Name: שימוש גין Pulser מערכת MXcell electroporation כדי Transfect תאים ראשוניים עם יעילות גבוהה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-07T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: למדו אופטימיזציה של תנאי אלקטרופורציה לתאי פיברובלסט עובריים של עכברים (MEFs) באמצעות מערכת Gene Pulser MXcell. פרוטוקול זה מאפשר בדיקה מהירה של מספר תנאים ומספק טיפים לפתרון בעיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1) תא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת שימוש בתאי חסיד, יש צורך trypsinize לאסוף את התאים לפני electroporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשוות transfection בין ארבעת עובריים בעכבר פיברובלסטים (MEF) תרבויות, המייצג שלושה מספרים מעבר שונות, לבצע את הפעולות הבאות על כל בקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את תרבות התקשורת הסלולרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף PBS לשטוף את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS; להוסיף טריפסין מספיק כדי לכסות תאים, לחכות כמה דקות כדי לאפשר טריפסין לנתק את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק צלוחיות עם מיקרוסקופ כדי לוודא את מצבם של התאים, הרואין בקבוק לנתק את התאים, ולאחר מכן לבדוק שוב בקבוק להפוך תאים בטוח מנותקים מכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכו זמן נוסף וחזור במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כל התאים מנותקים, להוסיף מדיה המכילה סרום לנטרל טריפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת התאים צינור צנטריפוגות, ותאי גלולה ידי צנטריפוגה (RCF = 300 XG). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת תאים supernatant ו resuspend בנפח ידוע של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים צינור חדש נפח מתאים של השעיה תאים סלולריים כדי לספק את המספר הדרוש של תאים לניסויים (תצטרך 150 μL של תאים לכל גם בצפיפות של 1 x 10 6 תאים / מ"ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת תאים supernatant ו resuspend בהיקף המתאים חיץ Pulser electroporation ג'ין להשיג צפיפות התאים של 1 x 10 6 תאים / מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 מ"ל של מיקרוגרם לכל פלסמיד ההשעיה תא ומערבבים בעדינות. </li></ol> 2) כלי electroporation ההתקנה electroporation פלייט ההתקנה electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצלחת הכנס לתוך תא מודול את הכוח של מערכת Pulser electroporation MXcell ג'ין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 150 תא תערובת μL או חיץ לתוך בארות צלחת electroporation 96-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים צלחת בתא הצלחת הדופק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת מ קאמרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב על ידי תוכן pipetting למעלה ולמטה גם כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת התאים מבאר כל למאגר מראש התחמם ב 12 גם הצלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש צלחת להפיץ תאים ושמתי אותו בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו תאים להתאושש במשך 24 שעות. </li></ol> קובט ההתקנה electroporation <ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתק קאמרית צלחת ממודול את כוחה של מערכת Pulser MXcell electroporation ג'ין וחבר ב ShockPod ™ קובט קאמרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 600 μL ההשעיה התא לתוך הפער קובט 0.4 ס"מ electroporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים קובט בתא ShockPod ולספק הדופק חשמלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר קובט מבית הבליעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את תוכן קובט ידי pipetting למעלה ולמטה קובט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת התאים מבאר כל למאגר מראש התחמם ב 12 גם הצלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש צלחת להפיץ תאים ושמתי אותו בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו התאים להתאושש במשך 24 שעות. </li></ol> 3) נציג תוצאות לאחר transfecting התאים ומאפשר להם להחלים, לנתח את יעילות transfection איכותית, באמצעות מיקרוסקופ epifluorescent ו כמותית, באמצעות cytometry הזרימה. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. תאים שעברו electroporated בהצלחה וכעת הם המבטאים את הגן GFP מופיעים תחת מיקרוסקופ epifluorescent. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. צופה התאים תחת לעומת השלב מאפשרת ויזואליזציה של תאים הן transfected ו untransfected. אלה הם תאים שנחשפו את הדופק הנמוך ביותר electroporation המתח 200V. התאים ומחוברות בעיקר בשל צפיפות התאים גבוהה. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. אותו שדה הראייה תחת epifluorescence מראה מספר התאים מביעים את סמן ה-GFP, אבל אלה הם רק אחוז קטן של תאים גלויים בתמונה הקודמת. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. בשלב 250V, המספר הכולל של תאים חיים ראה תחת בניגוד שלב ירידות קלות. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig5.jpg" alt="איור 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 5"> איור 5. תחת epifluorescence, אפשר לראות כי מספר התאים GFP להביע גדל. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig6.jpg" alt="איור 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 6"> איור 6. במתח הגבוה ביותר מיושם, 375V, ישנם תאים חיים פחות גלוי. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig7.jpg" alt="איור 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 7"> איור 7. עם זאת, אחוז גדול של התאים הנותרים מביעים GFP. באיזה מצב הוא אופטימלי תלוי בתכנון הניסוי. בניסויים מסוימים את המספר הגדול ביותר של תאים transfected יכול להיות אופטימלי, בניסויים אחרים transfection האחוז הגבוה ביותר עשוי להיות הטוב ביותר. אנו מעוניינים באחוז התאים GFP חיובית בתנאי אחד ואיך באחוזים משתנים עם הגיל התאים. Cytometry זרימת יכולים לספק מידע כמותי על תוצאות transfection תחת כל התנאים electroporation שונים. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig8.jpg" alt="איור 8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 8"> איור 8. כאן את אחוז התאים ה-GFP חיובי במעבר 5 תאים תחת כל אחד מ -12 מצבים electroporation מוצגים. אחוז transfection המרבי היה כ -80% מתחת הדופק הגבוה מתח מעריכי ריקבון, מצב 6, ו -70% תחת הדופק החזק גל מרובע נבדק, מצבו 12. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig9.jpg" alt="איור 9" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 9"> איור 9. תאים עם עבר 9 פעמים לפני electroporation, את הדפוס הכללי של אחוז transfection כמעט זהה, אך עם ירידה קלה מאוד את אחוזי transfection. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig10.jpg" alt="איור 10" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 10"> איור 10. המוצג כאן הם אחוז התאים ה-GFP בקטע 13 תאים אשר מראים ירידה ניכרת באחוז transfection יחסית התאים צעירים יותר. האחוזים הגבוהים ביותר היו transfection כמחצית מה הושג עם תאים צעירים להפגין את החשיבות של שימוש בתאים בריאים מיד לאחר הבידוד ככל האפשר. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="3"> Electroporation תנאי שימוש בתאי MEF transfecting באמצעות Pulser ג'ין MXcell </td></tr><tr><td> מצב (06/01) Decay פולסים מעריכי, כל עם 350 UF, 1000ohm </td><td> מתח (V) </td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 200 </td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td> 250 </td><td></td></tr><tr><td> 3 </td><td> 300 </td><td></td></tr><tr><td> 4 </td><td> 326 </td><td></td></tr><tr><td> 5 </td><td> 350 </td><td></td></tr><tr><td> 6 </td><td> 376 </td><td></td></tr><tr><td> מצב (12/07) כיכר פולסים Wave, כל עם UF 2000, 1000 אוהם, ו 1 הדופק </td><td> מתח (V) </td><td> Pulse Duration (ms) </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 200 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 250 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 9 </td><td> 300 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 200 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> 11 </td><td> 250 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> 12 </td><td> 300 </td><td> 20 </td></tr></tbody></table>

המחברים הם מועסקים על ידי Bio-Rad Laboratories המייצרת ריאגנטים מכשיר שימוש במאמר זה

מאמר זה וידאו מדגים כיצד להשתמש במערכת electroporation MXcell לזהות בקלות electroporation תנאים אופטימליים MEFs או אחר שורות תאים ראשוניים. הפורמט 96-היטב צלחת מאפשר רבים משכפל של תנאי הניסוי או אופטימיזציה להתבצע בו זמנית, אשר יכול לבטל את הצורך בניסויים נפרדים רבים. בעת ביצוע הליך זה, יש לזכור להשתמש בתאים בריאים בהקדם לאחר הבידוד ככל האפשר להשתמש התנאים electroporation כי הם מתאימים למאגר electroporation.

<table><tbody><tr><td>בופר אלקטרופורציה Gene Pulser&amp;#174;</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2676</td><td></td></tr><tr><td>מערכת אלקטרופורציה Gene Pulser MXcell&amp;#8482;</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2670</td><td></td></tr><tr><td>תא קובט Gene Pulser MXcell&amp;#8482; ShockPod&amp;#8482;</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2673</td><td></td></tr><tr><td>מערכת אלקטרופורציה Gene Pulser MXcell&amp;#8482; עם תא קובט ShockPod&amp;#8482;</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2674</td><td></td></tr></tbody></table>

שימוש ג&#39;ין pulser מערכת mxcell electroporation כדי transfect תאים ראשוניים עם יעילות גבוהה

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

זה הופך ברור יותר ויותר כי electroporation היא הדרך היעילה ביותר להציג את ה-DNA או פלסמיד siRNA לתוך תאים ראשוניים. Pulser הגן מערכת MXcell electroporation וג&#39;ין Pulser electroporation חיץ (Bio-Rad) פותחו במיוחד בקלות transfect חומצות גרעין לתאי יונקים קשות transfect תאים, כגון תאים ראשוניים גזע. אנו מדגימים כיצד לבצע ניסוי פשוט לזהות במהירות את התנאים electroporation הטוב ביותר. נדגים איך לנהל מספר דוגמאות באמצעות מגוון של תנאים electroporation כך ניסוי ניתן לבצע באותו זמן כמו אופטימיזציה מבוצעת. אנו גם להראות כיצד תנאים אופטימליים מזוהה באמצעות 96-היטב צלחות electroporation ניתן להשתמש cuvettes electroporation סטנדרטי, הקלת לעבור צלחות electroporation כדי cuvettes electroporation תוך שמירה על יעילות electroporation אותו. בסרטון, אנו ידונו גם כמה גורמי מפתח שיכולים להוביל להצלחה או כישלון של ניסויים electroporation.

הליך זה מראה כיצד להשתמש ג&#39;ין Pulser מערכת MXcell electroporation במהירות ובקלות לזהות את התנאים הטובים ביותר עבור electroporation fibroblasts העכבר עובריים (MEFs) או תאים ראשוניים אחרים. שיקולים לפתרון בעיות הם דנו גם וידאו המשויכת.

שימוש ג&#39;ין Pulser מערכת MXcell electroporation כדי Transfect תאים ראשוניים עם יעילות גבוהה

מתברר יותר ויותר כי אלקטרופורציה היא הדרך היעילה ביותר להחדרת DNA פלסמידי או siRNA לתאים ראשוניים. ה-Gene Pulser...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לזהות את תנאי האלקטרופורציה האופטימליים להחדרה של חומרי גמיות לתאי קו ראשוניים של פיברובלסטים עובריים של עכבר, או mfs. כדוגמה, תאי MF וחומצת הגרעין הנבחרת נטענים לתוך פלטת אלקטרופורציה בעלת 96 בארות המחוברת למערכת ה-gene Pulser MX cell, המאפשרת לבחון מספר תנאי אלקטרופורציה בהרצה אחת. לצורך ניסויי אופטימיזציה, התאים מורבים לאחר האלקטרופורציה, ונבדקים לצורך הערכת יעילות הטרנספקציה.באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית אפי-פלואורסצנטית וציטומטריית זרימה, ניתן לבחור את תנאי האלקטרופורציה היעילים ביותר עבור טרנספקציות עתידיות. שלום, אני אדם מקוי, מדען בכיר במחלקת ביטוי גנים במעבדות BioRad. היום נציג בפניכם פרוצדורה לזיהוי קל של תנאי האלקטרופורציה האופטימליים לטרנספקציה של שורות תאים ראשוניות.אנו משתמשים בנוהל זה במעבדתנו כדי לחקור ביטוי גנים בתאים אלו. היום אשתמש בשלושה מספרים שונים של מעברים של mes או פיברובלסטים עובריים של עכבר. אני משתמש בתרביות עם מספרי מעברים שונים משתי סיבות.ראשית, אראה כמה בריאות התאים חשובה; עם שורות תאים ראשוניים, אפילו ימים בודדים נוספים בתרבית יכולים להשפיע על יעילות הטרנספקציה. שנית, אני רוצה להראות שתהליך זיהוי התנאים האופטימליים הוא זהה, למרות שיעילות הטרנספקציה יורדת בתאים מבוגרים יותר. הניסוי שלכם כנראה לא יכלול תאים בגילאים שונים.ניתן להוסיף את אותו הליך לתכנון הניסוי שלכם. אם ברצונכם להשוות ביטוי גנים בין תאי בקרה לתאים שעברו טיפול, תוכלו תחילה למצוא את התנאים המיטביים ולאחר מכן לבצע את הניסוי באמצעות התנאים שזיהיתם. לחלופין, תוכלו לבצע את האופטימיזציה ואת הניסוי במקביל.כפי שאדגים היום, אשתמש בפלסמיד המקודד ל-GFP כדי לבחון את יעילות הטרנספקציה באמצעות ציטומטריה של זרימה. עם זאת, הליך האלקטרופורציה יהיה זהה גם אם תבצעו פעולה אחרת, כגון הכנסת irna ובחינת ביטוי גנים באמצעות real-time PCR. אז בואו נתחיל.הפיברובלסטים העובריים של העכבר, או MEFs, המשמשים בפרוטוקול זה, הם תאים הדבקים. לכן, השלב הראשון בעבודה עם תאים אלה הוא להסירם מתחתית הבקבוק באמצעות פרוטוקולי תרבית רקמה סטנדרטיים הכוללים טריפסינציה. לאחר שהתאים התנתקו מהבקבוק, נטרלו את הטריפסין באמצעות מצע הכולל סרום ואספו את התאים למבחנות קוניות של 50 מיליליטר.לאחר האיסוף, סובבו את התאים בצנטריפוגה עד לקבלת משקע. יש לשטוף את התאים על ידי ריסוספנזיה (Resuspension) בנפח ידוע של PBS. לאחר הריסוספנזיה המלאה, ספרו את התאים, תוך ידיעה שיהיה דרוש ריכוז של 1 מיליון תאים למיליליטר עבור ניסויי אלקטרופורציה.חשב את מספר התאים המתאים על סמך ספירת התאים והעבר אותם למבחנה נקייה. סבב במערך צנטריפוגה כדי לשקע את התאים. לאחר מכן, הסר בזהירות את העלייה.יש להשעות מחדש את התאים בבuffer אלקטרופורציה לריכוז של 1 מיליון תאים למיליליטר ולהוסיף 20 micrograms למיליליטר של הפלסמיד. הפלטות מחולקות ל-96 בארות עם עמודות המסומנות ב-1 עד 12 ושורות מ-A עד H; כל קבוצה של ארבע בארות, או סט בארות, חולקת זוג פלטות אלקטרודות כך שהתאים בבארות אלו חווים את אותו הפולס. לדוגמה, תאים בבארות 1A, 1B, 1C ו-1D מחוברים חשמלית בסט בארות בודד וכולם יקבלו את אותו הפולס.סט הבא של ארבעה בארות, 2A, 2B, 2C ו-2D, יקבלו את הפולס השני עם תחילת הפרוטוקול. למרות שהפרמטרים עשויים להיות זהים, פלטת האלקטרופורציה בעלת 96 הבארות מוגדרת כך שהחצי העליון והחצי התחתון של הפלטה מחולקים. לכן, בארות 1E, 1F, 1G ו-1H בתחתית הפלטה קיבלו כולן פולס אחד. אך פולס זה נבדל מהפולס שקיבלו בארות 1A, 1B, 1C ו-1D בחלק העליון.בניסוי זה, ייעשה שימוש בחצי מהפלטה בלבד. שלושת הבארות הראשונות בכל קבוצת בארות מכילות תאים בגילאים שונים. התאים בשורה העליונה, שורה A, עברו חמישה מעברים.התאים בשורה B עברו תשעה מעברים והתאים בשורה C עברו 13 מעברים. שורה D מכילה רק בופר אלקטרופורציה לפני ביצוע האלקטרופורציה. מומלץ לבדוק את הפרוטוקול כדי לוודא שההגדרות נכונות.פרוטוקול זה יספק שישה פולסים של דעיכה מעריכית, ולאחריהם שישה פולסים של גלי ריבוע. פולסי הדעיכה המעריכית עולים מ-200 volts ל-450 volts וכולם משתמשים ב-350 micro farads בלבד. זאת בשל ההתנגדות הנמוכה של באפר electroporation או פולס הגנים שבו נעשה שימוש.פולסי גל הריבוע משתנים הן במתח והן במשך הפולס. יש להתאים את הגדרת הקיבול של המכשיר למוליכות של תערובת האלקטרופורציה. אם משתמשים בבופר בעל התנגדות גבוהה יותר לאלקטרופורציה, כגון DMEM, ניתן להשתמש באותו טווח מתחים, אך עם קיבול גבוה יותר, כגון 950 micro farads עבור פולסי דעיכה מעריכית.אם הקיבול האופטימלי של התמיסה המגנה (buffer) שבה אתם משתמשים אינו ידוע, יהיה עליכם לשנות גם את הקיבול בתנאי האלקטרופורציה שאתם בוחנים. השלב הבא הוא טעינת 150 microliters של תערובת תאי-פלסמיד לכל באר המשמשת לניסוי זה. הבאר הרביעית בכל קבוצת בארים המשמשת לניסוי תמולא בתמיסת מגנה לאלקטרופורציה.לאחר טעינת הפלטה, הכניסו אותה לתא הפלטות של ה-MXL וסגרו את המכסה. לאחר מכן, לחצו על pulse כדי לבצע אלקטרופורזה לתאים. המכשיר מספק את הפולסים החשמליים באופן רצפי לכל באר, בהתאם לתנאים המפורטים בפרוטוקול שנבחר.תהליך האלקטרופורציה של כל התאים אורך מספר שניות. עם השלמת הפולס, הוצא את הפלטה מתא הפלטות. העבר את התאים מכל באר לכלי תרבית המכיל מצע גידול שחומם מראש.תאים אלו גודלים ב-DMEM המועשר ב-10%FBS. דגימות ביקורת שלא עברו אלקטרופורציה נלקחות מתערובת התאים והפלסמיד שנותרה ונוספות לצלחות תרבית המכילות את מצע התרבית שחומם מראש, בהרכב זהה לזה ששימש את התאים שעברו אלקטרופורציה. לבסוף, יש לערבב בתנועות סיבוביות.לאחר מכן, הקישו על הפלטה כדי להפיץ את התאים לפני השמה באינקובטור למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide, וזאת לפני ניתוח יעילות הטרנספקציה וזיהוי תנאי האלקטרופורציה המיטביים עבור הניסוי שלכם. לאחר זיהוי תנאי האלקטרופורציה האופטימליים, קיימת בחירה בין שתי שיטות אלקטרופורציה עבור ניסויים עתידיים: החוקר יכול להמשיך להעביר תאים לפלטות בעלות 96 בארות, או להעביר תאים לקובטות, דגימה אחת בכל פעם.קיווטות יכולות להכיל רק דגימה אחת בכל פעם ודורשות נפח הגדול פי ארבעה מהנפח הנדרש לבאר אחת בלוחות של 96 בארות, אך קיווטות בודדות הן זולות יותר וקלות לשימוש כאשר נדרש מספר קטן של דגימות. מערכת ה-gene pulse או ה-MX cell תוכננה כך שניתן להשתמש באותן הגדרות אלקטרופורציה הן בלוחות והן בקיווטות הפעם. במקום תא הלוחות, השתמשו ב-mxl shock pod עבור קיווטות.נתקו את תא הפלטה מאחורי המכשיר וחברו את ה-shock pod. מכיוון שה-shock pod מספק רק את הפולס שתוכנת עבור באר set, A, B, C, D one, ייתכן שיהיה צורך לבחור תוכנית אחרת. כדי לבחור תוכנית שנשמרה בעבר, לחצו על home.לאחר מכן, בחרו באפשרות השלישית, user protocols. אם אתם כבר נמצאים בתיקיית המשתמש הנכונה, לחצו על enter כדי לבחור ב-user protocols וגללו למטה. כדי לסמן את התוכנית הנכונה, לחצו על enter כדי לבחור באותה תוכנית.המכשיר מוכן כעת. לאחר בחירת התוכנית, הגדירו את הקובטות. תערובת הפלסמיד וה-MEFs מוכנה באופן דומה לזה שהוצג קודם לכן.טען כל ואט בנפח של 0.4 סנטימטר באותו נפח שבו נעשה שימוש עבור סט בארות שלם בלוחיות בעלות 96 בארות. מכיוון שסט בארות מורכב מארבע בארות ונעשה שימוש ב-150 microliters של באפר או תערובת תאים לכל בארה, השתמש ב-600 microliters של תערובת תאי הפלסמיד לכל ואט.לאחר מכן, הניחו את המבחנה בתא של מכשיר השוק-פוד (shock pod), ולחצו על כפתור הפולס (pulse) כדי להעביר את השוק החשמלי לתאים. לאחר האלקטרופורציה, המשיכו כבשיטת הפלטה: ערבבו את התאים, ולאחר מכן העבירו מנות (aliquots) לפלטות תרבית תאים המלאות במדיום שחומם מראש, כולל קבוצת ביקורת של בארות שלא עברו אלקטרופורציה. סובבו את הפלטה בעדינות והקישו עליה.לאחר מכן, השאירו את התאים להתאושש במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide לפני ניתוח יעילות הטרנספקציה. נתחו את יעילות הטרנספקציה באופן איכותי באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מסוג epi ובאופן כמותי באמצעות ציטומטריית זרימה; תאים שעברו אלקטרופורציה בהצלחה ומבטאים כעת את הגן GFP יופיעו בירוק תחת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מסוג epi, כאשר כאן מוצגת תוצאה מוצלחת טיפוסית. צפייה בתאים במיקרוסקופיית ניגודיות פאזה מאפשרת ויזואליזציה הן של תאים שעברו טרנספקציה והן של תאים שלא עברו טרנספקציה.מוצגים כאן התאים שנחשפו לפולס אלקטרופורציה במתח הנמוך ביותר, 200 volts. התאים הם במידה רבה קונפלואנטיים בשל צפיפות התאים הגבוהה. אותו שדה ראייה תחת פלואורסצנציית epi מראה שמספר תאים מביעים את סמן ה-GFP, אך אלו מהווים רק אחוז קטן מהתאים שנראו בתמונה הקודמת ב-250 volts.מספר התאים החיים הכולל הנצפים תחת ניגוד מופע (phase contrast) פוחת מעט תחת פלואורסצנציית epi. ניתן לראות כי מספר התאים המבטאים GFP עלה במתח הגבוה ביותר שיושם, 375 volts. עם זאת, נראים פחות תאים חיים, אך אחוז גבוה מהתאים שנותרו מבטאים GFP.התנאי המיטב תלוי בתכנון הניסויי. בניסויים מסוימים, מספר התאים שעברו טרנספקציה הגבוה ביותר עשוי להיות המטרה המיטבית. בניסויים אחרים, אחוז הטרנספקציה הגבוה ביותר עשוי להיות המועדף.אנו מעוניינים באחוז התאים החיוביים ל-GFP תחת כל תנאי וכיצד האחוזים משתנים עם גיל התאים. ציטומטריית זרימה יכולה לספק מידע כמותי על תוצאות הטרנספקציה תחת כל אחד מתנאי האלקטרופורציה השונים. מוצגים כאן אחוזי התאים החיוביים ל-GFP במעבר.חמישה תאים. תחת כל אחד מ-12 תנאי האלקטרופורציה, אחוז הטרנספקציה המקסימלי היה כ-80% תחת דעיכה מעריכית במתח הגבוה ביותר. תנאי פולס שישה ו-70 תחת תנאי פולס גל ריבועי החזק ביותר שנבדק, תנאי 12, כאשר התאים הועברו תשעה פעמים לפני האלקטרופורציה.הדפוס הכללי של אחוזי הטרנספקציה כמעט זהה, אך עם ירידה קלה מאוד באחוזי הטרנספקציה המוצגים. להלן אחוזי תאי ה-GFP בתאי מעבר 13, המראים ירידה ניכרת באחוזי הטרנספקציה ביחס לתאים הצעירים יותר. אחוזי הטרנספקציה הגבוהים ביותר היו בערך מחצית ממה שהושג עם התאים הצעירים, דבר המדגים את החשיבות של שימוש בתאים בריאים זמן קצר ככל האפשר לאחר הבידוד.הראיתי לכם כעת כיצד להשתמש במערכת האלקטרופורציה MXL כדי לזהות את התנאים האופטימליים לאלקטרופורציה של MAPK או של קווי תאים ראשוניים אחרים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בתאים בריאים זמן קצר ככל האפשר לאחר הבידוד ולהשתמש בתנאי אלקטרופורציה התואמים לתמיסת האלקטרופורציה. זהו כל הפרוצדורה.תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

using-gene-pulser-mxcell-electroporation-system-to-transfect-primary

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הליך זה מתאר כיצד להקים ראשוני בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine ואחריו transfection באמצעות Pulser ג'ין מערכת MXCell electroporation.

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

הליך זה מתאר שיטה לבידוד והתרבות של האיבר של קורטי Murine עם או בלי לימבוס ספירלה ספירלה נוירונים גנגליון. אנחנו גם להדגים שיטה הביטוי של הגן כתב אקסוגניים האיבר של קורטי explant ידי electroporation.

תרבות ראשיים electroporation פלסמיד של האיבר Murine של קורטי.

Transfection ג'ין ידי electroporation הוא השתפר בכ פעמיים כאשר הכיוון של השדה החשמלי משתנה במהלך יישום הדופק, תוך כדאיות התא אינו מושפע. הגידול transfection גן נגרמת על ידי גידול של אזור קרום המורכב המוסמכת לכניסת ה-DNA לתוך התא.

שינוי כיוון והכיוון של השדה החשמלי במהלך יישום קטניות החשמל משפר את העברת גנים פלסמיד במבחנה</em

סרטון זה מדגים את טכניקת האלקטרופורציה המציגה DNA פלסמיד מקודד חלבון פלואורסצנטי למבשרי תאי גרגיר המוח הקטן הראשוניים של עכבר.

Electroporation-Mediated in Vitro Gene Delivery: טכניקת פולס חשמלי להחדרת פלסמידים מקודדי חלבון פלואורסצנטיים לתאים בתרבית

אלקטרופורציה מהדור הבא היא שיטה יעילה להעברת תאי Th17 אנושיים עם RNA קטן כדי לשנות את ביטוי הגנים והתנהגות התאים.

RNA הקטן Transfection ב ראשוני האדם TH17 תאים על ידי הדור הבא Electroporation

מוצג כאן פרוטוקול לאלקטרופורציה חד-תאית שיכולה לספק גנים הן בתאי עצב מעוררים והן בתאי עצב מעכבים על פני מגוון גילאים של תרבות פרוסות היפוקמפוס במבחנה. הגישה שלנו מספקת ביטוי מדויק ויעיל של גנים בתאים בודדים, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לבחון פונקציות תאיות אוטונומיות ובין תאיות.

אלקטרופורציה חד-תאית על פני תרבות פרוסה אורגנוטיפית שונה של נוירונים מעכבים היפוקמפוס ומעמד ספציפיים

פיתחנו פרוטוקול לטרנספקציה של תאי אפיתל פיגמנט אנושיים ראשוניים על ידי אלקטרופורציה עם הגן המקודד גורם שמקורו באפיתל פיגמנטי (PEDF) באמצעות מערכת הטרנספוזון של היפהפייה הנרדמת (SB). העברה מוצלחת הודגמה על ידי תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR), אימונובלוטינג ובדיקת אימונוסורבנט הקשורה לאנזים (ELISA).

שינוי גנטי מבוסס אלקטרופורציה של תאי אפיתל פיגמנט אנושיים ראשוניים באמצעות מערכת הטרנספוזון של היפהפייה הנרדמת

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אלקטרופורציה במבחנה לשחזור עבור מניפולציה גנטית של מבשרי תאי גרגר המוח הקטן העיקרי (GCPs) כי הוא חסכוני, יעיל, קיימא. יתר על כן, פרוטוקול זה מדגים גם שיטה פשוטה למחקר מולקולרי של מסלולי איתות קיפוד תלויי ציליום ראשוניים בתאי GCP ראשוניים.

שיטת אלקטרופורמציה יעילה וחסכונית לחקר מסלולי איתות ראשוניים תלויי סיליום במבשר תאי הגרגיר

פרוטוקול זה מתאר את הליך עריכת הגנום במקרופאגים שמקורם במח עצם עכבר באמצעות קומפלקסים של Cas9-sgRNA ribonucleoprotein המורכבים במבחנה ומועברים על ידי אלקטרופורציה.

שיבוש גנים ביעילות גבוהה במקרופאגים ראשוניים שמקורם במח עצם באמצעות קומפלקסים מחושמלים של Cas9-sgRNA

פרוטוקול מפורט מסופק לשימוש בטכנולוגיית CRISPR/Cas9 כדי להשיג דפיקה ממוקדת יעילה ביותר של מבנים גדולים ומולטי-ציסטרוניים בתאי T אנושיים ראשוניים באמצעות מסלול תיקון ה-DNA בתיווך הומולוגיה (HMEJ). תאי T המהונדסים עם פרוטוקול זה הניתן להתאמה ל-cGMP שומרים על התרחבות תאים מצוינת, ציטוטוקסיות וייצור ציטוקינים.

הנדסה לא ויראלית של תאי T אנושיים ראשוניים באמצעות אינטגרציה ממוקדת בתיווך הומולוגיה של תבניות DNA גדולות

העברת עורכי גנום כ-RNA היא אמצעי עוצמתי במיוחד לשינוי הגנומים של תאי יונקים ראשוניים וקווי תאים. מטרת הפרוטוקול היא להעביר עורכי גנום כ-mRNA לתאים ראשוניים ולקווי תאים ביונקים, ולאחר מכן ריצוף וניתוח ממוקדים של Illumina כדי לכמת את תוצאות העריכה.

עריכת גנום בתאי יונקים ראשוניים באמצעות אלקטרופורציה של RNA עורך

למדו אופטימיזציה של תנאי אלקטרופורציה לתאי פיברובלסט עובריים של עכברים (MEFs) באמצעות מערכת Gene Pulser MXcell. פרוטוקול זה מאפשר בדיקה מהירה של מספר תנאים ומספק טיפים לפתרון בעיות.

שימוש ג'ין Pulser מערכת MXcell electroporation כדי Transfect תאים ראשוניים עם יעילות גבוהה

גלה סרטונים נוספים