modelo <ol><li> Fijar una pupa en un vaso capilar y montaje como se describió anteriormente </li><li> Llenar un tubo capilar de sílice (100 micrones, OD) con un tinte fluorescente (Cy5.5) </li><li> Inserte el tubo capilar dentro de la pupa a 45 grados con respecto al eje anterior / posterior </li><li> Iluminar la pupa con un haz de láser de excitación con una lente de apertura numérica baja. Recoge imágenes de fluorescencia transiluminación más de 360 ​​grados de rotación de la pupa a lo largo de su eje vertical. </li><li> Ajustar los datos experimentales con un modelo apropiado hacia adelante </li></ol> Imágenes de las glándulas salivales <ol><li> Montar una pupa expresar GFP en las glándulas salivales como se describió anteriormente </li><li> Iluminar con un haz de excitación y se acumulan en la transiluminación la señal de fluorescencia de GFP en 360 grados de rotación de la pupa a lo largo de su eje vertical. </li><li> Reconstruir los datos obtenidos utilizando el modelo de avance </li></ol> Time-lapse de imágenes <ol><li> Montar un blanco GFP prepupa expresar en el disco imaginal de ala </li><li> Mantener el ambiente húmedo y de imagen a temperatura ambiente para evitar la deshidratación de la pupa. </li><li> Coloque una velocidad de obturación para evitar la iluminación continua </li><li> Iluminar con un haz de excitación y se acumulan en la transiluminación la señal de fluorescencia de GFP en 360 grados de rotación de la pupa a lo largo de su eje vertical. </li><li> Reconstruir los datos obtenidos utilizando el modelo a seguir. </li></ol> Histología <ol><li> Diseccionar las glándulas salivales del SNC / discos ojo en 1x PBS. </li><li> Para reparar tejidos en formol al 4%, 1x PEM (tuberías de 100 mm, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl 2) de 20 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Quitar la fijación y montaje en Vectashield con DAPI (Vector) </li><li> Imagen con un microscopio de fluorescencia. </li></ol> Time-Lapse Histología <ol><li> Recoger prepupas blanca y la que en una cámara húmeda. </li><li> Recoger las pupas en las distintas fases </li><li> Pinchazo de la envoltura pupal dos veces (0 horas después de la formación pupario) con una aguja fina (insectos pin 000, FST) antes de la fijación. </li><li> Fix pupas en el 8% de formaldehído, 1x PEM por 6-8 horas a temperatura ambiente con agitación suave. </li><li> Después de la eliminación de la fijación y enjuague con PBS 1x, cortar la pupa fija con una cuchilla de dos piezas perpendiculares al eje A / P; </li><li> Sumergir las dos piezas en Vectashield con DAPI (Vector) y montaje en portaobjetos cubreobjetos (Lab-Tek) para imágenes. </li><li> Adquirir imágenes con un microscopio confocal de fluorescencia. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1510/1510fig1thumb.jpg" alt="la figura 1" border="0" /> Figura 1. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1510/1510fig1.jpg">haga clic aquí</a> para ver alArger versión de la figura 1.

<ol><li>Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+and+listening+to+light%3A+the+evolution+of+whole-body+photonic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging.</a> Nat. Biotechnol. 23, 313-320 (2005).</li>
<li>J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+projection+tomography+as+a+tool+for+3D+microscopy+and+gene+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies.</a> Science. 296, 541-545 (2002).</li>
<li>Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy%3A+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat. Methods. 4, 331-336 (2007).</li>
<li>Vinegoni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+Drosophila+melanogaster+pupae+with+mesoscopic+fluorescence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography.</a> Nat. Methods. 5, 45-47 (2008).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En vivo-reconstrucciones de la envoltura pupal y las glándulas salivales que expresan GFP-de una D. melanogaster prepupa (Barra de escala, de 500 micras) con la histología correspondiente (azul, DAPI, de color verde, la fluorescencia de GFP) se muestra en la Fig. 1 (a). Time-lapse serie de imágenes de D. melanogaster ala discos imaginales se muestra en la Fig. 1 (b). Las imágenes se adquieren a partir de un espécimen vivo sola, en cuatro diferentes puntos de tiempo (0,3.0, 3.5 y 6.5 horas). En la prime...

mesoscópica fluorescencia tomografía por en vivo imágenes de desarrollo drosophila</em

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizar el desarrollo de la formación de órganos, así como progresión de la enfermedad y el tratamiento a menudo depende en gran medida la capacidad de interrogar ópticamente cambios moleculares y funcionales en los organismos vivos intactos. La mayoría de los métodos ópticos actuales imágenes son inadecuadas para las imágenes en las dimensiones que se encuentran entre los límites de la penetración de la microscopía óptica moderna (0,5-1mm) y los límites impuestos por difusión de macroscopía óptica (&gt; 1 cm) [1]. Por lo tanto, muchos organismos modelo importantes, por ejemplo, los insectos, embriones de animales o en las extremidades de animales pequeños, siguen siendo inaccesibles para los in-vivo de imágenes ópticas. Aunque hay un creciente interés hacia el desarrollo de métodos de resolución de nanómetros de imagen óptica, no ha habido muchos esfuerzos exitosos en el mejoramiento de la profundidad de penetración de imágenes. La capacidad de realizar en vivo de imágenes de microscopía allá de los límites es, de hecho, se reunió con las dificultades asociadas con la dispersión de fotones presentes en los tejidos. Los recientes esfuerzos para embriones toda la imagen, por ejemplo, [2,3] requieren un tratamiento químico especial de la muestra, para borrar de la dispersión, un procedimiento que hace que sean adecuadas sólo para la post-mortem de imágenes. Estos métodos sin embargo la evidencia la necesidad de que las muestras de imágenes más grandes que los que habitualmente se permite el microscopio de dos fotones o confocal, sobre todo en la biología del desarrollo y de descubrimiento de fármacos. Hemos desarrollado una nueva técnica de imagen óptica llamada tomografía de fluorescencia mesoscópicas [4], que apropiado para no invasiva en vivo de imágenes en dimensiones de 1 mm a 5 mm. La resolución del método de intercambios para la profundidad de la penetración, pero ofrece un rendimiento de imagen sin precedentes, tomografía y se ha desarrollado para añadir el tiempo como una nueva dimensión en las observaciones de la biología del desarrollo (y posiblemente otras áreas de la investigación biológica), impartiendo la capacidad de la imagen de la evolución de la fluorescencia etiquetados respuestas a través del tiempo. Como tal, puede acelerar los estudios de las dependencias morfológicos o funcionales de las mutaciones del gen o los estímulos externos, y lo más importante puede capturar la imagen completa del desarrollo o la función del tejido, permitiendo longitudinal lapso de tiempo de visualización del mismo organismo, en desarrollo. La técnica utiliza un microscopio de laboratorio modificados y multi-proyección de la iluminación para recoger datos en las proyecciones de 360 ​​grados. Se aplica la simplificación de Fermi a la solución de Fokker-Planck de la ecuación de transporte de fotones, en combinación con los principios de la óptica geométrica con el fin de construir un plan de inversión realista adecuada para el rango mesoscópico. Esto permite a los in-vivo de todo el cuerpo de visualización de la falta de transparencia de estructuras tridimensionales en las muestras de hasta varios milímetros de tamaño. Hemos demostrado la actuación en vivo de la técnica por imágenes en tres dimensiones de estructuras de desarrollo de los tejidos de Drosophila en vivo y después de la morfogénesis de las alas en la Drosophila pupas opaco en tiempo real de más de seis horas consecutivas.

Mesoscópica fluorescencia tomografía opera más allá de los límites de penetración de los tejidos de seccionamiento microscopía de fluorescencia. La técnica se basa en la iluminación multi-proyección y una descripción del transporte de fotones. Se demuestra en vivo de todo el cuerpo visualización en 3D de la morfogénesis de las buenas prácticas agrarias-que expresa ala discos imaginales en<em&gt; Drosophila melanogaster.</em

Mesoscópica fluorescencia Tomografía por En vivo Imágenes de desarrollo Drosophila</em

La visualización de la formación de órganos en desarrollo, así como de la progresión y el tratamiento de enfermedades, a menudo depende en gran medida de la capacidad de interrogar ópticamente...

Con el fin de realizar las reconstrucciones de órganos en desarrollo en Drosophila melanogaster, es necesario determinar el modelo directo que mejor describa la propagación de la luz dentro de la pupa misma. El procedimiento comienza seleccionando una prepupa blanca y pegándola en el extremo de un tubo capilar de manera que el eje anteroposterior de la prepupa quede orientado paralelo al tubo. Un pequeño tubo capilar se llena con un colorante fluorescente y se inserta en el caso de la pupa.Después de un ajuste cuidadoso del eje, la pupa se rota 360 grados. Se adquieren imágenes en diferentes ángulos. Los datos adquiridos de transiluminación fluorescente se utilizan para determinar el modelo directo que se empleará para imaginar el desarrollo de órganos.Hola, mi nombre es Claudia y estoy en el Centro de Biología Asistencial del Hospital General de Massachusetts, Escuela Médica de Harvard. Soy Ula Petou del Laboratorio Paramount de la Escuela Médica de Harvard, y soy Daniel Rozanski del Instituto de Imagen Biológica y Médica de la Universidad Técnica de Múnich y del Centro Heliman Múnich. Hoy les mostraremos un procedimiento para la reconstrucción tridimensional de todo el cuerpo en

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Investigación

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Biology

Biología

Hemocitos Drosophila se dispersan sobre la totalidad del embrión en desarrollo. Este protocolo demuestra cómo montar y la imagen de estas migraciones el uso de embriones con hemocitos marcados con fluorescencia.

Imágenes en directo de Drosophila melanogaster Migraciones hemocitos embrionarias

Source: Hellerman, M. B., et al. Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye. J. Vis. Exp. (2015)El video muestra una técnica de imagen en vivo para estudiar el patrón de ojos en una pupa de Drosophila melanogaster. Los marcadores marcados con proteína fluorescente verde (GFP) permiten la visualización de la organización y diferenciación celular durante la formación de la estructura ocular en desarrollo.

Imágenes en vivo del ojo de la pupa de Drosophila mediante microscopía de fluorescencia

El método de tomate / GFP-FLP / FRT implica la visualización de las células fotorreceptoras de mosaico en Drosophila que viven. Se puede utilizar para seguir destinos celulares de los fotorreceptores individuales en la retina durante días o semanas. Este método es ideal para los estudios de degeneración de la retina y enfermedades neurodegenerativas o el desarrollo de las células fotorreceptoras.

El tomate / GFP-FLP / FRT Método para imágenes en vivo del mosaico adultos<em&gt; Drosophila</em&gt; Las células fotorreceptoras

En este trabajo se demuestra el uso de un microscopio confocal de barrido rápido de comportamiento de las células de imagen directamente a través de la pupa. Al dejar el caso de pupa intacta, este método permite la observación y medición de los procesos dinámicos de célula en una etapa de desarrollo de Drosophila que es difícil de estudiar directamente.

Imaging A través de la envoltura pupal de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

La inmunotinción es una técnica eficaz para visualizar tipos específicos de células y proteínas dentro de los tejidos. Al utilizar la sonicación, el protocolo descrito aquí alivia la necesidad de diseccionar tejidos de Drosophila melanogaster de embriones y larvas en fase avanzada antes de la inmunotinción. Proporcionamos una metodología eficiente para la inmunotinción de larvas enteras fijadas en formaldehído.

La sonicación-facilitado Inmunofluorescencia tinción de etapa tardía embrionario y larval<em&gt; Drosophila</em&gt; Tejidos<em&gt; In Situ</em

Este protocolo presenta un método eficiente para obtener imágenes del neuroepitelio vivo del ojo de la pupa de Drosophila. Este método compensa el movimiento del tejido y la topología irregular, mejora la visualización de los límites celulares mediante el uso de múltiples proteínas de unión marcadas con GFP y utiliza un equipo de imágenes fácil de ensamblar.

Live-proyección de imagen de la Drosophila Pupal Ojo

Este protocolo describe un método detallado para el cultivo a largo plazo ex vivo y de formación de imágenes en vivo de un disco imaginal Drosophila. Esto demuestra la diferenciación de los fotorreceptores y la rotación ommatidial dentro del período de 10 horas de imágenes en vivo del ojo de disco. El protocolo es simple y no requiere instalación costosa.

A largo plazo de imágenes en vivo<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco de ojos

Aquí ilustramos cómo sola molécula de microscopía de localización foto-activado puede llevarse a cabo en la terminal del nervio motor de un vivo Drosophila melanogaster tercer instar de la larva.

En Vivo Una sola molécula de seguimiento en la Terminal presináptica del nervio Motor del Drosophila

Se presenta un protocolo que permite la visualización de Drosophila melanogaster intacta en cualquier etapa de desarrollo mediante tomografía microinformada.

Imágenes en animales enteros de Drosophila melanogaster mediante tomografía microcomputada

En el embrión temprano de Drosophila , muchos orgánulos son móviles. En principio, se pueden obtener imágenes en vivo a través de sondas fluorescentes específicas, pero la cáscara del huevo impide la aplicación directa al embrión. Este protocolo describe cómo introducir tales sondas a través de la microinyección, y luego analizar el movimiento de orgánulos a granel a través de la velocimetría de imagen de partículas.

Visualización del tráfico dependiente de citoesqueletos de orgánulos que contienen lípidos en embriones de Drosophila

Aquí, se describen métodos no invasivos para la localización de proteínas de membrana fotorreceptoras y la evaluación de la degeneración retiniana en el ojo compuesto de Drosophila utilizando fluorescencia eGFP.

Estudio del tráfico de proteínas de membrana en células fotorreceptoras de Drosophila utilizando proteínas marcadas con eGFP

Aprende tomografía de fluorescencia mesoscópica para visualización 3D in vivo de discos imaginales alares GFP en Drosophila melanogaster. Esta técnica supera los límites de la microscopía tradicional mediante iluminación multiproyección.

Mesoscópica fluorescencia Tomografía por En vivo Imágenes de desarrollo Drosophila

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