Modelado de la colitis murino utilizando sulfato de dextrano sódico (DSS)

A los ratones se les administra un 3% de DSS en la libido durante cuatro días. Mientras que el peso y la presencia de diarrea y sangre fecal se registran diariamente, el SST se reemplaza por agua de autoclave después del cuarto día. Después de tres días en el agua, los ratones son sacrificados y se les extirpa el colon.

Los puntos se miden y pesan. Luego, los colones se forman en rollos suizos o salchichas y se examinan bajo un microscopio. Este artículo de video demostrará la recolección y el procesamiento de colones en un modelo murn de colitis.

Este procedimiento se utiliza para estudiar la colitis en el laboratorio del Dr. Christopher Williams del Departamento de Biología del Cáncer de la Universidad de Vanderbilt antes de comenzar el tratamiento con sulfato de dextrina sódica. Los pesos de referencia se obtienen a lo largo del transcurso del experimento. Los pesos diarios se toman después de que se han pesado los ratones, hacen una solución de sal de sodio de sulfato de dextrina al 3% por volumen o DSS en agua.

El DSS debe ser de un peso molecular bajo para que este modelo sea efectivo, hacer suficiente solución DSS para llenar una botella de agua por cada jaula de ratones y filtrar la solución con un filtro de acetato de celulosa de 0,45 micrómetros. Reemplace la botella de agua potable en la jaula del ratón con una botella que contenga una solución 3%DSS. Si su institución utiliza un sistema de riego automatizado, coloque consejos de exclusión en los surtidores de riego para asegurarse de que los ratones no tengan acceso a ninguna otra fuente de agua.

Después de cuatro días, los ratones se pesan de nuevo para cuantificar las consecuencias sistémicas de la colitis. La pérdida de peso es común con lesiones graves, sin embargo, puede no ser evidente durante varios días más en el mismo día. Al cuarto día, reemplace la solución DSS con agua durante tres días adicionales para permitir cierta recuperación del epitelio colónico.

Tres días después, al séptimo día, se vuelve a pesar a los ratones. Luego, se puede recolectar el colon de los ratones sacrificados como se muestra en la siguiente sección. Para extraer el colon, exponga el lado ventral del ratón sacrificado para garantizar un acceso sin obstrucciones al abdomen.

Humedecer completamente el abdomen con etanol al 70%. Agarre la línea media del abdomen con pinzas de tejido y elévelo. De este modo, se cubre la piel con tijeras de punta fina.

Incidir el abdomen para exponer el contenido abdominal. Extienda la incisión hasta la punta de la apófisis xifoides en la línea media y luego extienda bilateralmente a lo largo de la cara inferior de los márgenes costales. Identifica el intestino delgado, el ciego y el colon.

Diseccionar cuidadosamente, cortar el colon del mesenterio circundante. Después de eso, atraviese el colon y profundice la pelvis para liberarla. El colon distal desde el recto.

Se debe tener cuidado para que no se corten arterias ni venas. Además, tenga en cuenta que el colon puede desgarrarse fácilmente. Por lo tanto, retire suavemente el colon del mesenterio.

Transectar el colon en el margen de la secuela de la colona para liberar el colon proximal. Extraiga el colon y el total con una aguja de alimentación de calibre 20 y una jeringa de 10 mililitros para intubar y enjuague el colon con PBS helado hasta que el EIT esté completamente libre de heces. Es importante mantener la orientación correcta del colon manteniendo el extremo distal del colon más cerca de usted.

Comience midiendo la longitud del colon con un calibrador digital. La longitud del colon es otro indicador de la gravedad de la lesión. La colitis aumenta el edema y acorta la longitud total del colon.

En este punto, los colones cosechados pueden procesarse como salchichas para el análisis macroscópico o convertirse en panecillos suizos para el análisis histológico de la colitis aguda. Demostraremos estas técnicas en las siguientes secciones para procesar el colon como una salchicha Para el análisis macroscópico de todo el colon, es importante mantener la orientación correcta del colon. Por lo tanto, mantenga el extremo distal del colon más cerca de usted.

Corte dos piezas de sutura no absorbible, una de aproximadamente una pulgada de largo y la otra de dos pulgadas de largo. Use el trozo de sutura de dos pulgadas para atar el extremo distal del colon lo más cerca posible del margen mientras mantiene un buen sellado. A continuación, coloque una aguja de alimentación de calibre 20 que contenga cinco mililitros de fosfato de formol tamponado al 10% en el extremo proximal del colon.

Ate sin apretar el trozo restante de sutura inmediatamente proximal al bulbo de la aguja de alimentación. Ahora agarre el colon firmemente en el bulbo de la aguja de alimentación e infunda una cantidad suficiente de formalina, asegurándose de que el colon se expanda. Apriete el nudo en la sutura a medida que retira la aguja de alimentación, dejando así el colon expandido infundido.

Como salchicha, llene un tubo cónico de 15 mililitros con 10% tamponado, formal y fosfato, y etiquete el tubo. Coloque el colon en la sonda y fíjelo durante 24 horas. Después de 24 horas, vierta la formina en un contenedor de residuos adecuado y reemplácelo con etanol al 70% durante 24 horas adicionales.

Los colones se pueden almacenar en etanol al 70% indefinidamente a temperatura ambiente. Cuando esté listo para analizar el colon, retírelo del tubo cónico. Corta las cuerdas de cada extremo con un bisturí teniendo cuidado de no dañar el colon.

Recuerda que el extremo distal tiene el trozo más largo de cuerda. Corta el colon longitudinalmente desde el extremo distal hasta el proximal para que forme una hoja larga. El colon ahora se puede ver bajo un microscopio de disección.

Corta el colon longitudinalmente y extiéndelo como una hoja plana. Rodar el colon requiere dos pares de pinzas y una técnica de dos manos. Agarrando ambos bordes laterales del margen distal del colon con pinzas se procede a rodar secuencialmente el colon girando y soltando las pinzas procediendo hacia el margen proximal, generando así una espiral con una tercera dimensión o rollo suizo.

Si los dos puntos se adhieren al papel watman, humedezca el papel y los dos puntos con una pequeña cantidad de PBS para mantener la forma. Sujete el rollo firmemente con pinzas y transecte con una aguja de calibre 27 y medio. Asegure el rollo doblando la aguja a medida que sale del rollo.

Ahora, coloque el rollo en un casete de papel tisú etiquetado y coloque el casete en un frasco de fosfato de formalina tamponado al 10%. Déjalo a temperatura ambiente durante 24 horas para fijar el tejido. Después de 24 horas, vierta la formalina y reemplácela con etanol al 70% durante cuatro horas adicionales.

Los colones se pueden almacenar en etanol al 70% indefinidamente a temperatura ambiente. Este modelo permite al investigador obtener, fijar y analizar colones, lo que permite analizar la gravedad de la colitis. Para el análisis macroscópico de todo el colon, el colon se puede procesar como una salchicha infundida con formalina y completamente expandida.

La salchicha abierta debe quedar plana. Si el método de la salchicha se ha realizado correctamente, el colon fijo se dilatará y toda la superficie de la mucosa se puede manipular fácilmente y observar bajo el microscopio de disección. Para el análisis histológico, el colon se puede procesar como un rollo suizo.

El rollo se asegura con una aguja y se coloca en un casete de papel para su fijación. Cuando el rollo se corta y se monta, debe formar una rebanada representativa de todo el colon si se enrolla correctamente, las secciones del rollo suizo se pueden teñir con hematina y ASIN para determinar el alcance de la lesión colónica. Recordemos que el extremo distal del colon está en el centro del rollo en el portaobjetos.

En este ejemplo, la inflamación y el daño de las criptas son evidentes en el colon tratado con DSS en comparación con un control tratado con agua. Acabamos de mostrarle cómo recolectar y procesar colones a partir de un modelo murino de colitis aguda. Al realizar este procedimiento, es importante que esté bien organizado antes de sacrificarse.

Los ratones, por ejemplo, tienen todos los tubos y casetes etiquetados para cada ratón y todas las herramientas y reactivos disponibles. Además, mantenga registros detallados del peso del ratón y la longitud del colon. Por último, asegúrese de haber asignado suficiente tiempo para el procesamiento.

Por lo general, se tarda 15 minutos por ratón para un novato y de seis a ocho minutos para alguien más experimentado en esta técnica.