Mesoscópica fluorescencia Tomografía por En vivo Imágenes de desarrollo Drosophila

Con el fin de realizar las reconstrucciones de los órganos en desarrollo dentro de la Drosophila melanogaster, necesitamos determinar el modelo avanzado que mejor describa la propagación de la luz dentro de la propia pupa. El procedimiento comienza con la selección de una prepupa blanca y su pegado en el extremo de un tubo capilar de modo que el eje anteroposterior de la pupa quede orientado paralelo al tubo. Un pequeño tubo capilar se llena con un poco de tinte fluorescente y se inserta en el estuche de la pupila.

Después de un cuidadoso ajuste del eje, la pupa se gira 360 grados. Las imágenes se adquieren desde diferentes ángulos. Los datos adquiridos de iluminación fluorescente trans se utilizan para determinar el modelo directo que se utilizará para obtener imágenes del desarrollo de órganos.

Hola, mi nombre es Claudia y estoy en el Centro de Biología de Asistencia del Hospital General de Massachusetts, Facultad de Medicina de Harvard. Soy Ula Petou del Laboratorio Paramount de la Facultad de Medicina de Harvard, y soy Daniel Rozanski del Instituto de Imágenes Biológicas y Médicas de la Universidad Técnica de Múnich y del Centro Heliman de Múnich. Hoy te mostraremos un procedimiento para la reconstrucción tridimensional de todo el cuerpo en Oph Melano Casta.

Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para la visualización in vivo del desarrollo de los órganos durante el estado de la pupila. Así que comencemos antes de comenzar. Tenga en cuenta que no hay un video adjunto que deba verse antes de este, donde se explican algunos aspectos técnicos de la tomografía de proyección óptica con mayor detalle de lo que están aquí.

Además, el otro video explica la obtención de imágenes de tejidos preparados u órganos de animales más grandes. Para todos los experimentos tratados en este vídeo, se utilizarán transgenes de Drosophila forjados. Se trata de la EL A gal cuatro expresada en las glándulas salivales, apteris gal cuatro, que se expresa en los tejidos precursores larvarios del ala adulta y del tórax, el transgén que produce la proteína fluorescente.

En respuesta a la gal cuatro llamada U-A-S-G-F-P y la blanca 1118, los machos de control no fluorescentes portadores de los transgenes UAS se cruzan con hembras vírgenes portadoras de los cuatro transgenes GAL para obtener tejido. La expresión específica de los cruzamientos de GFP se establece de ocho a 10 hembras y machos vírgenes en medios de mosca estándar con una pizca de levadura de panadería. En la superficie, los viales se alojan a 25 grados centígrados en una incubadora humidificada bajo un ciclo de luz y oscuridad de 12 horas.

Dos días después de la iniciación del cruce, los padres se transfieren a un vial nuevo y cinco o seis días después, PUI comenzará a poblar el frasco blanco PrepU. Se selecciona I para la expresión de GFP bajo un osciloscopio de disección fluorescente. La selección de pre pui blancos asegura una estadificación adecuada de los animales, ya que permanecen blancos durante aproximadamente una hora.

Después de la pupilación, se vuelven pigmentados o parduscos. Los GFP que expresan pui se recogen suavemente de los viales con un pincel húmedo y se colocan en una gota de agua o PBS en una placa de Petri, deben limpiarse de materiales autofluorescentes. Con el pincel, ahora deberían estar listos para la tomografía de imágenes.

Si la PrepU I necesita continuar envejeciendo para llegar a la etapa de desarrollo correcta, se pueden dejar en una placa de Petri con una toalla de papel húmeda o en un vial de comida limpio. Esto asegurará una humedad suficiente y un desarrollo adecuado para la obtención de imágenes. El PrepU debe estar adherido al interior de un tubo capilar de vidrio de 800 micras de diámetro.

Pinta el extremo posterior de la pupila con superpegamento y orienta la superficie pegada de la prepupa en el tubo de modo que el acceso anterior posterior de la mosca sea paralelo al tubo. La parte anterior del animal sobrevolará el tubo capilar. El tubo capilar ahora está fijado en la etapa rotacional del microscopio.

En posición vertical, ajuste el eje de inclinación de la etapa de rotación para que el eje de rotación del tubo esté en paralelo con las columnas de píxeles del CCD de imágenes. Una vez ajustada la posición de la mosca, proceda con la toma de imágenes. En este ejemplo, los animales con glándulas salivales fluorescentes deben ser fotografiados para que la expresión de GFP en sus glándulas salivales se pueda generar a partir de un cruce entre las cepas EAG cuatro y U-A-S-G-F-P.

Comenzamos con una pre pupa montada, iluminamos la pre pupa con un haz de excitación y recogemos la señal fluorescente GFP. En la transiluminación, gire la PrepU 360 grados a lo largo de su eje vertical y adquiera las imágenes de iluminación trans. Cada imagen corresponde a 10 grados de rotación.

El tiempo total de adquisición depende de la cantidad de fluorescencia y de la intensidad del haz de excitación. Los tiempos típicos son del orden de un minuto. En este ejemplo, se obtendrá una imagen de una pupa DSO que expresa GFP en los discos imaginales de las alas.

Esta pupa se puede recolectar de un frasco de un cruce entre Aus GAL four y U-A-S-G-F-P. La pre pupa se monta como se ha descrito anteriormente. Sin embargo, dado que el tiempo de imagen para este experimento es de aproximadamente ocho horas, es fundamental que el ambiente permanezca húmedo y a temperatura ambiente. Para evitar la deshidratación y la muerte del animal, se coloca un obturador sobre el haz de excitación para evitar el enfriamiento de los cuatro florales en el tejido de interés, así como para garantizar que el animal no se queme con el rayo láser como antes. iluminar con el haz de excitación y recoger la señal fluorescente GFP mediante iluminación trans.

La pre pupa está completamente rotada a lo largo de su eje vertical. Durante la recopilación de datos, la rotación dura solo un minuto y se repite en diferentes intervalos de tiempo. Para crear una serie de imágenes de las alas durante el desarrollo, los datos se pueden adquirir durante al menos seis horas a una velocidad de 100 imágenes por hora.

Es vital que la exposición total a la luz se controle con este obturador para evitar daños o fotoblanqueo. Esta película muestra imágenes adquiridas entre la etapa de PrepU y la aversión a la cabeza de los alumnos. Al reconstruir la imagen tridimensional, hay una fuerte dispersión hacia adelante que debe tenerse en cuenta, que no se puede aproximar por difusión.

Por lo tanto, para hacer la reconstrucción se debe determinar un modelo de dispersión hacia adelante de la propagación de la luz. Para simplificar, descuidamos la absorción. La cantidad de dispersión se prueba experimentalmente. Para hacer esto, se inserta un objeto extraño con fluorescencia estandarizada en la pre pupa blanca no fluorescente 1118, que luego se escanea para generar los datos del modelo hacia adelante comenzando llenando un tubo capilar de sílice de 100 micras con tinte fluorescente PS 5.5.

Usando la acción capilar, empuje el tubo capilar dentro de la pupa en un ángulo de 45 grados con respecto al eje anterior, monte el PrepU en un tubo capilar y colóquelo adecuadamente en la etapa giratoria como se describió anteriormente. Ahora ilumine la pre pupa con un rayo láser de excitación con una lente de apertura numérica baja y recoja imágenes fluorescentes de iluminación trans de la pre pupa. Como se ha descrito anteriormente, se utiliza el software MATLAB para ajustar los datos en el modelo teórico explícito hacia adelante. Para facilitar el proceso de reconstrucción, se selecciona la aproximación firme e a la ecuación de transporte, ya que describe el régimen de dispersión hacia delante y también se ajusta a los datos experimentales.

Una vez determinado el modelo de avance correcto, podemos reconstruir las glándulas salivales y obtener las reconstrucciones tomográficas time lapse. Si planea utilizar una tomografía de espacio libre, también se pueden configurar algoritmos de configuración para la coincidencia de índices. En primer lugar, mostramos una reconstrucción en 3D de las glándulas salivales en las primeras etapas de desarrollo.

A modo de comparación, la tinción histológica de las glándulas salivales muestra que las reconstrucciones se correlacionan bien con la histología. Esta película de lapso de tiempo del desarrollo de los discos imaginales de las alas se adquirió a partir de un solo espécimen vivo. A modo de comparación, la tinción histológica del disco del ala en los mismos puntos de tiempo muestra que las reconstrucciones se correlacionan bien con la histología.

Acabamos de mostrarte cómo construir un sistema para obtener imágenes de estructuras tridimensionales dentro de oph in vivo, y a lo largo del tiempo. Esto permite seguirnos, la morfogénesis en Drosophila, y seguir el desarrollo de las alas durante seis horas consecutivas. Al realizar este procedimiento, es crucial elegir el modelo de avance correcto para la propagación de la luz dentro de drosophila.

Este método se puede utilizar en combinación con técnicas histológicas para arrojar luz sobre el desarrollo de los órganos durante las etapas de la pupila óptica, y se puede modificar para el estudio de diferentes organismos de tamaño similar. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.