Name: El aislamiento y la derivación de células embrionarias de ratón Germinal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 1 s
Description: Aprende a aislar células germinales primordiales de embriones de ratón a 10,5-11,5 días post coitum. Este protocolo permite estudiar la diferenciación celular con aplicaciones en investigación del cáncer y la infertilidad.

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Los autores desean agradecer la ayuda inestimable de: Dr. Neal First y Kourtney Wilkinson manuscrito de edición, Dr. Lucy Senter, Dr. Brigit Willeford y Mike Basett de ayuda con el cuidado y entrenamiento de los animales en las instalaciones de MSU ALAC ratón acreditados, el Dr. Dwayne Sabio por su ayuda con la microscopía y la captura de imágenes, César Monroy, Swoope Hannah, y Bobbie Huddleston por su ayuda en la producción de vídeo en la MSU. Esta investigación fue financiada por la Oficina de Investigación Institucional y el Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad Estatal de Mississippi.

Parte 1: La laparotomía ratón embarazadas <ol><li> Por dislocación cervical, la eutanasia a una mujer embarazada ratón C57BL6J femenina en 10,5-11,5 DPC. </li><li> Limpia el abdomen con jabón antiséptico, y luego, se le exige. </li><li> Después de afeitarse, lavar el abdomen con una solución salina. </li><li> A continuación, seque el abdomen con una gasa estéril. </li><li> Cubrir el ratón con un campo estéril. </li><li> Haga una incisión ventral con las pinzas y tijeras de disección. </li><li> Identificar y eliminar todo el útero de la cavidad abdominal. Embriones de ratón será visible en el interior del útero. </li><li> Transferencia al útero en una placa Petri llena con D-PBS, y mantener en hielo. </li><li> Con un bisturí estéril y pinzas, extraer la placenta y extra tejidos embrionarios de cada embrión. </li><li> La transferencia de embriones en una nueva placa de Petri llena de D-PBS. </li><li> Medir la longitud de los embriones de ratón. Encontramos que el tamaño difiere según la edad del embrión. Por ejemplo 8,5 dpc medido en un promedio de 6 mm, 10,5 dpc medido en un promedio de 11 mm, y el 12,5 dpc medido en un promedio de 16 mm. </li><li> Luego, quite la cola para la extracción de ADN. </li></ol> Parte 2: Disección cresta gonadal Bajo microscopio estereoscópico y Fuente de luz Schott Fostec <ol><li> Coloque un papel de filtro en una placa de Petri. Luego, coloque el embrión de ratón en la parte superior del papel de filtro para secar el embrión e inmovilizar a la disección. </li><li> Con un bisturí estéril, hacer un corte transversal del embrión de ratón por encima del origen del cordón umbilical. </li><li> Bajo un microscopio estereoscópico, utilizando unas pinzas finas estéril y una aguja estéril burla fina, quitar los intestinos y el hígado para que el aparato urinario esté visible. Los riñones están situados lateralmente en la cavidad abdominal, y la vejiga se encuentra medial y caudal en comparación con los riñones. El embrión puede ser identificado como masculino porque las crestas gonadales se encuentran a ambos lados de la vejiga. En la mujer, las crestas gonadales están firmemente sujeto al extremo caudal lateral de los riñones. </li><li> Pelar la cresta gonadal a cabo por el deslizamiento de una aguja detrás de él. La cresta gonadal se elimina cortando los tejidos que la sostienen. </li><li> Transferencia de las crestas gonadales a una nueva placa de Petri llena de frescos D-PBS. Microscópicamente, la cresta gonadal masculino debe ser despojado, grandes y ovalados. Por el contrario, la cresta gonadal femenino debe ser visto, tienen forma alargada y ser más pequeño en comparación con la cresta gonadal masculino. </li></ol> Parte 3: La digestión cresta gonadal Bajo microscopio estereoscópico: <ol><li> Disección mesonefros: Separar la gónada del mesonefros y el canto con una aguja fina y afilada. <ul><li> Es importante eliminar el mesonefros de la cresta gonadal, ya que es un tejido somático, que crecen en exceso en el proceso de derivación PGC. </li></ul></li><li> La digestión cresta gonadal: Recoger limpia crestas gonadales en una gota de agua dulce 0.5ul D-PBS. Añadir 20 ml de colagenasa / Dispasa solución (concentración final en 1mg/ml). <ul><li> Los embriones deben ser tratados individualmente. Cada embrión debe tener su propio plato de petri separados y etiquetados. </li></ul></li><li> Gonadal canto Picado: Corte la cresta gonadal en trozos pequeños con una aguja estéril y estéril pinzas finas N º 4. </li><li> Incubación: placas de Petri se transfieren a una incubadora a 37 ° C durante 15 minutos. <ul><li> El tiempo de incubación puede variar entre los tejidos. </li></ul></li><li> Pipeteo: Después de 15 minutos, el tejido se puede disociar con pipeta. Utilizando sacó pipetas capilares de vidrio con un diámetro entre 40 mm -100 Romper las piezas pipeteando arriba y hacia abajo. Esto formará pequeños grupos. La transferencia de los macizos de 0,5 ml de una pre calentado D-PBS caída de un lavado final. </li><li> Después del lavado, la transferencia de los grupos a los tubos eppendorf. <ul><li> No más de exponer el tejido de la colagenasa. </li><li> No haga una suspensión de células individuales. Esto es importante para la formación de colonias. Si se trata de una suspensión de células individuales, PGCs tienden a diferenciar y migrar. </li><li> Este proceso no debe ser superior a 20 minutos, o sus células pierden su viabilidad. </li></ul></li><li> Centrifugar a 2000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Después de centrifugar, separar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 0,5 ml de golpear complementado con los medios de comunicación (pre-calentado a 37 ° C). </li></ol> Parte 4: Cultura células germinales primordiales "Usted debe realizar los siguientes pasos rápidamente para preservar la viabilidad de PGCs para el aislamiento y la derivación. <ol><li> 24 horas antes de este proceso debe preparar una mitóticamente inactivadas MEF-CF1 alimentador de capa, siguiendo el protocolo de Zhang J. et al 2008. <ul><li> Preparar 20 platos de un pregnant hembra del ratón (6-8 embriones). </li><li> MEFs perder la capacidad de ser una capa de alimentación (promover el crecimiento y evitar la diferenciación) después de 5-6 pasajes. </li><li> No use más de 48 horas MEFs. </li></ul></li><li> Inmediatamente antes de PGCs recubrimiento, el medio MEF debe retiran lentamente de la capa de alimentación MEF. </li><li> A continuación, añadir 0,5 ml / pocillo de pre-calentado medio suplementado por nocaut en la capa de alimentación MEF. <ul><li> MEF medios de comunicación contiene suero bovino fetal al que induce la diferenciación de PGCs. </li><li> Medio de octavos de final debe ser complementado con factores de crecimiento específico de especie inmediatamente antes de su uso para asegurar la actividad del factor de crecimiento. </li></ul></li><li> Mediante la distribución simétrica, PGCs placa sobre la capa de alimentación MEF. <ul><li> Si estas piezas están muy cerca, que tienden a agruparse y hacer densas colonias que se adhieren mal o comienzan a diferenciarse. </li><li> Placas de cultivo deben ser etiquetados con el nombre de embrión línea celular germinal, el número de pases, y la fecha. </li></ul></li><li> Con cuidado, la transferencia de las placas de cultivo en una incubadora a 37 ° C y 5% CO 2. </li><li> Monitor de las células cada 24 horas. </li><li> Después de 48 horas, eliminar 250 ml de los medios de comunicación de la parte superior de la cultura para no molestar a la adhesión de la colonia. A continuación, añadir 250 ml de agua dulce complementado knock-out medios de comunicación (pre-calentado a 37 ° C). </li><li> Después del paso 7, esperar otras 48 horas, y luego, eliminar por completo todos los medios de comunicación y sustituirlo por nuevos medios de comunicación complementado knock-out (pre-calentado a 37 ° C). Haga esto cada dos días durante 8-10 días hasta el PGC formar colonias. </li></ol> Parte 5: embrionario las células germinales <ol><li> Después de 10 días de aislamiento PGC, colonias de células germinales embrionarias se forman. </li><li> Líneas de células germinales embrionarias se mantiene vivo gracias a pasajes manual de cada 8-10 días. Siguen presentando una morfología indiferenciada y expresan marcadores de pluripotencialidad como alkalyne fosfatasa, Oct-4, SSEA-1 y Sox-2 </li></ol> Notas <ul><li> Condiciones de esterilidad / asepsia son esenciales en la sala de la cultura. </li><li> Para la derivación y la cultura, PGCs se procesan en un gabinete de seguridad Clase II purificador Bio. </li><li> Incubaciones se encuentran en una húmeda 37 ° C y 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Todos los medios y los reactivos son filtrados antes de su uso en un filtro de 0,2 um, se almacenan a 4 ° C, y pre-calentado a 37 ° C antes de su uso. </li><li> Durante los pasos de la disección, todos los embriones y los tejidos se debe mantener en hielo. </li><li> Todos los frascos de reactivos deben descontaminarse con etanol antes de colocar en un armario. </li><li> El uso de guantes, bata de laboratorio, y las tapas de la enfermera son obligatorios. </li></ul> Conclusión Hemos proporcionado un video que muestra cómo aislar, se derivan, y la cultura de las células germinales embrionarias a partir de las crestas gonadales de 10.5-11.5 embriones de ratón DPC. El aislamiento reproducibles y la cultura a largo plazo de las líneas de células germinales embrionarias proporciona una base fundamental para el estudio del desarrollo embrionario temprano, los patrones germinal genética y epigenética, la formación de las gónadas, los efectos ambientales de los órganos circundantes durante el proceso de desarrollo de la gametogénesis en los embriones masculinos y femeninos, y la determinación de las vías que conduce al cáncer e infertilidad. <img src="/files/ftp_upload/1635/1635figure1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1">

<ol><li>DeFelici, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDeFelici%2C+M+%22Cell+Biology%3A+A+laboratory+Handbook%22">Cell Biology: A laboratory Handbook</a>. 1, Second Edition, 73-85 (1998).</li>
<li>Donovan, P. J., De Miguel, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+Germ+Cells+into+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+and+Development%22%5BJournal%5D)">Turning Germ Cells into Stem Cells.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 13, 463-471 (2003).</li>
<li>Labosky, P. A., Hogan, B. L. M. Part 12: Mouse Primordial Germ Cells: isolation and in vitro culture. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLabosky%2C+PA+%22Molecular+embryology%3A+methods+and+protocols%22">Molecular embryology: methods and protocols</a>. Sharp, P. T., Mason, I. 97, Humana Press. Totowa, NJ. (1999).</li>
<li>Mc Laren, A., Southee, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+of+Mouse+Embryonic+Germ+Cells+into+Meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Entry of Mouse Embryonic Germ Cells into Meiosis.</a> Developmental Biology. 187, 107-113 (1997).</li>
<li>Yoshimizu, T., Obinata, M., Matsui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+tissue+and+cell+interactions+play+key+roles+in+mouse+germ+cell+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stage-specific tissue and cell interactions play key roles in mouse germ cell specification.</a> Development. 128, 481-490 (2001).</li>
<li>Zhang, J., Hhvorostov, I., Teitell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+MEFs+to+Matrigel+I%3A+Passaging+hESCs+in+the+Presence+of+MEFs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
</ol>

Esta investigación se llevó a cabo después de la revisión y el animal de Atención Institucional y el empleo Comisión (IACUC) la aprobación de nuestro protocolo de ratón # 08030 (el papel del oxígeno de especies reactivas-ROS en el desarrollo de la línea germinal y la formación de tumores: mantener y criar protocolo) en la Universidad Estatal de Mississippi.

Pinzas N º 14 y 15, 35 mm de bisturí, tijeras de disección, campos quirúrgicos, jabón antiséptico, solución salina al 0,9%, la gasa, el contenedor de hielo de espuma, cuchilla de afeitar, bisturí de 35 mm, pinzas finas N º 4 y 5, con aguja fina con bromas mango, hojas de papel filtro, y tiró de pipetas de vidrio.<br /<br /&gt; Equipo: microscopio estereoscópico de disección, la fuente de luz Schott Fostec, microscopio invertido, micropipeta 10 y 200ul, centrífuga, el gabinete de seguridad biológica.

el aislamiento y la derivación de células embrionarias de ratón germinal

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

La capacidad de las células germinales embrionarias (EG) a diferenciarse en células germinales primordiales (PGC) y más tarde en los gametos durante las primeras etapas de desarrollo es un modelo perfecto para hacer frente a nuestra hipótesis sobre el cáncer y la infertilidad. Este protocolo se muestra la forma de aislar las células germinales primordiales de las gónadas en desarrollo en 10.5-11.5 días después de embriones de ratón coitum (dpc). El desarrollo de las crestas gonadales de embriones de ratón (C57BL6J) se disocian por rotura mecánica con colagenasa, está chapada en una capa de fibroblastos de embriones de ratón de alimentación (MEF-CF1) que antes era mitóticamente inactivados con mitomicina C en la presencia de los medios de octavos de final y que será completada con un inhibidor de la leucemia Factor (LIF), el factor de crecimiento de fibroblastos (bFGF), y factor de células madre (SCF). El uso de estos métodos optimizados para la identificación del PCG, el aislamiento, y el establecimiento de condiciones de cultivo permite que las culturas a largo plazo de las células EG de más de 40 días. Las líneas embrionarias germinales de células mostró fenotipo embrionario y la expresión de marcadores utilizados común del estado pluripotente. El aislamiento y la derivación de células germinales en la cultura una herramienta para entender su desarrollo in vitro y ofrece la oportunidad de controlar el daño acumulado en los niveles genéticos y epigenéticos que después de la exposición al estrés oxidativo.

La capacidad de las células germinales embrionarias a diferenciarse en células germinales primordiales durante etapas tempranas del desarrollo es un modelo perfecto para hacer frente a nuestra hipótesis sobre el cáncer y la infertilidad. Este protocolo se muestra la forma de aislar las células germinales primordiales de las gónadas en desarrollo de embriones de 10.5 a 11.5 días después de ratón coitum.

El aislamiento y la derivación de células embrionarias de ratón Germinal

La capacidad de las células germinales embrionarias (EG) para diferenciarse en células germinales primordiales (PGC) y, posteriormente, en gametos durante el desarrollo temprano...

Hola, mi nombre es Har Moreno del Laboratorio de Genética Reproductiva y Células Madre de la Universidad Estatal de Mississippi. Hola, mi nombre es Clara St. También del laboratorio de genética reproductiva y células madre de la Universidad Estatal de Mississippi. Las células germinales primordiales o PGC son las precursoras de los ovocitos y los espermatozoides en el ovario y los testículos, respectivamente.En embriones de ratón, las CPG migran desde el intestino posterior y a través de la cresta genital entre los 8,5 y 9,5 días. Las CPG llegan posteriormente a la cresta genital entre los 10,5 y 11,5 días.Las células TA migran posteriormente y comienzan a formar el segmento gonadal en la hembra D. Las cs pg migran hacia el extremo lateral del riñón para iniciar la formación del segmento gonadal femenino. En contraste, en el macho las PGC migran hacia ambos lados de la vejiga.Para comenzar la formación. Las células germinales masculinas de alridge son un excelente modelo de investigación para estudiar las vías del desarrollo onic en presencia de estrés oxidativo como causa de infertilidad y cáncer. Así que comencemos.Hoy les mostraremos cómo recolectar y aislar células C PV de crestas gonadales en desarrollo en embriones de ratón postum de 10,5 a 11,5 días. Las crestas gonadales se disocian mediante destrucción mecánica para ser implantadas sobre una capa de fibroblastos embrionarios de boca de embrión. Después de 10 días de cultivo en condiciones optimizadas, las colonias germinales embrionarias mostrarán fenotipos embrionarios. Además, tras varios pases, pueden identificarse por su expresión de marcadores de pluripotencia.Se necesitan los siguientes materiales para este paso de disección estéril: paquete que contiene campos estériles, pinzas, tijeras, hojas de bisturí, jabones antimicrobianos, soluciones salinas, placa de Petri llena con PBS Pep sobre hielo y gasa, una hembra preñada de cepa BL6 de cinco a siete semanas de gestación entre los días 10,5 y 11, que se sacrifica mediante dislocación cervical. Limpie el abdomen con jabón antimicrobiano y luego afeite la zona.Lave el abdomen utilizando soluciones salinas. Séquelo con una gasa estéril. Cubra el ratón con un nuevo campo estéril.Realice una incisión ventral utilizando fórceps y tijeras de disección. Identifique y extraiga todo el útero de la cavidad abdominal. Los embriones se verán a simple vista dentro del útero.Muy cuidadosamente. Pase a través de los ligamentos que aún están adheridos al cuerno uterino. Complete la disección realizando un corte transversal a lo largo de la vagina.Transcriba el útero a una placa de Petri y séllela con GPVS; manténgala en hielo. Separe los tejidos extraembrionarios de los embriones bucales. Utilice un escalpelo y una pinza estériles.Transfiera los embriones de boca a una placa de Petri fresca llena con DPBS. Longitud medible del embrión de boca. Encontramos que los tamaños variaban según la edad del embrión.Por ejemplo, 8,5 días posteriores al apareamiento midieron en promedio seis milímetros, 10,5 días posteriores al apareamiento midieron en promedio 11 milímetros y 12,5 días posteriores al apareamiento midieron en promedio 16 milímetros. Retire sus colas mediante la extracción de ADN. Los siguientes materiales son necesarios para la disección: microscopio estereoscópico, cabina de seguridad biológica, PDS y bisturí estéril.Pinzas finas estériles, aguja fina estéril para separación con mango, discos de papel de filtro para placa de Petri. Coloque un papel de filtro en una placa de Petri y luego coloque el embrión de la boca encima del papel de filtro para secar el embrión e inmovilizarlo para la disección. Utilizando un escalpelo estéril, realice un corte transversal en el embrión de la boca por encima del origen del cordón umbilical bajo un microscopio estereoscópico.Utilizando pinzas finas estériles y una aguja estéril de disección fina, retire los intestinos y el hígado para que el sistema urinario quede visible. La vejiga se encuentra en un plano medial.El embrión puede identificarse como macho porque los puentes gonadales se encuentran a ambos lados de la vejiga. Con pinzas finas estériles y una aguja fina estéril, retire la cresta gonadal derecha del macho cortando el tejido que la sostiene. Utilice el mismo procedimiento para eliminar la cresta genital izquierda del macho.Transfiera ambas crestas genitales masculinas a una pequeña placa de Petri que contenga DPDS fresco microscópicamente. Puede visualizar la cresta gonadal masculina adherida al mesonefros. Las crestas gonadales masculinas deben verse grandes y de forma ovalada bajo un microscopio estereoscópico.Retire los intestinos utilizando pinzas finas estériles y una aguja de separación fina estéril. Los riñones se encuentran ubicados lateralmente en la cavidad abdominal, y la vejiga se sitúa más medial y caudal en comparación con el riñón. La cresta gonadal femenina es diferente de la cresta gonadal masculina debido a su morfología y ubicación anatómica.Las crestas gonadales femeninas están firmemente unidas al extremo lateral caudal del riñón. Utilizando pinzas finas estériles y una aguja fina estéril, retire la cresta gonadal femenina izquierda cortando los tejidos que la sujetan al riñón.Repita el mismo procedimiento para eliminar la cresta gonadal femenina derecha. Transfiera ambas crestas genitales femeninas a un pequeño plato de Petri que contenga PDS fresco microscópicamente. Puede visualizar la cresta gonadal masculina adherida al Neso Nera.Estas crestas genitales femeninas deben identificarse por su forma alargada y ser más pequeñas en comparación con las crestas genitales masculinas, utilizando agujas estériles, finas y afiladas. Separe las crestas genitales femeninas del meso y otros tejidos somáticos utilizando agujas estériles, finas y afiladas. Separe las crestas genitales masculinas del meso neros y otros tejidos somáticos.Es importante extraer el mesodermo de la cresta genital porque es un tejido somático que se sobrecrecerá durante el proceso de derivación de las células germinales primordiales. Recolecte la cresta gonadal en una gota de 0,5 microlitros de DPVS fresco con soluciones de colagenasa. Bajo microscopios estereoscópicos, los tejidos gonadales se cortan en pequeños fragmentos utilizando agujas estériles finas y afiladas.Las placas de Petri se transfieren a un incubador a 37 grados Celsius durante 15 minutos. Después de 15 minutos, el tejido puede disociarse mediante pipeteo utilizando pipetas capilares de vidrio estiradas con diámetros diferentes entre 40 y cien micrones. Desintegre los fragmentos mediante pipeteo ascendente y descendente.Esto formará pequeños grumos. Estos pequeños grumos se lavan con 0,5 microlitros de DPDX tras el lavado. Luego se transfieren a cubos Eend a 2000 RPM durante cinco minutos.A temperatura ambiente tras la centrifugación, se elimina el sobrenadante y el precipitado se resuspende en 0,5 mililitros de medio knockout suplementado, libre de suero, precalentado a 37 grados Celsius durante 24 horas. Antes de este proceso, debe preparar una capa alimentadora de fibroblastos embrionarios de ratón inactivados por calor, línea CCF, inmediatamente antes de sembrar las CPG. El medio debe eliminarse de la capa alimentadora preparada.Luego, agregue punto mililitros del medio knockout suplementado previamente calentado a 37 grados Celsius sobre la capa alimentadora de met. Bajo microscopios estereoscópicos y utilizando una distribución simétrica, pequeñas porciones de PT GC se siembran sobre las capas alimentadoras de met. Si estos fragmentos están cercanos, tienden a agregarse y formar colonias densas que se adhieren mal o comienzan a diferenciarse en cultivo.Los cultivos deben etiquetarse con el nombre de la línea de células germinales embrionarias, el número de pase y la fecha. Transfiera cuidadosamente las placas de cultivo a un incubador a 37 grados Celsius y 5% CO₂. Después de 10 días posteriores al aislamiento, puede identificar colonias de células germinales embrionarias basándose en su morfología característica. Además, después del primer pase, pueden identificarse por su expresión de marcadores de pluripotencia como la fosfatasa alcalina, OP cuatro, SSEA uno y Sox dos.Hoy nos unimos a ustedes para mostrar cómo colectar y cultivar células germinales embrionarias a partir de CPG entre los 10,5 y 11,5 días postcoito en ratón. La caracterización de las células germinales embrionarias como precursoras de las células germinales es esencial para comprender los procesos relacionados con la gametogénesis, la fertilidad y el cáncer.Gracias por ver nuestro video. Buena suerte en su experimento.

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Este video muestra un protocolo para aislar y cultivar células de la corteza cerebral primaria del telencéfalo dorsolateral de embriones de ratón.

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En los últimos años la formación de las células germinales que utilizan en los métodos de cultivo in vitro se ha demostrado usando varios tipos diferentes de células madre somáticas. En este artículo se presentará visualmente la diferenciación de las células madre derivadas de ratones recién nacidos a principios de células ovocitos similares.

La diferenciación de ratón recién nacido piel derivados de las células madre en células germinales-como<em&gt; In vitro</em

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