Modelado de la colitis murino utilizando sulfato de dextrano sódico (DSS)
19 de enero de 2010
De sodio de sulfato de dextrano (DSS), administrada en el agua potable es un modelo murino estableció una lesión inflamatoria de la colitis aguda. Este protocolo describe el método para el tratamiento de DSS y la preparación de los tejidos.
A los ratones se les administra DSS al 3 % a voluntad durante cuatro días. Mientras se registra diariamente el peso y la presencia de diarrea y sangre en las heces, el DSS se sustituye por agua esterilizada en autoclave después del cuarto día. Tras tres días con agua, los ratones son sacrificados y se les extraen los colones.
Los colones se miden y pesan. Luego, los colones se enrollan en forma de rollos suizos o se preparan como salchichas y se examinan bajo un microscopio. Este artículo en video demostrará la recolección y el procesamiento de colones en un modelo murino de colitis.
Este procedimiento se utiliza para estudiar la colitis en el laboratorio del Dr. Christopher Williams del Departamento de Biología del Cáncer de la Universidad de Vanderbilt, antes de iniciar el tratamiento con sulfato de dextrina sódica. Se obtienen pesos basales a lo largo del experimento. Se toman pesos diarios después de pesar a los ratones, preparando una solución al 3 % peso por volumen de sulfato de dextrina sódica, o DSS, en agua.
El DSS debe tener un peso molecular bajo para que este modelo sea efectivo; prepare suficiente solución de DSS para llenar una botella de agua para cada jaula de ratones y filtre la solución mediante un filtro de acetato de celulosa de 0,45 micrómetros. Reemplace la botella de agua de bebida en la jaula de los ratones por una botella que contenga una solución de DSS al 3 %. Si su institución utiliza un sistema automatizado de suministro de agua, coloque puntas de exclusión en las boquillas de agua para asegurarse de que los ratones no tengan acceso a ninguna otra fuente de agua.
Después de cuatro días, los ratones se pesan nuevamente para cuantificar las consecuencias sistémicas de la colitis. La pérdida de peso es común tras una lesión grave, sin embargo, puede no ser evidente hasta varios días después. En el día cuatro, sustituya la solución de DSS por agua durante tres días adicionales para permitir una cierta recuperación del epitelio colónico.
Tres días después, el día siete, se vuelve a pesar a los ratones. A continuación, se puede extraer el colon de los ratones sacrificados como se muestra en la siguiente sección. Para extraer el colon, exponga el lado ventral del ratón sacrificado para asegurar un acceso sin obstáculos al abdomen.
Humedezca completamente el abdomen con etanol al 70 %. Sujete la línea media del abdomen con pinzas para tejidos y levántela. De esta manera, levante la piel utilizando tijeras de punta fina.
Haga una incisión en el abdomen para exponer el contenido abdominal. Extienda la incisión hasta la punta del proceso xifoides en la línea media y luego a lo largo de la parte inferior de los márgenes costales bilateralmente. Identifique el intestino delgado, el ciego y el colon.
Disecar cuidadosamente el colon del mesenterio circundante o separarlo con delicadeza. A continuación, seccionar el colon para profundizar en la pelvis y liberar el colon distal del recto.
Se debe tener cuidado para que no se corte ninguna arteria ni vena. Además, tenga en cuenta que el colon puede romperse fácilmente. Por lo tanto, retire suavemente el colon del mesenterio.
Seccione el colon en el margen de la secuela colónica para liberar el colon proximal. Retire el colon en su totalidad y, utilizando una aguja de alimentación de calibre 20 y una jeringa de 10 mililitros, intubule y lave el colon con PBS frío con hielo hasta que el EIT esté completamente libre de heces. Es importante mantener la orientación correcta del colon conservando el extremo distal del colon más cercano a usted.
Comience midiendo la longitud del colon utilizando un calibre digital. La longitud del colon es otro indicador de la gravedad de la lesión. La colitis aumenta el edema y acorta la longitud total del colon.
En este momento, los colones recolectados pueden procesarse como salchichas para análisis macroscópico o convertirse en rollos suizos para análisis histológico de la colitis aguda. Demostraremos estas técnicas en las siguientes secciones para procesar el colon como una salchicha. Para el análisis macroscópico de todo el colon, es importante mantener la orientación correcta del colon. Por lo tanto, mantenga el extremo distal del colon más cercano a usted.
Corte dos trozos de sutura no absorbible, uno de aproximadamente una pulgada de longitud y el otro de dos pulgadas de longitud. Utilice el trozo de sutura de dos pulgadas para ligar el extremo distal del colon lo más cerca posible del margen, manteniendo aún así un buen sellado. Luego, introduzca una aguja de alimentación de calibre 20 que contenga cinco mililitros de formalina fosfato tamponada al 10% en el extremo proximal del colon.
Amarre ligeramente el trozo restante de sutura inmediatamente proximal a la ampolla de la aguja de alimentación. Ahora sujete firmemente el colon en la ampolla de la aguja de alimentación e infunda una cantidad suficiente de formalina asegurándose de que el colon se expanda. Apriete el nudo de la sutura mientras retira la aguja de alimentación, dejando así el colon expandido infusionado.
Como si fuera un embutido, llene un tubo cónico de 15 mililitros con formalina tamponada al 10 % con fosfato y etiquete el tubo. Coloque el colon en el tubo y fíjelo durante 24 horas. Después de 24 horas, vierta la formalina en un recipiente adecuado para desechos y sustitúyala con etanol al 70 % durante 24 horas adicionales.
Los colones pueden almacenarse indefinidamente en etanol al 70 % a temperatura ambiente. Cuando esté listo para analizar el colon, retírelo del tubo cónico. Corte los hilos en cada extremo con un escalpelo, teniendo cuidado de no dañar el colon.
Recuerde que el extremo distal tiene el trozo de cuerda más largo. Corte el colon longitudinalmente desde el extremo distal hasta el proximal para que forme una lámina alargada. Ahora el colon puede observarse bajo un microscopio estereoscópico.
Corte el colon longitudinalmente y extiéndalo como una lámina plana. Para enrollar el colon se requieren dos pares de fórceps y una técnica con ambas manos. Sujete con los fórceps ambos bordes laterales del margen distal del colon y proceda a enrollarlo secuencialmente mediante rotación y liberación de los fórceps hacia el margen proximal, generando así una espiral con una tercera dimensión o rollo suizo.
Si el colon se adhiere al papel Watman, humedezca el papel y el colon con una pequeña cantidad de PBS para mantener la forma. Sujete firmemente el rollo con pinzas y seccione con una aguja de calibre 27 y medio. Fije el rollo doblando la aguja mientras sale del mismo.
Ahora, coloque el rollo en un casete de tejido etiquetado y coloque el casete en un frasco con formalina tamponada al 10% en fosfato. Deje a temperatura ambiente durante 24 horas para fijar el tejido. Después de 24 horas, vierta la formalina y sustitúyala con etanol al 70% durante un tiempo adicional de cuatro horas.
Los colones pueden almacenarse indefinidamente en etanol al 70% a temperatura ambiente. Este modelo permite al investigador obtener, fijar y analizar los colones, posibilitando así el análisis de la gravedad de la colitis. Para el análisis macroscópico de todo el colon, el colon puede procesarse como un embutido que se infunde con formalina y se expande completamente.
La porción abierta del embutido debe quedar plana. Si el método del embutido se ha realizado correctamente, el colon fijado estará dilatado y toda la superficie mucosa se podrá manipular y observar fácilmente bajo el microscopio estereoscópico. Para el análisis histológico, el colon puede procesarse en forma de rollo suizo.
El rollo se asegura con una aguja y se coloca en un casete de tejido para su fijación. Cuando el rollo se corta y monta, debe formar una sección representativa de todo el colon si se ha enrollado correctamente; las secciones del rollo suizo pueden teñirse con hematina y ASIN para determinar el grado de lesión colónica. Recuerde que el extremo distal del colon se encuentra en el centro del rollo sobre el portaobjetos.
En este ejemplo, la inflamación y el daño criptal son evidentes en el colon tratado con DSS en comparación con un control tratado con agua. Acabamos de mostrarle cómo cosechar y procesar colones a partir de un modelo murino de colitis aguda. Al realizar este procedimiento, es importante que esté bien organizado antes de sacrificar al animal.
Los ratones, por ejemplo, tienen todos los tubos y casetes etiquetados para cada ratón, y todas las herramientas y reactivos fácilmente disponibles. Además, mantenga registros detallados del peso de los ratones y de la longitud del colon. Finalmente, asegúrese de haber asignado suficiente tiempo para el procesamiento.
Por lo general, toma 15 minutos por ratón para un principiante y de seis a ocho minutos para alguien con más experiencia en esta técnica.
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Descripción general
Este artículo presenta un protocolo para utilizar sulfato de dextrano sódico (DSS) con el fin de inducir colitis aguda en un modelo murino. El método incluye la administración de DSS en el agua de bebida y la posterior preparación de tejidos para su análisis.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Investigación sobre colitis
- Modelos murinos
Antecedentes
- El DSS es un modelo bien establecido para estudiar la enfermedad inflamatoria intestinal.
- El modelo permite examinar los cambios en el tejido colónico.
- Comprender los mecanismos de la colitis puede ayudar en el desarrollo de tratamientos.
- Este protocolo estandariza el proceso de tratamiento con DSS.
Objetivo del estudio
- Demostrar el método para inducir colitis en ratones.
- Describir la preparación del tejido para el examen histológico.
- Ofrecer una guía visual para investigadores.
Métodos Utilizados
- A los ratones se les administra DSS al 3 % en el agua de bebida durante cuatro días.
- Se monitorean diariamente el peso, la diarrea y la presencia de sangre en las heces.
- Después de cuatro días, el DSS se sustituye por agua autoclavada.
- Los colones se extraen tras tres días de consumo de agua y se preparan para su análisis.
Resultados principales
- Los colones se miden y pesan tras la eutanasia.
- El tejido se procesa en rollos suizos o salchichas para microscopía.
- El protocolo permite obtener resultados consistentes entre experimentos.
- La documentación visual ayuda a comprender el procedimiento.
Conclusiones
- El modelo de DSS es efectivo para estudiar la colitis aguda.
- Los métodos estandarizados mejoran la reproducibilidad en la investigación.
- Este protocolo sirve como un recurso valioso para los investigadores.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El modelo de colitis inducida por DSS en ratones proporciona un sistema estandarizado y reproducible para estudiar la fisiopatología de la enfermedad inflamatoria intestinal, permitiendo la validación de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas en el descubrimiento preclínico. Al cuantificar la pérdida de peso, el acortamiento del colon y el daño histológico, el modelo aporta confianza predictiva en la evaluación de candidatos terapéuticos. Este flujo de trabajo sitúa el ensayo como un sistema relevante para la enfermedad, útil en las etapas iniciales para la selección de carteras y los esfuerzos de identificación de compuestos líderes en líneas de I+D enfocadas en gastroenterología.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la alteración de la barrera epitelial y la cuantificación de la respuesta inmunitaria.
- Valor operativo: Apoya la reducción de riesgos biológicos al modelar la lesión colónica aguda y la dinámica de reparación en un fondo genético controlado.
- Valor estratégico: Facilita la evaluación de la confianza en el blanco mediante puntos finales medibles como la longitud del colon, el cambio de peso y la puntuación histológica.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Prepara tejido colorrectal validado para el análisis posterior de la función de barrera, la liberación de citoquinas y la infiltración inmunitaria.
- Valor operativo: Estandariza el procesamiento del tejido mediante la preparación en rollo suizo o en forma de salchicha, asegurando cortes y tinciones reproducibles para la evaluación histológica.
- Valor estratégico: Permite obtener lecturas cuantitativas escalables para el cribado de compuestos en sistemas relevantes para la colitis.
Investigación Translacional y Preclínica
- Valor científico: Modela el daño epitelial y la respuesta inflamatoria relevantes para la enfermedad, alineándose con la fisiopatología de la colitis ulcerosa.
- Valor operativo: Facilita la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al proporcionar una arquitectura tisular consistente para el análisis.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de avance con ajuste de riesgo al vincular la lesión histológica con resultados funcionales como diarrea y sangre fecal.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El modelo de colitis por DSS se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos prometedores y la evaluación preclínica de la eficacia, proporcionando un sistema relevante para la enfermedad que permite obtener información mecanicista y realizar cribados terapéuticos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la prueba de hipótesis sobre la integridad epitelial y la modulación inmune mediante la cuantificación del daño y la reparación colónica.
- Selección: Ofrece disponibilidad del ensayo mediante la recolección, procesamiento y análisis histológico estandarizados del colon, con puntos finales medibles.
- Análisis: Proporciona resultados cuantitativos, incluyendo la longitud del colon, la pérdida de peso, la puntuación de sangre en heces y el daño histológico, para comparaciones entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica mediante un modelado reproducible de las fases de colitis aguda y de reparación, relevantes para los tratamientos de la enfermedad inflamatoria intestinal.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma basada en histología reutilizable para evaluar múltiples dianas terapéuticas en la inflamación gastrointestinal.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de objetivos mediante conocimientos mecanicistas sobre el daño epitelial y las cascadas inflamatorias.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad del procesamiento y análisis de tejidos en cohortes experimentales.
- Valor estratégico: Mejora en las decisiones de avance o interrupción mediante puntos finales histológicos y funcionales objetivos, reduciendo el riesgo biológico en fases tardías.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo basada en métricas cuantitativas de lesión y reparación en un modelo validado de colitis.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de ratones, preparación de la solución de DSS y técnica estéril para mantener la fidelidad del modelo.
- Depende de instrumentación que incluye calibradores digitales, agujas de alimentación, jeringas y microtomos para el procesamiento de tejidos.
- Necesita una estandarización entre equipos de la concentración de DSS, duración de la exposición y períodos de recuperación para obtener resultados reproducibles.
- Implica consideraciones de adaptación para diferentes cepas de ratones, peso molecular del DSS y protocolos cíclicos para modelar colitis aguda frente a crónica.
- Incluye limitaciones prácticas, como la variabilidad en la respuesta individual de los ratones y la necesidad de puntuación histológica ciega para minimizar el sesgo.
Preguntas frecuentes sobre biofarmacia
Chapters in this video
0:00
Title
0:52
Injury-Repair Colitis Model
0:34
Introduction
2:06
Harvesting the Colon
4:04
Processing as "Sausages" for Macroscopic Analysis of the Entire Colon
7:00
Acute Colitis in the Dextran Sulfate Sodium Model
5:52
Making "Swiss Rolls for the Histological Analysis of Acute Colitis
7:59
Conclusion
