Utilizando el sistema de electroporación Gene Emisores MXcell para transfectar células primarias con alta eficiencia

El objetivo general de este protocolo es identificar las condiciones óptimas de electrotransferencia para transfectar líneas celulares primarias utilizando fibroblastos embrionarios de ratón o mfs. Como ejemplo, las células MF y el ácido nucleico de elección se cargan en una placa de electrotransferencia de 96 pocillos conectada al sistema de células Gene Pulser MX, lo que permite probar múltiples condiciones de electrotransferencia en un solo ensayo. Para experimentos de optimización, las células se cultivan tras la electrotransferencia y se analiza su eficiencia de transfección.

Utilizando microscopía de fluorescencia epi y citometría de flujo, pueden seleccionarse entonces las condiciones de electroforesis más eficientes para futuras transfecciones. Hola, soy Adam McCoy, científico sénior en la División de Expresión Génica de BioRad Laboratories. Hoy les mostraré un procedimiento para identificar fácilmente las mejores condiciones de electroforesis para transfectar líneas celulares primarias.

Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la expresión génica en estas células. Hoy utilizaré tres números de pasaje diferentes de MEF o fibroblastos embrionarios de ratón. Utilizo cultivos con diferentes números de pasaje por dos razones.

Primero, mostraré qué tan importante es la salud celular. Con líneas celulares primarias, incluso unos pocos días adicionales en cultivo pueden marcar la diferencia en la eficiencia de la transfección. Segundo, quiero demostrar que el proceso de identificación de las mejores condiciones es el mismo, aunque la eficiencia de la transfección disminuya con las células más viejas. Es probable que su experimento no implique células de diferentes edades.

Puede seguir el mismo procedimiento con su propio diseño experimental. Si desea comparar la expresión génica en células control y tratadas, primero puede encontrar las mejores condiciones y luego realizar su experimento utilizando las condiciones que haya identificado. O bien, puede realizar su optimización y experimento conjuntamente.

Como demostraré hoy, utilizaré un plásmido que codifica GFP para evaluar la eficiencia de transfección mediante citometría de flujo. Sin embargo, el procedimiento de electroforesis sería el mismo aunque realice algo diferente, como introducir irna y analizar la expresión génica mediante PCR en tiempo real. Así que comencemos.

Los fibroblastos embrionarios de ratón, o mets, utilizados en este protocolo son células adherentes. Por lo tanto, el primer paso al trabajar con estas células consiste en desprenderlas del fondo del frasco mediante protocolos estándar de cultivo de tejidos que implican la tripsinización. Una vez que las células se han desprendido del frasco, neutralice la tripsina con medio que contenga suero y recoja las células en tubos cónicos de 50 mililitros.

Una vez recogidas por centrifugación, las células después de que se hayan formado el pellet. Deben lavarse mediante resuspensión, suspendiéndolas en un volumen conocido de PBS. Una vez completamente resuspendidas, cuente las células teniendo en cuenta que se necesitará una concentración de 1 millón de células por mililitro para los experimentos de electroforesis.

Calcule el número apropiado de células según el recuento celular y transfiéralas a un tubo limpio. Centrifugue más tiempo para obtener el sedimento celular. Luego, retire cuidadosamente el sobrenadante.

Re-suspender las células en tampón de electroforesis a una concentración de un millón de células por mililitro y añadir 20 microgramos por mililitro del plásmido. Las placas se dividen en 96 pocillos con columnas etiquetadas del uno al 12 y filas de la A a la H; cada conjunto de cuatro pocillos, o grupo de pocillos, comparte un par de placas de electrodo, de modo que las células en esos pocillos experimentan el mismo impulso. Por ejemplo, las células en los pocillos 1A, 1B, 1C y 1D están conectadas eléctricamente en un solo grupo de pocillos y recibirían todas el mismo impulso.

El siguiente conjunto de cuatro pozos, A, B, C y D, recibiría todos el segundo pulso cuando se inicie el protocolo, aunque los parámetros puedan ser los mismos. La placa de electroforesis de 96 pozos también está configurada de modo que la mitad superior e inferior de la placa estén divididas. Así, los pozos E1, F1, G1 y H1 en la parte inferior de la placa reciben un pulso, pero distinto al pulso recibido por los pozos A1, B1, C1 y D1 en la parte superior.

En este experimento, solo se utilizará la mitad de la placa. Los tres primeros pocillos de cada conjunto de pocillos contienen células de diferentes edades. Las células en la fila superior, fila A, han sido pasajeadas cinco veces.

Las células en la fila B han sido pasajeadas nueve veces y las células en la fila C han sido pasajeadas 13 veces. La fila D contiene solo tampón de electrotransferencia antes de la electrotransferencia. Es recomendable verificar su protocolo para asegurarse de que los ajustes sean correctos.

Este protocolo entregará seis pulsos de decaimiento exponencial seguidos por seis pulsos de onda cuadrada. Los pulsos de decaimiento exponencial aumentan de 200 voltios a 450 voltios y todos utilizan únicamente 350 microferretes. Debido a la baja resistencia del tampón de pulsos genéticos o de electropermeabilización que se está utilizando.

Los pulsos de onda cuadrada varían tanto en voltaje como en duración del pulso. La configuración de capacitancia del instrumento debe ajustarse a la conductancia de la mezcla de electropermeabilización. Si se utiliza un tampón de mayor resistencia para la electropermeabilización, como DMEM, podría usarse el mismo rango de voltaje, pero con una capacitancia mayor, como 950 microferrets para los pulsos de decaimiento exponencial.

Si no se conoce la capacitancia óptima del tampón que está utilizando, también deberá variar la capacitancia en las condiciones de electroforesis que está probando. El siguiente paso consiste en cargar 150 microlitros de la mezcla de células y plásmido en cada pocillo que se utilice para este experimento. El cuarto pocillo de cada conjunto de pocillos que se utilicen se llena con tampón de electroforesis.

Después de cargar la placa, colóquela en la cámara de la placa MXL y cierre la tapa. Luego, pulse el botón de pulso para electropermeabilizar las células. El electropermeabilizador entrega los pulsos eléctricos secuencialmente a cada pozo según las condiciones especificadas en el protocolo elegido.

Se tardan unos segundos en electroprayar todas las células. Una vez que el pulso ha finalizado, retire la placa de la cámara de placas mixta. Transfiera las células de cada pocillo a un recipiente de cultivo que contenga medio de cultivo precalentado.

Estas células mes se cultivan en DMEM suplementado con 10 %FBS; las muestras de control que no han sido electro poradas se toman de la mezcla restante de células y plásmido y se añaden a las placas de cultivo que contienen el cultivo previamente preparado. Medio de la misma composición que el utilizado con las células electro poradas. Finalmente, agitar en vórtice.

Luego, golpee suavemente la placa para distribuir las células antes de colocarla en el incubador durante 24 horas a 37 grados Celsius, 5 % de dióxido de carbono, antes de analizar la eficiencia de transfección e identificar cuáles condiciones de electroforesis son las mejores para su experimento. Una vez identificadas las condiciones óptimas de electroforesis, existen dos métodos de electroforesis entre los que elegir para experimentos futuros. El investigador puede optar por seguir cultivando células en placas de 96 pocillos o cultivar células en cubetas, una muestra a la vez.

Las cubetas solo pueden analizar una muestra a la vez y requieren cuatro veces el volumen necesario para un pocillo de las placas de 96 pocillos, pero las cubetas individuales son menos costosas y fáciles de usar cuando se necesita un número pequeño de muestras. El sistema Gene Pulse o MX Cell está diseñado para que se puedan utilizar los mismos parámetros de electroforesis en placas y cubetas en este momento. En lugar de la cámara de placa, utilice el pod de choque MXL para cubetas.

Desconecte la cámara de placas de la parte trasera del instrumento y conecte el módulo de choque. Dado que el módulo de choque solo aplica el pulso programado para el conjunto de pocillos A, B, C, D uno, puede ser necesario seleccionar un programa diferente. Para seleccionar un programa guardado previamente, presione inicio.

Luego seleccione la opción tres, protocolos de usuario. Si ya se encuentra en la carpeta de usuario correcta, presione enter para seleccionar los protocolos de usuario y desplácese hacia abajo. Para resaltar el programa correcto, presione enter para seleccionar dicho programa.

El instrumento ya está listo. Una vez seleccionado el programa, prepare las cubetas. La mezcla de plásmido y MEFs se prepara de la misma manera que se mostró anteriormente.

Cargue cada vet de 0,4 centímetros con el mismo volumen utilizado para un conjunto completo de pocillos. En las placas de 96 pocillos. Dado que un conjunto de pocillos consta de cuatro pocillos y se utilizaron 150 microlitros de tampón o mezcla celular por pocillo, se emplearon 600 microlitros de la mezcla celular con plásmido por vet.

A continuación, coloque el vial en la cámara de la cápsula de choque, presione pulso para entregar el choque eléctrico a las células. Después de la electro poración, continúe como en el método de placa: mezcle las células y luego transfiera alícuotas a placas de cultivo celular llenas con medio precalentado como control. Agite suavemente la placa y golpee las pozas que no fueron electro poradas.

Luego, deje que las células se recuperen durante 24 horas a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono antes de analizar la eficiencia de transfección tras transfectar las células y permitirles recuperarse. Analice la eficiencia de transfección cualitativamente mediante microscopía de fluorescencia epiescopia y cuantitativamente mediante citometría de flujo. Las células que han sido electro poradas con éxito y que ahora expresan el gen GFP aparecen verdes al microscopio de fluorescencia epiescopia; aquí se muestra un resultado típico satisfactorio. Observar las células en contraste de fases permite visualizar tanto las células transfectadas como las no transfectadas.

Se muestran aquí las células que fueron expuestas al pulso de electropermeabilización de voltaje más bajo a 200 voltios. Las células son en gran parte confluentes debido a la alta densidad celular. El mismo campo de visión bajo fluorescencia epiescopia muestra que varias células están expresando el marcador GFP, aunque estas representan solo un pequeño porcentaje de las células visibles en la imagen anterior a 250 voltios.

El número total de células vivas observadas mediante contraste de fase disminuye ligeramente bajo fluorescencia epiluminiscente. Podemos observar que el número de células que expresan GFP ha aumentado con el voltaje más alto aplicado, 375 voltios. Hay menos células vivas visibles, sin embargo, un alto porcentaje de las células restantes están expresando GFP.

La condición óptima depende del diseño experimental. En algunos experimentos, la mayor cantidad de células transfectadas podría ser óptima. En otros experimentos, el porcentaje más alto de transfección podría ser lo mejor.

Estamos interesados en el porcentaje de células que son positivas para GFP en cada condición y en cómo varían estos porcentajes según el flujo de edad celular. La citometría puede proporcionar información cuantitativa sobre los resultados de la transfección bajo cada una de las diferentes condiciones de electroforesis. Aquí se muestran el porcentaje de células que son positivas para GFP en el paso celular.

Cinco células. Bajo cada una de las 12 condiciones de electropermeabilización, el porcentaje máximo de transfección fue aproximadamente del 80 % bajo el decaimiento exponencial de voltaje más alto. La condición de pulso seis y 70 bajo el pulso cuadrado más fuerte probado, condición 12, con las células pasadas nueve veces antes de la electropermeabilización.

El patrón general del porcentaje de transfección es casi idéntico, pero con una ligera disminución en los porcentajes de transfección mostrados. A continuación se indican los porcentajes de células GFP en las células del pase 13, que muestran una disminución notable en el porcentaje de transfección en comparación con las células más jóvenes. Los porcentajes más altos de transfección fueron aproximadamente la mitad de los obtenidos con las células más jóvenes, lo que demuestra la importancia de utilizar células sanas lo más pronto posible después del aislamiento.

Acabo de mostrarle cómo utilizar el sistema de electrotransferencia MXL para identificar las condiciones óptimas para mapas de electrosondado o para otras líneas celulares primarias. Al realizar este procedimiento, es importante recordar usar células sanas lo antes posible tras su aislamiento y emplear condiciones de electrotransferencia que coincidan con el tampón de electrotransferencia. Eso es todo.

Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.