Name: Imágenes de reparación del ADN y la respuesta celular al daño del ADN en Bacillus subtilis /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-08T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Aprende a visualizar la formación de complejos de reparación del ADN en Bacillus subtilis mediante fusiones proteicas con GFP. Este protocolo permite observar en tiempo real los procesos de reparación de errores de emparejamiento.

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Los autores desean agradecer a los Dres. Philina S. Lee y Alan D. Grossman para la formación inicial en LAS microscopía de fluorescencia. Los autores también agradecen a los Dres. Melanie Berkmen y Kobayashi Hajime ayuda y consejos para la imagen. Este trabajo fue apoyado por la puesta en marcha de fondos de la Facultad de Literatura, Ciencias y Artes y del Departamento de Biología Molecular, Celular y del Desarrollo en la Universidad de Michigan.

Cultivos en crecimiento de las células para la microscopía 1. Uno o dos días antes de la imagen, preparar el B. subtilis cepa que contiene la proteína de fusión de traducción que desea visualizar. Rondas de prueba de los pasos 1A y 1B será necesario determinar qué condiciones de crecimiento ofrece las mejores imágenes de la cepa. En la mayoría de los casos, las células deben ser fotografiado durante la fase de crecimiento exponencial. <ol class="ualpha"><li> Para algunos B. cepas subtilis (en particular cepas, que crecen muy poco debido a la integración de la fusión traduccional entre el gen de interés y las buenas prácticas agrarias en su locus endógeno), el crecimiento inicial de dos días antes de la imagen es necesaria para imágenes de alta calidad. En el primer día, la racha de B. subtilis cepa a ser reflejado en agar LB con antibiótico de selección (s) e incubar durante la noche a 30 ° C. En el segundo día, inocular 100 l de solución salina 0,85% con una sola colonia y realizar tres diluciones seriadas de 10 veces en placas de agar LB (con antibióticos selectivos), revestimiento de 100 l de cada dilución, seguido de incubación durante la noche a 30 ° C. En el tercer día, seleccione la placa de la dilución con el crecimiento de la luz confluente de células. Crecimiento de la luz confluentes en un plato proporcionará el medio de cultivo con un inóculo de salud, crecimiento exponencial de arranque para producir potencialmente excelentes resultados de imagen (ver paso 4). Este paso es especialmente útil para las imágenes de una calidad más alta de membrana con la mancha FM4-64. </li><li> Otros B. subtilis cepas sólo se puede aplicar a un medio selectivo agar LB por las colonias solo con un palillo estéril el día anterior a la imagen y se incuban durante la noche a 30 ° C. Al día siguiente, las celdas de esta placa será suficiente para su uso como inóculo para la imagen (ver paso 4). NOTA: Para B. subtilis, cultivos de una noche en medio líquido no son apropiados debido a una combinación de la formación de esporas y las respuestas de quórum, lo que provocará un período prolongado de crecimiento de retraso de fase 1. </li></ol> 2. En la mañana de la imagen, introducir 10 ml de medio de S7 50 3.1 en un matraz Erlenmeyer de 125 mL estéril. 3. Resuspender las células en un máximo de 2 ml de medio de S7 50 de la placa de agar LB con colonias aisladas o las células confluentes luz para obtener un inóculo. 4. Añade suficiente S7 50 medio de las células del inóculo sobre el erlenmeyer que contiene 10 ml S7 50 por medio de una cultura con una densidad inicial óptica medida a 600 nm (OD 600) de ~ 0,08 a 0,1. En este paso es importante tener por lo menos un aire de 10 veces al cociente medio. Por lo tanto, se utiliza 10 a 12,5 ml de medio inoculado en un matraz Erlenmeyer de 125 ml. 5. Crecer cada cultivo a 30 ° C hasta que el cultivo llegue a un OD 600 ~ 0.5-0.8. Agitando los baños de agua son preferibles las revoluciones por minuto, 150 a 200. Culturas desafió con agentes inductores de dañar el ADN o la discrepancia se debe a una fase de crecimiento exponencial a principios OD 600 de tal manera que las células alcanzará la meta de 600 OD con el nuevo período de crecimiento que se requiere para el tratamiento (ver Tabla 1) Por ejemplo, 2-aminopurine requiere una hora de tratamiento, y por lo tanto un cultivo tratado con 2-aminopurine debe estar en OD 600 ~ 0.3-0.4, de tal manera que una hora de tratamiento / los resultados de crecimiento en un 600 OD ~ 0.5-0.8, el cual las células están listas para la imagen. Preparación de la muestra 1. Pipetear 300 l de células cultivadas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. 2. Si las imágenes de las membranas celulares se desea, añadir la dilución 1:1000 de FM4-64 membrana mancha (Invitrogen) para cada muestra de una solución madre de 1 mg / ml. Una valoración de FM4-64 puede ser necesaria para lograr la señal de fluorescencia deseada. Una gama de titulación típica es de 1:100, 1:1000 y 1:10.000. 3. Permitir que las muestras permanezcan a temperatura ambiente hasta por diez minutos, mientras que la diapositiva se está preparando con agarosa al 1% en 1X medio Spizizens como se describe a continuación (ver paso 1 de "preparación de diapositivas"). 4. Si la concentración de las células es necesario, preferimos las células de filtrado mediante un filtro de 0,2 micras, con un aparato de vacío. Las células se pueden lavar con suavidad de la superficie del filtro con PBS, otro tampón apropiado o medio antes de su visualización. Preparación de diapositivas 1. Preparar agarosa al 1% con 1X Spizizens. Añadir 5 ml de caldo de Spizizens 10 veces a 45 ml ddH2O junto con 0,5 g de agarosa y microondas para derretir. Agarosa fundida en caliente es difícil de pipeta, y se solidificó de agarosa no entrará en la punta de la pipeta. La agarosa deben equilibrarse en un baño de agua a una temperatura de ~ 55-65 ° C, para entrar en la punta de la pipeta sin solidificar dentro de la punta. 2. Sacar 20 l de Spizizens con el 1% de agarosa derretida en la punta de la pipeta. Pipeta una gota (aproximadamente 2.1 l) de la solución de agarosa en cada diapositiva y (nosotros usamos 15 y diapositivas, ver Tabla 2) de forma superficial las almohadillas de agarosa. La agarosa se solidifica inmediatamente. Diapositivas también se debe realizar inmediatamente antes de la aplicación de las células. Si las pastillas de agarosa se dejan a temperatura ambiente único, que puede deshidratar en cuestión de minutos y se pueden utilizar. Pastillas de agarosa debe estar centrado y llene cada uno bien, pero tienen una altura mínima para evitar interrumpir el cubreobjetos, y si las gotas son demasiado altos (tipo burbuja) o si la muestra se extienda más allá del límite, así, simplemente pase el limpia bien con un Kimwipe y aplicar una nueva plataforma de agarosa. 3. Aplicar la totalidad de los 300 l de la muestra (ver paso 6) a la diapositiva, distribuidos en la parte superior de cada pad de agarosa. Esta cantidad de células debería ser suficiente para cubrir cada uno y en la diapositiva. 4. Permitir la diapositiva cargado con células reposar a temperatura ambiente (23 ° C) durante aproximadamente diez minutos. Este paso permitirá que las células se depositan en la plataforma de agarosa ser inmóvil y listo para su imagen. Para necesidades especiales, esta temperatura puede ser necesario cambiar, por ejemplo, cuando se realizan experimentos que requieren un cambio de temperatura 4. 5. Aspirar el medio de distancia en exceso de cada pozo sin necesidad de retirar las pastillas de sí mismos. 6. Aplicar el cubreobjetos a la diapositiva, presionando con firmeza y de manera uniforme, pero con cuidado, a través del área de la diapositiva. Asegúrese de que la hoja de la cubierta está en contra de la diapositiva y que la hoja de la cubierta no se eleva por encima de la diapositiva. La visualización de las células 1. Muchos microscopios de fluorescencia diferentes va a funcionar bien. Es fundamental contar con una lente de aceite de inmersión 100X. El Laboratorio de Simmons utiliza: <ul><li> Olympus BX61 microscopio equipado con lentes de 1,45 NA TIRFM petróleo objetivo de inmersión 100X </li><li> Hamamatsu ORCAR 2 CCD refrigerado por cámara </li><li> Lumen 200 de arco de metal (antes) la fuente de luz. </li><li> Para la detección de buenas prácticas agrarias (FITC), la excitación y la emisión de filtro 460-500 510-560 </li><li> Para la detección de FM4-64 (TRITC), la excitación y la emisión de filtro 510-560 572-648. </li><li> Las imágenes fueron capturadas utilizando SlideBook 4,2 (Figura 1) </li></ul> 2. Traiga las células en el foco con luz blanca. 3. Capturar la imagen con los filtros adecuados para cada fluoróforo. Resultados representante Imágenes representativas se muestran (Figura 1). GFP focos deben estar bien definidos, mientras que FM4-64 tinción debe ser brillante y claro 4-7. Imágenes de las buenas prácticas agrarias o de la membrana puede ser pseudo-color con cualquier color, para permitir la mejor calidad de imagen que se presenta sin perder ningún dato. <img src="/files/ftp_upload/1736/1736fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: Imágenes representativas de las buenas prácticas agrarias B. subtilis proteínas de fusión de traslación. proteínas GFP se muestran en verde, mientras que FM4-64 tinción de membrana se muestra en rojo. La barra de escala blanco indica 3 m (A) MutS-GFP [genotipo relevantes: mutS - GFP (CPE), amyE:: Pspac mutL (cat)]. En presencia de 600 mg / ml de 2-aminopurina y 1 mM IPTG. FM4-64 de la señal no se presenta con el fin de mostrar más claramente los focos MutS-GFP (B) MutL-GFP [genotipo relevantes: mutL:: mutL-GFP (spc)].. En presencia de 2-aminopurine (C) DNAX-GFP [genotipo relevantes: dnaX:: dnaX-GFP (spc)]. (D) Reca-GFP [pertinentes genotipo: Reca:: Reca-GFP (spc)] en presencia de 20 ng / ml de mitomicina C (E) TAGC-GFP [genotipo relevantes: TAGC:: TAGC-GFP (SPC) ] en presencia de 1 mg / ml de mitomicina C. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Tratamiento / concentración o la cantidad </td><td> Función </td><td> Tiempo de incubación </td></tr><tr><td> La mitomicina C (MMC) [20 a 150 ng / ml] </td><td> ADN con fármacos alquilantes </td><td> 1 hora </td></tr><tr><td> 2-aminopurine (2-AP) [600 mg / ml] </td><td> desajuste inducir </td><td> 1 hora </td></tr><tr><td> La hidroxiurea (HU) </td><td> agota dNTPs </td><td> 3 horas </td></tr><tr><td> la luz ultravioleta (UV) 20 J/m2 </td><td> Timina-timina dímeros y fotoproductos 6-4 </td><td> varía dependiendo de la fuente, unos 20 segundos </td></tr><tr><td> grises (radiación ionizante) 5 a 100 Gy </td><td> Doble cadena se rompe, se rompe una sola cadena y sitios de base de los daños </td><td> varía dependiendo de la fuente </td></tr></tbody></table>"&gt; La Tabla 1. Resumen de dañar el ADN y los tratamientos de inducción de desajuste <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Multitest de diapositivas, de 15, así </td><td> MP Biomedicals </td><td> 6041505E </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio de vidrio cubierta </td><td> Pescador </td><td> 12 a 544-B </td><td></td></tr><tr><td> Agarosa </td><td> Pescador </td><td> BP160-500 </td><td></td></tr><tr><td> Mitomicina C </td><td> Sigma </td><td> M0503-2MG </td><td> mutágeno, use guantes </td></tr><tr><td> 2-aminopurine </td><td> Sigma </td><td> A3509-250MG </td><td> guantes </td></tr><tr><td> Hidroxiurea </td><td> Sigma </td><td> H8627-25G </td><td> guantes </td></tr><tr><td> FM4-64 </td><td> Invitrogen </td><td> T13320 </td><td> sensible a la luz </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Lista de los reactivos y equipos específicos:

<ol><li>Hardwood, C. R., Cutting, S. M. Molecular Biological Methods for Bacillus. , John Wiley and Sons. Chichester. (1990).</li>
<li>Berkmen, M. B., Grossman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+organization+of+the+Bacillus+subtilis+replication+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal organization of the Bacillus subtilis replication cycle.</a> Mol. Microbiol. 62, 57-71 (2006).</li>
<li>Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clp+and+Lon+proteases+occupy+distinct+subcellular+positions+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Clp and Lon proteases occupy distinct subcellular positions in Bacillus subtilis.</a> J. Bacteriol. 190, 6758-6768 (2008).</li>
<li>Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+is+required+for+the+RecA+localization+response+to+DNA+damage+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Replication is required for the RecA localization response to DNA damage in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 1360-1365 (2007).</li>
<li>Simmons, L. A., Davies, B. W., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((b+Clamp+Directs+Localization+of+Mismatch+Repair+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">b Clamp Directs Localization of Mismatch Repair in Bacillus subtilis.</a> Mol. Cell. 29, 291-301 (2008).</li>
<li>Simmons, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+responses+to+double-strand+breaks+between+Escherichia+coli+and+Bacillus+subtilis+reveals+different+requirements+for+SOS+induction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction.</a> J. Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).</li>
<li>Smith, B. T., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+mismatch+repair+in+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of mismatch repair in bacterial cells.</a> Mol. Cell. 8, 1197-1206 (2001).</li>
</ol>

Ensayo y error están obligados a encontrar las condiciones de exposición de las imágenes de mayor calidad para cada cepa, nos encontramos con que una milésima de segundo es apropiado para las imágenes de luz blanca, mientras que las exposiciones de 100 a 2000 ms son apropiados para las buenas prácticas agrarias (FITC) y FM4 64 (TRITC ) imágenes. Tiempo de exposición puede variar en función de los equipos de imágenes utilizados. Se recomienda el uso de una cepa por portaobjetos de microscopio de 15 y para el más simple d...

Recetas específicas solución 1: S7 10x 50 sales 0,5 M MOPS 100 mM de sulfato de amonio 50 mM fosfato de potasio monobásico Filtro de esterilización, y el abrigo S7 50 medios de comunicación en papel de aluminio antes de su almacenamiento Metales 100x 0,2 M de MgCl2 70 mM de CaCl2 5 mM MnCl2 0,1 mM ZnCl2 100 mg / ml Tiamina HCl 2 mM HCl 0,5 mM FeCl 3 * dH 2 O al volumen final * FeCl 3 se añade al final, para evitar la precipitación. Después de la esterilización de filtros, envuelva 100x solución de metal en lámina. S7 50 medios de comunicación 1x S7 50 sales 1x metal 1% de glucosa 0,1% de glutamato 40 mg / mL de triptófano 40 mg / mL de fenilalanina H 2 O destilada a volumen final Spizizens 10x (g / L) 151,4 mM de sulfato de amonio (20 g / L) 803,8 mM fosfato de potasio monobásico (140 g / L) 440,9 mM fosfato de potasio dibásico (60 g / L) 34,0 mM citrato de sodio (10 g / L) 16,6 mM MgSO 4 (2 g / L) dH 2 O al volumen final Filtro de esterilización

imágenes de reparación del adn y la respuesta celular al daño del adn en bacillus subtilis</em

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Tanto en procariotas y eucariotas responden al daño del ADN a través de una compleja serie de cambios fisiológicos. Alteraciones en la expresión génica, la redistribución de las proteínas existentes, y el montaje de nuevos complejos de proteínas puede ser estimulada por una variedad de lesiones en el ADN y no coincidentes de pares de bases del ADN. Microscopía de fluorescencia se ha utilizado como una poderosa herramienta experimental para la visualización y cuantificación de estas y otras respuestas a las lesiones del ADN y para supervisar el estado de replicación del ADN dentro de la compleja estructura subcelular de una célula viva. Fusiones traduccionales entre las proteínas fluorescentes reportero y los componentes de la replicación del ADN y la maquinaria de reparación se han utilizado para determinar las señales que se dirigen a proteínas de reparación del ADN de sus lesiones afines<em&gt; In vivo</em&gt; Y para entender cómo estas proteínas se organizan dentro de las células bacterianas. Además, las fusiones de transcripción y traducción vinculados a los promotores de ADN inducible daños han revelado que las células dentro de una población ha activado las respuestas de estrés genotóxico. En esta revisión, nos proporcionan un protocolo detallado para el uso de microscopía de fluorescencia a la imagen de la asamblea de la reparación del ADN y los complejos de replicación del ADN en las células bacterianas individuales. En particular, este trabajo se centra en las proteínas de reparación del ADN de imagen, la recombinación homóloga, la replicación del ADN y una proteína de SOS-inducible en<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt;. Todos los procedimientos aquí descritos son fácilmente susceptibles de complejos de proteínas de imágenes en una variedad de especies bacterianas.

Un protocolo detallado se describe para la formación de imágenes en tiempo real de los complejos de reparación del ADN en<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt; Células.

Imágenes de reparación del ADN y la respuesta celular al daño del ADN en Bacillus subtilis</em

Tanto los procariotas como los eucariotas responden al daño del ADN mediante un conjunto complejo de cambios fisiológicos. Las alteraciones en la expresión génica, la redistribución...

Se siembran cepas TLU de Baus que portan fusiones traduccionales de reparación de errores de apareamiento. Las proteínas fusionadas a GFP se siembran en forma de estrías sobre medio selectivo. Las células de las estrías se utilizan como inóculo fresco para cultivo líquido.Las células se cultivan hasta que la DO 600 alcance entre 0,3 y 0,4, momento en el cual se aplican los tratamientos que inducen desajustes, según se desee, y se continúa el crecimiento celular hasta alcanzar una DO 600 de 0,5 a 0,8, punto en el cual se retiran las células. Se añade el colorante de membrana FM 4-64 si se desea, y las células se colocan sobre portaobjetos con almohadillas aros preparadas, permitiendo que se sedimenten tras la eliminación del medio en exceso mediante aspiración.Se aplica un cubreobjetos y las células se visualizan mediante microscopía. Hola, soy el Dr. Andrew Kow del laboratorio del Dr. Lyle Simmons del Departamento de Biología Molecular, Celular y del Desarrollo de la Universidad de Michigan Ann Arbor. Hoy les mostraremos un procedimiento utilizado para visualizar fusiones traducidas de las proteínas de reparación de errores del ADN, así como otras proteínas de reparación y ribosoma

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Biología

Se presenta un procedimiento por el cual puede ser de dos dimensiones de agarosa-gel de análisis para identificar la estructura de los intermediarios de replicación que se producen después de la irradiación UV.

Visualización de intermediarios de replicación inducidos por UV en E. coli Con dos dimensiones-gel de agarosa Análisis

Las imágenes espectroscópicas electrónicas pueden obtener imágenes y distinguir el ácido nucleico de la proteína con una resolución nanométrica. Se puede combinar con el sistema miniSOG, que es capaz de etiquetar específicamente proteínas marcadas en muestras de microscopía electrónica de transmisión. Ilustramos el uso de estas tecnologías utilizando como ejemplo los focos de reparación de roturas de doble cadena.

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Confocal de la fluorescencia microscopía láser micro-irradiación oferta herramientas y para inducir daño en el ADN y control de la respuesta de proteínas de reparación del ADN en áreas seleccionadas de las nucleares. Esta técnica ha avanzado significativamente nuestro conocimiento de detección de daño, las señales y reclutamiento. Este manuscrito muestra estas tecnologías para examinar reparación de rotura de filamento solo y doble.

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No se ha establecido completamente la respuesta de daño del ADN inducida por radiación activada por el haz mixto de neutrones utilizado en la terapia de captura de neutrones de boro (BNCT). Este protocolo proporciona un procedimiento paso a paso para detectar focos inducidos por radiación (RIF) de proteínas de reparación mediante tinción de inmunofluorescencia en líneas celulares de cáncer de colon humano después de la irradiación con el haz mezclado con neutrones.

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Después del daño del ADN, las células humanas activan vías de reparación esenciales para restaurar la integridad de su genoma. Aquí, describimos el método de inmunofluorescencia indirecta como un medio para detectar proteínas de reparación del ADN, analizar su reclutamiento espacial y temporal, y ayudar a interrogar la interacción proteína-proteína en los sitios de daño del ADN.

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