Name: Cultura primaria y electroporación plásmido del órgano de Corti murino. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Aprenda a aislar y cultivar el órgano de Corti murino para estudios de biología celular auditiva mediante electroporación de genes exógenos. Este protocolo permite analizar la función génica in vitro.

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Los autores desean agradecer a Danielle y Demêmes Cotanche Douglas y por sus esfuerzos en enseñarnos los métodos para el aislamiento del órgano de Corti. Además, nos gustaría dar las gracias a Ismael Stefanov-Wagner para la ingeniería de los electrodos electroporador; Sherry Lin por su obra que contribuyen a la animación de vídeo, y Mateo Chana, Jason Meeker, y Kendra Marshall ( <a href="http://www.goodfightproductions.com">www.goodfightproductions.com</a> ) para producir el vídeo. Este trabajo fue financiado por subvenciones (R03DC010065-Parker, RO1DC007174-Edge; P30DC05209-MEEI apoyo básico para la Investigación de la Audición) de la NIDCD.

Día 1. La esterilización y el recubrimiento de cubreobjetos de vidrio. <ol><li> Seco esterilizar cubreobjetos de vidrio microscopio en un autoclave. </li><li> Coloque el cubreobjetos esterilizados en dos pocillos de una pre-esterilizados cuatro y placa de cultivo celular. </li><li> Cubra el cubreobjetos con 1:1 de poli-L-ornitina y laminina complementado con suero fetal bovino 20% (FBS) durante la noche a 4 ° C. <ol class="lalpha"><li> 400 l de poli-L-ornitina (solución de 0,01% se almacenan a 4 ° C) </li><li> 400 laminina l (50 mg / ml de solución de archivo almacenado en alícuotas a -20 ° C) </li><li> FBS 200 l (almacenado en alícuotas a -20 ° C) </li></ol></li><li> Calor a esterilizar los instrumentos de disección durante la noche en una incubadora de 150 ° C. </li><li> Hacer un medio de cultivo que contienen 10% de suero y 10 ampicilina mg / ml. <ol class="lalpha"><li> 90 ml de Dulbecco Modificado Medio Eagle </li><li> 5 ml de FBS (almacenado en alícuotas a -20 ° C) </li><li> 5 ml de suero de caballo (almacenado en alícuotas a -20 ° C) </li><li> 10 l ampicilina (10 mg / ml de solución de archivo se almacenan a 4 ° C) </li></ol></li></ol> Día 2. Aislamiento del órgano de Corti. <ol><li> Esterilizar la campana de flujo positivo de disección. <ol class="lalpha"><li> encender la luz UV durante 20 minutos </li><li> pulverizar todas las superficies con un 70% de etanol y espere 5 minutos antes de su uso. </li></ol></li><li> Decapitar a las crías de ratón (P4) en la base del agujero occipital con unas tijeras de operación. </li><li> Brevemente enjuague la cabeza en un plato de 10 cm que contiene 70% de etanol. </li><li> Eliminar la epidermis con un bisturí. </li><li> Abrir el cráneo a lo largo de la sutura sagital con un bisturí y luego dividir en dos el cerebro anterior. Mantener el cerebro anterior caudal de disección. </li><li> Quitar el cerebro anterior, cerebelo y tronco cerebral utilizando disección roma. </li><li> Quitar los huesos temporales (Fig. 2A), sumergirlos brevemente en etanol al 70%, y transferirlos a un plato de 3 mm que contiene HBSS estéril. </li><li> Con unas pinzas, retire la bulla y el tejido circundante de la porción petrosa del hueso temporal. </li><li> Localice la concha en forma de caracol (Fig. 2B) y separarla del sistema vestibular el uso de fórceps. </li><li> En esta etapa de desarrollo, el laberinto óseo no está completamente calcificado y es fácilmente disecados con las pinzas. Retire el laberinto óseo de la cóclea por la separación cuidadosa de partida en el extremo basal y apical en movimiento con unas pinzas. </li><li> El ligamento espiral y el órgano de Corti se adjunta en espiral a lo largo de la espiral del modiolo (Fig. 2C). Retire con cuidado el órgano de Corti, asegurando el ligamento espiral en la región del gancho de la base con las pinzas y relajarse como usted se mueve hacia apical. </li><li> A partir de la base, retire el ligamento espiral del órgano de Corti con # 55 pinzas finas (Fig. 2D). Micro-aislamiento del órgano de Corti del epitelio sensorial (Opcional). </li><li> Quitar el órgano de Corti región gancho de la base con dos jeringas ½ cc con insulina permanentemente conectado U-100 28G ½ agujas como los fórceps. </li><li> Comenzando desde el ápice, eliminar el limbo espiral de la fila de las células ciliadas internas y proceder basales (Fig. 2E-F). Revestimiento del órgano de Corti explante </li><li> Eliminar la solución poly-L-ornithine/laminin/FBS de los pozos de la cultura y añadir 130 l de medio de cultivo. </li><li> Transferir el órgano de Corti diseccionado a la cubreobjetos de vidrio revestidas de la cultura y el explante y orientar de manera que los cilios de las células ciliadas están apuntando hacia arriba. </li><li> Eliminar el medio de la cultura y con una pipeta de 200 mL. Asegúrese de que la membrana basilar se pone en contacto sólido con el cubreobjetos recubiertos. </li><li> Añadir con cuidado 130 l de medio de cultivo para el órgano de Corti con una pipeta 200 ml. Aplicar dos gotas en la superficie del órgano de Corti y luego agregue lentamente el volumen restante a un lado del cubreobjetos. Asegúrese de que el órgano de Corti no flota en el medio de cultivo, pero sigue siendo colocada en el cubreobjetos. </li><li> Incubar toda la noche a 37 ° C en presencia de 5% de CO 2. </li></ol> Día 3. Electroporación del gen reportero en cultivos de órganos de Corti. <ol><li> Retire el medio de cultivo del órgano de Corti cultura. </li><li> Añadir 130 l H 2 O durante 1 minuto y luego retirar con una pipeta de 200 mL. </li><li> Añadir 30 l de plásmido reportero DsRed (2 mg / mL H 2 O almacenadas a -20 ° C). </li><li> Avance de los electrodos de la electroporador utilizando un micromanipulador para que el ánodo de unacátodo º están a ambos lados de la cultura. </li><li> Generar un pulso (27V, 30 ms de duración, 10 trenes de pulsos) para electroporar el gen reportero en el órgano de Corti explante cultura. <ol class="lalpha"><li> Opcional: invertir la polaridad del pulso para asegurar la electroporación de los transgenes en los dos lados y el modiolar espiral ligamento del explante. </li></ol></li><li> Esperar 5 min. </li><li> Añadir 130 l de la Fugene 6: La solución de ADN (3 partes Fugene a 2 partes de ADN). Esta solución debe prepararse antes del inicio del procedimiento de electroporación (paso 20) con una ronda de 3 ml de fondo de poliestireno tubo de ensayo en una campana de flujo laminar. Para preparar esta solución: <ol class="lalpha"><li> Añadir 2,4 l de Opti-MEM (almacenadas a 4 ° C) al tubo de ensayo. </li><li> Añadir 0,6 l de Fugene 6 reactivo (almacenado a 4 ° C) al tubo de ensayo. Asegúrese de añadir la Fugene directamente a la Opti-MEM y evitar el contacto directo con los lados del tubo de ensayo. </li><li> Vortex durante 1 segundo. </li><li> Incubar 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 2,0 l periodista DsRed plásmido ADN de doble cadena (almacenadas a -20 ° C a 100 ug de ADN / mL H 2 O alícuotas). </li><li> Vortex durante 1 segundo. </li><li> Incubar 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 200 l de medio de cultivo. </li><li> Vortex durante 1 segundo. </li></ol></li><li> Incubar toda la noche a 37 ° C en 5% de CO 2. </li><li> Añadir 2 ml de medio de cultivo a la cultura e incube a 37 ° C durante un máximo de 10 días. </li></ol> Resultados representante Se presenta un método para el aislamiento del órgano de Corti de un ratón perinatal. El procedimiento se puede utilizar para los ratones de tan sólo el día embrionario 16 hasta aproximadamente el día postnatal 6, momento en el que el laberinto óseo se vuelve lo suficientemente calcificados para hacer la disección engorroso. Una vez que el órgano de Corti es disecado, puede ser plateado y cultivadas, ya sea en su totalidad (Fig. 3) o como micro-aislados epitelio sensorial (Fig. 4). Además, hemos presentado una técnica para expresar genes exógenos en el órgano de Corti cultivadas. El cultivo organotípico es útil para muchos otros tipos de estudio, tales como el análisis del órgano de Corti expresión génica mediante RT-PCR o hibridación in situ, el órgano de Corti co-cultivo con células del ganglio espiral o células madre exógenas con el aislamiento de micro- 3, o en análisis in vitro de la muerte celular y la regeneración del cabello. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"></a> Figura 1. Sección transversal del órgano de Corti P4 murino. (A) Una sección transversal de la vuelta basal de la cóclea cryosectioned obtenido de un ratón P4 ilustra las estructuras generales de la cóclea murino se describe en este protocolo. La escala media está bordeado por el ligamento espiral y la estría vascular lateralmente, la membrana de Reissner s superior, la espiral limbo medial, y la membrana basilar hacia abajo. La caja indica la región se expandió en B. (B) El órgano de Corti se encuentra en la parte superior de la membrana basilar, e incluye una hilera de células ciliadas internas, tres hileras de células ciliadas externas, y sus respectivas celdas de apoyo. Una línea de puntos indica la localización a lo largo de la membrana basilar que se elimina durante este órgano de la disección de Corti. La línea de puntos 2 indica la ubicación a lo largo de la membrana basilar que se elimina durante el proceso de micro-aislamiento. El color verde indica marcaje inmunohistoquímico de calbindina, que las etiquetas de las células interdentales del limbo espiral, las células cocleares del cabello, las neuronas del ganglio espiral, así como las células del ligamento espiral y vascular 7 estría. DAPI etiquetado de los núcleos en azul. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig2.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig2tmb.jpg" alt="Figura 2" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"></a> Figura 2. Órgano de Corti disección. Las imágenes del vídeo de acompañamiento del órgano de Corti destacar la disección A) el sistema vestibular y la cóclea situada dentro del hueso temporal aislados (rojo), B) el laberinto óseo de la cóclea, C) el ligamento espiral y unida órgano de Corti después de la eliminación del laberinto óseo, D) la eliminación del ligamento espiral y la estría vascular (rojo) del órgano de Corti, E) micro-aislamiento del epitelio sensorial del limbo espiral (color rojo), y la F) aislados limbo espiral (izquierda) y el epitelio sensorial (derecha). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig3.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig3tmb.jpg" alt="Figura 3" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"></a> Figura 3. Órgano de Corti explante cultivados. DIC imagen que muestra el órgano deCorti de un P4 Atoh1-nGFP ratón que fue aislado, plateado, y se cultivaron durante cinco días, tal como se describe. Este ratón ha sido genéticamente modificados para que las células que expresan el gen de las células pro-pelo atonal homólogo 1 (aka Atoh1 Math1) presentan una proteína verde fluorescente que se localiza en el núcleo 8. Los órganos de Corti de estos ratones presentan una etiqueta GFP nuclear en todos los núcleos de las células del pelo y por lo tanto, permiten una fácil visualización del epitelio sensorial mediante un microscopio de epifluorescencia. La espiral relativamente grande limbo puede ser visto por fuera del epitelio sensorial. Las células mesenquimales que tienen su origen en el órgano de Corti han emigrado fuera del explante. Etiqueta azul es nuclear DAPI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig4.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig4tmb.jpg" alt="Figura 4" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"></a> Figura 4. Micro-aislados epitelio sensorial. Epifluorescencia la imagen obtenida del epitelio sensorial que se ha aislado de un órgano de Corti P4 murino como se describe y se cultivan durante la noche. El micro-aislamiento se fija entonces en paraformaldehído al 4% y se procesaron para inmunomarcación de 7a miosina que las etiquetas de las células cocleares del cabello. Nótese la ausencia de la espiral comparativamente mayor limbo de la figura 3. Etiqueta azul es nuclear DAPI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig5.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig5tmb.jpg" alt="Figura 5" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"></a> Figura 5. Electroporación del gen reportero DsRed en el órgano de Corti cultivadas. Órganos enteros de Corti de P4 Atoh1-nGFP crías de ratón fueron aisladas, plateado, y luego electroporated con el gen reportero DsRed como se describe y luego se observan bajo un microscopio de epifluorescencia. Las células del órgano de Corti explante que expresa la proteína transgénica reportero DsRed células presentan una fluorescencia roja y endógenos de la exposición del epitelio sensorial una fluorescencia verde nuclear. Células transgénicas se pueden ver en el limbo espiral y el epitelio sensorial.

<ol><li>Sobkowicz, H. M., Bereman, B., Rose, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+Development+of+the+Organ+of+Corti+in+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">Organotypic Development of the Organ of Corti in Culture.</a> Journal of Neurocytology. 119 (4), 543-543 (1975).</li>
<li>Zheng, J. L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Math1+induces+robust+production+of+extra+hair+cells+in+postnatal+rat+inner+ears%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Math1 induces robust production of extra hair cells in postnatal rat inner ears.</a> Nature Neuroscience. 3 (6), 580-580 (2000).</li>
<li>Martinez-Monedero, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((THE+POTENTIAL+ROLE+OF+ENDOGENOUS+STEM+CELLS+IN+REGENERATION+OF+THE+INNER+EAR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">THE POTENTIAL ROLE OF ENDOGENOUS STEM CELLS IN REGENERATION OF THE INNER EAR.</a> J Neurobiol. 66 (4), 319-319 (2006).</li>
<li>Saffer, L. D., Gu, R., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RT-PCR+analysis+of+mRNA+for+growth+factor+receptors+in+damaged+and+control+sensory+epithelia+of+rat+utricles%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">An RT-PCR analysis of mRNA for growth factor receptors in damaged and control sensory epithelia of rat utricles.</a> Hearing Research. 94 (1,2), 14-14 (1996).</li>
<li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+growth+and+differentiation+of+hair+cell+progenitors+from+the+newborn+rat+cochlear+greater+epithelial+ridge%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation, growth and differentiation of hair cell progenitors from the newborn rat cochlear greater epithelial ridge.</a> Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 271-271 (2007).</li>
<li>Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+Differentiation+and+DNA+Binding+%28Ids%29+Regulate+Math1+and+Hair+Cell+Formation+during+the+Development+of+the+Organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of Differentiation and DNA Binding (Ids) Regulate Math1 and Hair Cell Formation during the Development of the Organ of Corti.</a> J. Neurosci. 26 (2), 550-550 (2006).</li>
<li>Daniela, B., Josef, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calbindin+and+S100+protein+expression+in+the+developing+inner+ear+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Calbindin and S100 protein expression in the developing inner ear in mice.</a> The Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 469-469 (2009).</li>
<li>Helms, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulation+and+multiple+enhancers+control+Math1+expression+in+the+developing+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system.</a> Development. 127 (6), 1185-1185 (2000).</li>
<li>Zheng, J. L., Wei-Qiang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Damage+to+Auditory+Neurons+and+Hair+Cells+by+Ototoxins+and+Neuroprotection+by+Specific+Neurotrophins+in+Rat+Cochlear+Organotypic+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differential Damage to Auditory Neurons and Hair Cells by Ototoxins and Neuroprotection by Specific Neurotrophins in Rat Cochlear Organotypic Cultures.</a> European Journal of Neuroscience. 8 (9), 1897-1897 (1996).</li>
</ol>

Hay varios detalles que son fundamentales para el éxito de este procedimiento. Cuanto más corto sea el tiempo de aislamiento de los temporales de órgano de Corti de incubación, mayor será la posibilidad de que los órganos se conectará con el cubreobjetos y el resultado en cultivos de órganos viables. Por lo tanto, es importante limitar la cantidad de tiempo que transcurre entre la disección y la colocación de los órganos en la incubadora. La elección del antibiótico es también crucial, ya que muchos antibióticos aminoglucósidos son ototóxicos y puede provocar la muerte de las células ciliadas. A pesar de que es preferible renunciar al uso de antibióticos por completo, lo que deja abierta la posibilidad de contaminación. Por lo tanto, se sugiere el uso de 10 mg / ml ampicilina, como regla general para superar los problemas potenciales de contaminación. El aspecto más problemático de este y otros procedimientos para el cultivo primario del órgano de Corti, es la tendencia de los órganos de flotar fuera de los platos durante la incubación. Aunque los cultivos flotantes órgano puede permanecer viable durante 5-7 días, hay inconvenientes de los órganos de cultivo flotantes. Por ejemplo, flotando cultivos de órganos a menudo veces sobre sí mismos después de 4-5 días la prestación de microscopía problemática. Posteriormente, la integridad estructural del órgano puede verse en peligro si se compara con los órganos que se han colocado a la cubreobjetos. Hemos encontrado que las siguientes técnicas ayudan a asegurar que el órgano de Corti no flota en el medio de cultivo, pero sigue siendo colocada en el cubreobjetos. En primer lugar, la capa de vidrio en el cubreobjetos 01:01 poliornitina / laminina suplementado con FBS al 20% tal como se describe. La incubación durante la noche las establecidas en el protocolo es el tiempo mínimo que la placa debe ser cubierto. En nuestro laboratorio, a menudo abrigo de todas las planchas que se necesitan para la semana y mantenerse a 4 ° C hasta el día antes de su uso cuando los movemos a la incubadora de una incubación durante la noche. En segundo lugar, después de que los órganos se transportan a la cubreobjetos recubiertos, orientar el explante de manera que los cilios de las células de pelo hacia arriba. Esta orientación facilitará la adhesión de la membrana basilar de la placa de cultivo. En tercer lugar, eliminar los medios de comunicación en el pozo para colocar el explante al plato cubierto. Esto asegurará el contacto entre la placa de cultivo y la membrana basilar y mejorar la capacidad de los explantes de adherirse al vidrio. Esto también ayudará a mantener la integridad estructural de las filas de las células ciliadas. Por último, con cuidado por goteo 2 gotas de medio de cultivo sobre la superficie del órgano de Corti con una pipeta 200 l de capacidad y poco a poco llenar el pozo por goteo y el volumen restante (de un total 130 l) en el lado del cubreobjetos. Es importante trabajar con rapidez para asegurar la fijación del órgano de Corti a la cubreobjetos recubiertos. Desde el inicio de la disección a la incubación de los explantes, por lo general toma 10 minutos para un operador de practica para completar este órgano de Corti procedimiento de aislamiento. En este protocolo, también se presenta un método para el aislamiento de microorganismos del epitelio sensorial del limbo espiral del órgano de Corti. En este procedimiento, el limbo espiral es diseccionada en el epitelio sensorial con 28G ½ agujas de insulina como herramientas de disección. El resultado consiste en aislar los microorganismos de las filas de las células ciliadas y sus correspondientes células de apoyo (Fig. 3). El epitelio sensorial aislada se puede cultivar como se describe en este protocolo. Este procedimiento de aislamiento de micro-debe compararse con la separación enzimática de los epitelios sensoriales del tejido circundante 4. En los mamíferos, así como especies no mamíferas, tales como pollos, la digestión termolisina de que los resultados órganos vestibulares en el aislamiento de los epitelios sensoriales de las células mesenquimales sótano 4. En la rata cóclea, los resultados termolisina la digestión en la separación de la cresta superior del epitelio, menor cresta epiteliales y el epitelio sensorial que acompaña a la membrana basal 5. Sin embargo, no está claro si el epitelio sensorial coclear pueden adherirse a las placas de recubrimiento sin las células mesenquimales de acompañamiento. Mientras tanto en el micro-mecánica aislamiento método y el resultado enzimática método de digestión en la separación de los epitelios sensoriales del limbo espiral, las ventajas de la disección de micro-aislar a la digestión termolisina incluye un protocolo relativamente corto, más barato reactivos, y el estrés potencialmente menos el explante debido a los efectos de la digestión enzimática. Además, la membrana basal permanece intacta en este enfoque, que puede mejorar la conexión del epitelio sensorial de la placa de cultivo. Las desventajas de este método incluyen la necesidad de desarrollar las habilidades en la disección delicada y el daño potencial a la mecánica del epitelio sensorial como resultado de la disección micro. Como ejemplo de la utilidad de este procedimiento, también presentamos un ejemplo de la utilización de los órganos deCorti culturas, la electroporación de genes exógenos en el explante cultura. El procedimiento de electroporación descrito anteriormente se basa en los métodos anteriores de órgano de Corti electroporación. En particular, Zheng y Gao (2000) describen la electroporación de los órganos aislados de ratas de Corti, donde los explantes se mantienen en su lugar para la electroporación por un surco trazado de agarosa y chapada en colágeno recubiertas de 8 y diapositivas Labtek en medio libre de suero 2. Una de las ventajas de su enfoque es que los órganos están orientados de manera que las superficies superiores de los explantes de la cara del cátodo, que en teoría debería resultar en una distribución uniforme de las células por electroporación en todo el explante. En nuestras manos sin embargo, el método que se describe mejor en este procedimiento debido a que el órgano de Corti quedó fijada en el cubre todo el procedimiento lo que se reduce la manipulación de los explantes después de la electroporación. Además, un porcentaje más alto de los órganos de Corti se mantuvo unido a los cubreobjetos utilizando este método que se presenta. Nuestro método se ha tomado de Jones, et al. (2006) que utiliza la adición de la Fugene 6 reactivo para aumentar la eficiencia de la expresión génica después de la electroporación. En el protocolo de Jones et al. (2006), los órganos se someten a electroporación, se incubó durante 5 minutos con 100 l de reactivo de transfección Fugene 6, y se colocaron 6. Nuestro método difiere en el uso de una proporción de 3:2 de Fugene 6 reactivo al ADN plásmido, que hemos encontrado empíricamente para proporcionar la expresión transgénica óptima con toxicidad orgánica mínima. Nosotros no usamos sin diluir Fugene 6 reactivo, que puede resultar en toxicidad a los cultivos. La configuración de los electrodos en el protocolo, así como Jones et al. (2006), los resultados en la expresión génica primaria, ya sea en la espiral de limbo o epitelio sensorial dependiendo de la posición del cátodo. Aunque hay DsRed células positivas en el lado lejano de la cultura hacia el cátodo, hay una mayor concentración de células transgénicas más cerca del cátodo. Para asegurar una completa expresión del transgén en ambos lados del órgano de Corti explante, la corriente puede ser revertida por un tren de pulsos segundo, simplemente invirtiendo los cables. Los resultados presentados en el protocolo de sólida expresión de los transgenes a través del órgano de Corti (Fig. 5).

<table><tbody><tr><td>Cubreobjetos de microscopio de vidrio</td><td>DYNALAB Corporation</td><td>2010</td><td>Diámetro de 10 mm, círculo n.º 1, grosor de 1 mm, 1 onza</td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular con 4 anillos</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627170</td><td>Placa de cultivo celular esterilizada de 35 × 10 mm con 4 anillos internos</td></tr><tr><td>Poli-L-ornitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td>Solución al 0,01 %</td></tr><tr><td>Laminina</td><td>BD Biosciences</td><td>354232</td><td>Producida en ratón</td></tr><tr><td>Suero bovino fetal</td><td>Invitrogen</td><td>26140-095</td><td>Cualificado</td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6806</td><td>Rectas, punta fina-romo, longitud de 5&quot;</td></tr><tr><td>Cuchilla de bisturí n.º 11</td><td>BD Biosciences</td><td>372611</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumoxel n.º 4</td><td>Fine Science Tools</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas finas Dumostar n.º 55</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Medio de Eagle modificado de Dulbecco&amp;rsquo;s</td><td>Invitrogen</td><td>10564-011</td><td>Alta glucosa</td></tr><tr><td>Suero de caballo</td><td>Invitrogen</td><td>2605088</td><td>Inactivado por calor</td></tr><tr><td>Sal sódica de ampicilina</td><td>Invitrogen</td><td>11593-027</td><td>Irradiada</td></tr><tr><td>Jeringa de insulina Lo-Dose de &amp;frac12; cc</td><td>BD Biosciences</td><td>329465</td><td>U-100 28G&amp;#189;</td></tr><tr><td>Reactivo de transfección Fugene 6</td><td>Roche Group</td><td>11-815-091-001</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de ensayo de poliestireno</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-956-5A</td><td></td></tr><tr><td>Campana de flujo laminar</td><td>The Baker Company (Stanford, ME)</td><td>Modelo SG603a</td><td>SterileGARD III&lt;br/&gt;Clase II avanzada&lt;br/&gt;Campana de seguridad biológica</td></tr><tr><td>Medio Opti-MEM I con suero reducido</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Plásmido reportero</td><td>Clontech Laboratories</td><td>632539</td><td>pCMV DsRed-Express 2</td></tr><tr><td>Electroporador</td><td>Bio-Rad</td><td>165&amp;#8211;2662</td><td>BioRad Gene Pulser Xcell</td></tr></tbody></table>

cultura primaria y electroporación plásmido del órgano de corti murino.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

En todos los mamíferos, el epitelio sensorial de la audición se encuentra a lo largo del órgano espiral de Corti que se encuentra dentro de la cóclea en forma de caracol del oído interno (fig 1). Las células pilosas en la cóclea de desarrollo, que son las células mechanosensory del sistema auditivo, se alinean en una fila de células ciliadas internas y tres (en la base y la mitad de vueltas) a cuatro (en la vuelta apical) hileras de células ciliadas externas que abarcan todo el largo del órgano de Corti. Transducción de las células ciliadas de sonido inducida por las vibraciones mecánicas de la membrana basilar en impulsos nerviosos que el cerebro puede interpretar. La mayoría de los casos de pérdida auditiva neurosensorial son causados ​​por la muerte o la disfunción de las células pilosas cocleares. Una herramienta cada vez más esencial en la investigación auditiva es el aislamiento y cultivo in vitro de los explantes de órganos 1,2,9. Una vez aislados, los explantes se puede utilizar de varias maneras para proporcionar información sobre normativa, anómalo, o la fisiología terapéutica. La expresión génica, la motilidad estereocilios, biología celular y molecular, así como los enfoques biológicos para la regeneración de las células ciliadas son ejemplos de aplicaciones experimentales de órgano de Corti explantes. Este protocolo describe un método para el aislamiento y la cultura del órgano de Corti de ratones recién nacidos. El video que acompaña incluye instrucciones paso a paso para el aislamiento del hueso temporal de crías de ratón, y el posterior aislamiento de la cóclea, el ligamento espiral, y el órgano de Corti. Una vez aislado, el epitelio sensorial puede ser plateado y se cultivan in vitro en su totalidad, o como un micro-disección más aislado que carece de la espiral de limbo y de las neuronas del ganglio espiral. Usando este método, explantes primarios se puede mantener durante 7-10 días. Como ejemplo de la utilidad de este procedimiento, el órgano de Corti explantes se electroporated con un gen reportero DsRed exógenos. Este método proporciona una mejora sobre otros métodos publicados, ya que proporciona direcciones reproducible, sin ambigüedades, y paso a paso para el aislamiento, la microdisección, y la cultura principal del órgano de Corti.

Este procedimiento describe un método para el aislamiento y la cultura del órgano de Corti murino con o sin el limbo espiral y las neuronas del ganglio espiral. También demostramos un método para la expresión de un gen reportero exógenos en el órgano de Corti explante de la electroporación.

Cultura primaria y electroporación plásmido del órgano de Corti murino.

En todos los mamíferos, el epitelio sensorial para la audición se localiza a lo largo del órgano de Corti en espiral, que se encuentra dentro de la cóclea en forma de caracola de la ...

Hola, soy Mark Parker. Bienvenidos al Laboratorio Eaton Peabody en el Massachusetts Eye and Ear Infirmary en Boston, Massachusetts. Hoy presentaremos un protocolo para el aislamiento y cultivo primario del órgano marino de kti.Este protocolo es fundamental en nuestro trabajo porque permite el análisis in vitro del órgano esencial para la audición. Para resaltar la utilidad de este enfoque, también demostraremos uno de los muchos usos de los órganos en nuestro laboratorio: la electroforesis de genes exógenos en los explantes cultivados. Comencemos a trabajar.El esquema de este procedimiento es el siguiente: se decapitarán ratones neonatos y se extraerán sus huesos temporales mediante disección roma. A continuación, se aislará la cóclea del hueso temporal utilizando disección roma. Luego, se abrirá el laberinto óseo de la cóclea con pinzas y se eliminará el ligamento espiral del modiolo interno de la cóclea.Finalmente, el ligamento espiral se separará del órgano de Corti usando fórceps; se pueden observar rosas translúcidas de células pilosas que se extienden a lo largo del órgano de Corti. Se puede ver una porción de la membrana del RISE, que se ha roto durante la eliminación del ligamento espiral, que discurre a lo largo del lado modular. Como ejemplo de la utilidad de este procedimiento, los explantes del órgano de Corti se cultivarán durante 24 horas y luego se electroporarán con un gen reportero fluorescente exógeno.Los pasos iniciales de este procedimiento implican la preparación de las placas de cultivo. Coloque una laminilla de vidrio esterilizada, que se ha almacenado en etanol al 70%, en dos pocillos de una placa de cultivo celular preesterilizada de cuatro anillos. Utilizar solo dos de los cuatro pocillos limitará el tiempo que los cultivos permanecen fuera del recipiente del incubador.Los portaobjetos con la solución compuesta de poli-L-ornitina y laminina en proporción uno a uno. Suplemente con 20% de suero bovino fetal, coloque el cultivo dentro de un plato más grande de 10 centímetros para facilitar su transferencia y luego incube durante la noche a 37 grados Celsius. Finalmente, esterilice por calor, es decir, las herramientas de sección, en un incubador a 150 grados Celsius durante la noche.Sterilice la campana de flujo laminar positivo activando la luz ultravioleta durante 20 minutos antes de comenzar la disección. Esterilice el área de trabajo dentro de la campana de disección rociando todas las superficies con etanol al 70%. Coloque la cabeza de un ratón lactante decapitado en una placa de Petri que contenga etanol al 70% y luego retire la epidermis utilizando una hoja de bisturí.Abrir el cráneo a lo largo de la sutura sagital utilizando una hoja de bisturí y luego dividirlo por la mitad para el cerebro. Conservar el prosencéfalo para una disección posterior. Extraer el prosencéfalo, el cerebelo y el tronco encefálico mediante disección roma.Observe la ubicación del hueso temporal con forma parametal en la cara lateral inferior del cráneo. Transfiera los huesos TAL a un recipiente de tres milímetros que contenga solución salina estéril de Hank. La disección restante debe realizarse bajo un microscopio de disección.Elimine cualquier tejido circundante del hueso temporal. Localice la cóclea con forma de concha y retírela del sistema vestibular utilizando pinzas. En esta etapa de desarrollo, el laberinto óseo no está completamente calcificado y se puede disecar fácilmente.Retire el laberinto óseo de la cóclea mediante una separación cuidadosa que comience en el extremo basal y avance hacia el ápice. Usando pinzas, retire cuidadosamente el ligamento espiral y el epitelio sensorial adyacente de la modiola, sujetándolos en la región del gancho de la base con las pinzas y desenrollándolos. A medida que avanza hacia el ápice, comience por la base y retire el ligamento espiral del epitelio sensorial utilizando pinzas finas número 55.En algunos de nuestros experimentos, se desea la eliminación del limbo espiral del epitelio sensorial. En este procedimiento de aislamiento microscópico, el órgano de Corti se aísla del limbo espiral utilizando dos jeringas de insulina de medio cc como pinzas. Primero, se elimina la región en gancho del órgano de Corti utilizando las jeringas de insulina.A continuación, se separa el limbo espiral de la fila de células ciliadas internas comenzando desde el ápice y avanzando hacia la base, ya sea con todo el órgano de Corti con el limbo espiral adherido. El epitelio sensorial microaislado o el limbo espiral microaislado pueden cultivarse del siguiente modo: retire la solución de recubrimiento de los pocillos de cultivo y sustitúyala por 130 microlitros de medio de cultivo que contenga 10% de suero. Transfiera el órgano de Corti diseccionado al cubreobjetos de vidrio recubierto en el pocillo de cultivo. Hemos encontrado que las siguientes técnicas ayudan a garantizar que el órgano de Corti no flote en el medio de cultivo, sino que permanezca fijado al cubreobjetos.Primero, recubra las laminillas de vidrio como se describe. Segundo, retire el medio para fijar el explante al recipiente recubierto. Esto asegurará el contacto entre el recipiente de cultivo y el explante X.En tercer lugar, oriente el explante de manera que las cilias de las células pilosas queden hacia arriba. Esta orientación facilitará la adherencia del explante al recipiente de cultivo. Por último, añada 130 microlitros de medio de cultivo con suero utilizando una pipeta de 200 microlitros, dejando caer cuidadosamente dos gotas sobre la superficie del órgano, y luego agregue lentamente el volumen restante al costado del pocillo; traslade cuidadosamente el explante a una incubadora e incube a 37 grados Celsius en presencia de 5 % de dióxido de carbono.Estos cultivos pueden mantenerse durante siete a 10 días. Existen numerosas aplicaciones para el órgano aislado de Corti. Algunos ejemplos incluyen el análisis de la expresión génica mediante R-T-P-C-R o hibridación NC dos, el cultivo del órgano de Corti con células del ganglio espiral o células madre exógenas, o el análisis in vitro de la muerte de las células ciliadas. Para demostrar la utilidad de este procedimiento, le mostraremos una técnica comúnmente utilizada en nuestro laboratorio para expresar genes exógenos en los cultivos de explantes.Para esta demostración, el órgano de Corti aislado será electroporado con un vector de expresión que expresa constitutivamente el gen reportero DS Red. Después de la electroporación, las culturas se incubarán con un reactivo de transfección Gene Six durante 24 horas para mejorar el procedimiento de transfección. Mediante este sistema, las células transfectadas exhibirán una fluorescencia roja citoplasmática dentro de las 24 horas.Primero, prepare una relación de tres a dos de agente de transfección del gen FU seis a ADN diana en un tubo de ensayo de poliestireno redondo de tres mililitros. En una cabina de flujo laminar, retire el medio de cultivo del órgano de horticultura. Añada 130 microlitros de agua durante un minuto y luego retire con una pipeta de capacidad de 200 microlitros.A continuación, agregue 30 microlitros del plásmido DS red reporter, que se almacena en una solución stock de dos miligramos de ADN plasmídico por mililitro de agua. Para la electroforesis, utilizamos un BioRad gene Pulser Excel para generar el impulso eléctrico. Los electrodos habían sido personalizados por nuestro taller mecánico para satisfacer nuestras necesidades; consisten en alambre desnudo doblado en un ángulo de 90 grados y prensado en forma de paleta.Avance los electrodos del electro utilizando un micromanipulador de modo que el ánodo y el cátodo queden a ambos lados del cultivo. Genere 10 trenes de pulsos compuestos por 27 voltios y una duración de 30 milisegundos para electropermeabilizar el gen reportero en el cultivo de órganos según el protocolo explicado. Luego espere cinco minutos.A continuación, agregue 130 microlitros de la solución de ADN del gen FU seis al explante y luego incube a 37 grados Celsius en presencia de 5% de dióxido de carbono durante la noche. Al día siguiente, agregue dos mililitros de suero al medio de cultivo en cada placa. Los cultivos de explantes pueden mantenerse durante seis días o más después de 24 horas.Las células transfectadas pueden observarse utilizando un filtro SI de tres canales en un microscopio fluorescente epiluminiscente. Acabamos de mostrarle un método para el aislamiento y cultivo primario del órgano de Corti. Este método funciona con ratones tan jóvenes como el día embrionario 16 hasta el día posnatal, momento en el cual la cóclea se calcifica lo suficiente como para hacer la disección engorrosa.Además, hemos demostrado un método para la expresión de genes exógenos en el órgano en cultivo de corde. Este es un ejemplo de un tipo de experimento que puede realizarse en el explante cultivado. Sin duda existen múltiples aplicaciones para esta técnica.Así es todo. Gracias por vernos y buena suerte con sus experimentos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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