Name: Un método mejorado para el aislamiento de ARN a partir de pino taeda ( P. taeda L.) y otras especies de coníferas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-22T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Aprende un método mejorado para aislar ARN de alta calidad a partir de tejidos de xilema y floema de Pinus taeda. Esta técnica supera los desafíos de fenólicos y polisacáridos para análisis genómicos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nos gustaría agradecer a las siguientes personas, sin cuya ayuda la colección de tejidos de pino, no habría sido posible: el Dr. Joe Nairn, Bryman Matt, Michael Burdeos, Bagal Ujwal, Jin Huizhe y Bouffier Amanda.

Parte 1: Cosecha de árboles Después de que el árbol se selecciona y se cortan, es importante trabajar con cuidado y lo más rápidamente posible. Como cada tipo de tejido diferentes se cosecha, se deben colocar inmediatamente en sus propios barcos de nitrógeno líquido para evitar la contaminación cruzada de muestras. Este protocolo de aislamiento de ARN es escalable. <ol><li> Cortar los pernos en longitudes de aproximadamente 0,5-0,75 m y con una puntuación de motosierra de la corteza en dos o tres lugares, siguiendo el eje longitudinal del tornillo. </li><li> Utilizando un cincel de madera, el trabajo del borde de la región anotaron hasta la corteza comienza a separarse de la madera y seguir trabajando el cincel al tiempo que tira de nuevo en la sección de la corteza hasta que se separe por completo de la madre. </li><li> Xilema secundario se cosecha con un borde recto, de un solo lado de afeitar raspando a lo largo del eje longitudinal del tornillo que ha sido despojado de la corteza. Use guantes de látex para minimizar la contaminación de los tejidos. </li><li> Floema, que se encuentra en el lado interno de las secciones de la corteza, es fácilmente capturado por manual de pelar. </li><li> Madera de reacción se obtiene de la parte inferior de las extremidades después de marcarlos con pintura en aerosol para indicar su orientación original con respecto al suelo. </li><li> Las extremidades son cortadas en los tornillos de 2.1 m, y anotó en los lados opuestos a lo largo del eje longitudinal de acuerdo con la ubicación aproximada de los dos tipos de madera de reacción: madera opuesta (en la parte superior de la extremidad) y madera de compresión (en la parte inferior lado de la extremidad). La corteza se separa de la extremidad como se describió anteriormente, excepto que sólo la corteza que cubre cada tipo de madera de reacción se elimina de una vez. Xilema secundario o floema se recoge como se describe arriba y se colocan en nitrógeno líquido. </li><li> Otras muestras, tales como agujas, puntas de los brotes y los conos de los jóvenes, pueden ser cosechadas a mano o con tijeras de podar cuando sea necesario. </li><li> Las muestras recogidas se congelan en nitrógeno líquido debe ser colocado en bolsas o recipientes adecuados marcados y envasados ​​en hielo seco para que el traslado al laboratorio. </li></ol> Parte 2: Procesamiento de Freezer Mill de las muestras <ol><li> Llenar el depósito de molino Spex 6850 congelador de nitrógeno líquido y coloque la barra de impacto en uno de los viales de molienda y rellenar con nitrógeno líquido para pre-chill. Verter el nitrógeno líquido y añadir la muestra al vial. </li><li> Asegúrese de que el exceso de líquido de nitrógeno no permanece en la cámara de molienda y que el exceso de nitrógeno gas es ventilado completamente antes de que la tapa está sentado para sellar la cámara. </li><li> Introduzca el vial de molienda en el soporte y cerrar. </li><li> Molino de muestras de madera de dos ciclos de 1 minuto / ciclo en un ajuste de velocidad de 14. </li><li> Use una espátula de nitrógeno líquido refrigerado para extraer la muestra molida (harina de madera) en un vaso que ha sido pre-enfriado y contiene una pequeña cantidad de nitrógeno líquido. </li><li> Vierta el líquido de nitrógeno / muestra mezcla en un recipiente de almacenamiento y el lugar a -80 ° C hasta que se necesite. </li></ol> Parte 3: el aislamiento de ARN, el día 1 <ol><li> Coloque 20 ml de tampón de aislamiento de ARN en un tubo de 50 ml tapado Falcon y añadir 400 l β-mercaptoetanol, vortex brevemente, y luego el calor en un baño de agua a 60 º C. </li><li> Añadir 4 g de tejido congelado para cada tubo. Tapa y agitar a mano seguido por agitación durante 10 segundos. </li><li> Añadir un volumen igual de cloroformo en el tubo e invierta para mezclar suavemente. Coloque el tubo en una rueda giratoria y permitir que de extremo a extremo la mezcla durante 5 minutos. </li><li> Decantar la mezcla en un tubo de 50 ml de Oak Ridge y centrifugar a 12.000 (17.200 xg) rpm en un SS34 rotor de ángulo fijo durante 5 minutos. </li><li> Pasar la fase acuosa a un tubo de Oak Ridge fresco y añadir un medio volumen de cloroformo. </li><li> Vortex durante 1 minuto y seguir mezclando en una rueda giratoria durante 5 minutos. Centrifugar a 12.000 rpm (17.200 xg) en un rotor de ángulo fijo SS34 durante 5 minutos. </li><li> Pasar la fase acuosa a un tubo nuevo de Oak Ridge y añadir un medio volumen de cloroformo. Vortex durante 1 minuto. Centrifugar a 12.000 rpm (17.200 xg) en un rotor de ángulo fijo SS34 durante 10 minutos. </li><li> Pasar la fase acuosa a un tubo de 50 ml de polipropileno de alta velocidad. Centrifugar a 10.000 rpm (11.900 xg) en un rotor de ángulo fijo SS34 durante 20 minutos. </li><li> Decantar el sobrenadante en tubos Falcon de 50 ml y añadir un cuarto de volumen de 10 M a la solución de LiCl sobrenadante. Agitar brevemente y refrigerarlas a 4 ° C para la precipitación de la noche. </li></ol> Parte 4: el aislamiento de ARN, Día 2 <ol><li> Calor buffer SSTE en un baño de 65 ° C el agua antes de comenzar. </li><li> Vierta la muestra de LiCl precipita en un tubo de polipropileno y el ARN precipitado por centrifugación a 11.000 rpm en un rotor de ángulo fijo SS34 (14.450 xg) durante 30 minutos a 4 ° C. </li><li> Después de la centrifugación,Retirar y desechar el líquido, e invertir los tubos en Kimwipes durante aproximadamente 1 minuto. Pipeta de cualquier resto de sobrenadante. </li><li> Resuspender cada pellet en 800 l de SSTE calienta por medio de una pipeta para mezclar bien las muestras. Transferir la muestra se resuspendieron a 2 ml tubos de microcentrífuga Ambion RNasa libre. </li><li> Muestras de calor a 65 ° C durante 2 minutos, seguido por agitación vigorosa para asegurar la completa resuspensión. </li><li> Añadir un volumen igual de fenol-cloroformo, pH 8, a cada tubo de muestra. Vortex cada muestra durante 30 segundos y luego girar en una microcentrífuga a 14.000 rpm durante 3 minutos </li><li> Pasar la fase acuosa a un nuevo tubo de microcentrífuga de 2 ml Ambion RNasa libre, y añadir un volumen igual de cloroformo. Vortex cada muestra durante 30 segundos y girar en la microcentrífuga a 14.000 rpm durante 3 minutos. </li><li> Transferencia de fase acuosa a tubos de gel de enganche de fase, que han sido previamente preparados por microfuging a 11.000 rpm durante 2 minutos. Añadir la mitad de volumen de cloroformo y suavemente la pipeta para mezclar. </li><li> Centrifugar a 11.000 rpm durante 5 minutos y la transferencia de la fase acuosa a un nuevo tubo 2 ml de microfuga Ambion RNasa libre. </li></ol> Parte 5: ARN de precipitación y lavado de etanol <ol><li> Añadir 50 l de acetato de sodio 3,0 M, pH 4,8, y 1 ml de etanol al 100% a la fase acuosa. Vortex y precipitado en -80 ° C durante 30 minutos o toda la noche a -20 ° C. </li><li> Muestras de microcentrífuga a 14.000 rpm durante 30 minutos a 4 ° C, y cuidado aspirar el sobrenadante. No moleste a la bolita. </li><li> Lavar los gránulos de ARN con 1 ml -20 ° C 70% (v / v) de etanol. Microfuga a 14.000 rpm durante 1 minuto y aspirar el etanol. </li><li> Repita el paso 5.3. </li><li> Destape los tubos y los pellets de aire seco en el banquillo durante 3-5 minutos. </li></ol> Parte 6: resuspensión final y cuantificación <ol><li> Resuspender cada pellet en 100 l agua tratada con DEPC. Mezclar por agitación e incubar los tubos a 65 ° C durante 2 minutos antes de colocar en el hielo. Repita si es necesario para asegurar la resuspensión de la muestra. </li><li> Piscina como muestras si así lo desea y hacer 50 l de una dilución de 1:10 en 10 mM Tris, pH 7,5, para la cuantificación espectrofotométrica. Razón de absorbancia de 260/280 y 260/230 son típicamente mayores de 2.1 y 2.2, respectivamente. El aislamiento de ARN rendimientos oscilan entre 60-120μg / g de tejido congelado. </li><li> Analizar las muestras mediante la ejecución de 1,5-2,5 mg de ARN en un 1% en gel de agarosa en buffer TAE. Para más muestras de crítica, analizar el ARN utilizando un Agilent 2100 Bioanalyzer según las instrucciones del fabricante. </li></ol> Los resultados representativos: Los rendimientos de aislamiento de ARN de coníferas diferentes tejidos rango 60 a 120 mg / g de tejido congelado, con muestras de madera suelen ceder en torno al 70-80g / g de tejido congelado. Ratios de diagnóstico de 260/280 y 260/230 son por lo general mayor que 2.1, y son buenos indicadores de que la muestra de ARN está libre de cualquier contaminación o fenólicos importante de hidratos de carbono, respectivamente. Las muestras analizadas por electroforesis en gel de agarosa seguida de tinción EtBr debe mostrar tres bandas distintas de 25S, 18S y 5S ARN (Figura 1). La determinación de la estequiometría de la 28S a 18S en geles de agarosa es algo subjetivo, y factores tales como condiciones de funcionamiento para el gel, las manchas, y la carga de probar todos pueden tener un efecto. En general, el 28S: 18S relación se parecen ser&gt; 1,5. Sin embargo, algunas muestras de coníferas tienen menores proporciones. Por ejemplo, tras el análisis de Agilent 2100 hemos visto varios casos de muestras de coníferas de diferentes tipos de tejidos, donde la estequiometría está más cerca de 1,2:1. Por lo tanto, una aparente baja 28S: 18S estequiometría por electroforesis en gel de agarosa no indica necesariamente una muestra de mala calidad. Hoja, disparar, y las muestras de cono a menudo tienen más distintas bandas presentes debido a cloroplástico ARN ribosomal. EtBr manchado de materiales que no emigran de la muestra bien o bandas de alta masa molecular (&gt; 10.8 kb) por lo general indican la contaminación de ADN genómico (Figura 2). Frotis bajo peso molecular en las proximidades o debajo de la banda 5S y tinción reducida banda ribosomal 18S o un aparente&gt; estequiometría 28S es un buen indicador de que se ha producido la degradación del ARN (Figura 3). En el análisis electroferograma Agilent 2100, la línea de base debe ser baja y relativamente lisa, con picos principales correspondientes a los ARN 18S y 28S ribosomal 28S con: 18S ratios que van en cualquier lugar desde 1,2 hasta 2,0. El número de Agilent integridad del ARN (RIN) de valor puede ser un mejor predictor de la calidad del ARN y debe ser por lo menos 7 o superior para el ARN que se va a utilizar para la preparación de los objetivos de microarrays. La Figura 4 muestra una típica Agilent 2100 electroferograma para el ARN del xilema con un 28S: 18S proporción igual a 1,4 y un valor de RIN de 8,6 mientras que la Figura 5 se muestra un xilema pobres ARN de preparación con una base muy alta y la degradación notable como lo revela el 28S: 18S raigual a 0,65 y un valor de RIN de 3,4 tio. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Agarosa análisis en gel de ARN de pino de alta calidad. Calle 1, ORC 1 kb estándar, Carril 2 muestra un típico aislamiento de ARN total de pino tea xilema secundario con características ribosomal 28S, 18S, 5S y las bandas y la aparente 28S: relación de 18S&gt; 1. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Análisis en gel de agarosa de pino muestra de ARN contaminadas con ADN genómico. Calle 1, ORC 1 kb estándar, Calle 2, xilema muestra de ARN que muestra la contaminación de ADN genómico. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Agarosa gel de análisis de la muestra de pino que muestra la degradación del RNA y de la contaminación con ADN genómico. Calle 1, ORC 1 kb estándar, Lane2, xilema muestra de ARN que muestra la contaminación de ADN genómico y severa degradación del ARN. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Agilent 2100 electroferograma de ARN total xilema aislado utilizando el método descrito en el xilema pino tea. 28S: 18S relación de igual a 1,4, el valor de RIN equivale a 8,6 <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Agilent 2100 electroferograma de ARN total de la punta apical que muestra una severa degradación y la contaminación genómica. 28S: 18S relación de igual a 0,65, el valor de RIN equivale a 3,4

<ol><li>Chang, S., Puryear, J., Cairney, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+efficient+method+for+extracting+RNA+from+pine+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Reporter%22%5BJournal%5D)">A simple and efficient method for extracting RNA from pine trees.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 113-116 (1993).</li>
<li>Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Siműes, M., Dean, J. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+the+Loblolly+Pine+PtGen2+cDNA+Microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray.</a> Journal of Visualized Experiments. 25, (2009).</li>
</ol>

La obtención de ARN de alta calidad a partir de especies de coníferas puede ser una tarea difícil debido a los altos niveles de compuestos fenólicos y polisacáridos se encuentran en los tejidos leñosos. Comenzando con el protocolo desarrollado por Chang et al. (1), hemos encontrado que la extracción de más riguroso y limpieza de los pasos conducen al aislamiento constante de muy alta calidad total de ARN de varios tejidos leñosos no maderables en la muestra de una gran variedad de especies de coníferas. Este vídeo ha de...

<table><tbody><tr><td>Buffer de aislamiento de ARN</td><td></td><td></td><td>2% CTAB (bromuro de hexadeciltrimetilamonio), 2% PVP (polivinilpirrolidona; Mw 30-40.000), 100 mM Tris-HCl (pH 8,0), 25 mM EDTA, 2,0 M NaCl, 0,5 g/L espermidina</td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Fisher Scientific</td><td>C298-4</td><td></td></tr><tr><td>Fenol, ultrapuro</td><td>Invitrogen</td><td>15509-037</td><td></td></tr><tr><td>LiCl 10 M</td><td></td><td></td><td>Preparado con agua tratada con DEPC</td></tr><tr><td>Buffer SSTE</td><td></td><td></td><td>1 M NaCl, 0,5% SDS, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0)</td></tr><tr><td>Acetato de sodio (NaOAc) 3 M, pH 4,8</td><td></td><td></td><td>Preparado con agua tratada con DEPC</td></tr><tr><td>Fenol-cloroformo (pH 8,0)</td><td></td><td></td><td>120 mL de fenol, 160 mL de cloroformo, titulado con varias renovaciones de Tris-Cl 0,5 M, pH 8,0</td></tr><tr><td>Tubos de teflón para alta velocidad Oak Ridge</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>#05-562-16B</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de polipropileno de 50 mL para alta velocidad</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>#05-562-10K</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos desechables estériles de 50 mL con tapa BD Falcon</td><td>VWR international</td><td>#21008-939</td><td></td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Heavy, 2 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>#2302830</td><td></td></tr><tr><td>Tubos microcéntrifugos Ambion libres de RNasa, 2 mL</td><td>Ambion</td><td>#AM12425</td><td></td></tr></tbody></table>

un método mejorado para el aislamiento de arn a partir de pino taeda ( p. taeda l.) y otras especies de coníferas

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine (P. taeda L.) and Other Conifer Species

Tejidos aislados de especies de coníferas, en especial los que pertenecen a la familia Pinaceae, como el pino taeda (<em&gt; Pinus taeda</em&gt; L.), contienen altas concentraciones de compuestos fenólicos y polisacáridos que interfieren con la purificación de ARN. Aislamiento de ARN de alta calidad de estas especies requiere de rigurosos procedimientos de recogida de tejidos en el campo y el empleo de un protocolo de aislamiento de ARN consta de varios pasos de extracción orgánica con el fin de aislar el ARN de calidad suficiente para microarrays y otros análisis genómico. El aislamiento de ARN de alta calidad desde el campo las muestras recogidas pino de incienso puede ser un reto, pero varias modificaciones en los tejidos y los procedimientos estándar de aislamiento de ARN en gran medida a mejorar los resultados. El grado de general de la degradación del ARN aumenta si las muestras no están debidamente recogidos y transportados desde el campo, sobre todo en gran escala de las cosechas. Total de los rendimientos de ARN se puede aumentar de manera significativa por las muestras de pulverización en un molino de nitrógeno líquido antes de la congelación de aislamiento de ARN, especialmente cuando las muestras proceden de los tejidos leñosos. Esto se debe principalmente a la presencia de agentes oxidantes, como los compuestos fenólicos y polisacáridos que están presentes en altos niveles en los extractos de los tejidos leñosos de las especies más coníferas. Si no se elimina, estos contaminantes pueden llevar a más de los principales problemas, como la degradación del ARN, que se traducen en bajos rendimientos y una muestra de la mala calidad del ARN. El arrastre de los compuestos fenólicos, así como los polisacáridos, también puede reducir o incluso eliminar por completo la actividad de la transcriptasa inversa o polimerasas otros de uso común para la síntesis de cDNA. En particular, el ARN destinado a ser utilizado como molde para la doble cadena de síntesis de ADNc en la generación de bibliotecas de ADNc de una sola hebra de síntesis de ADNc por PCR o de PCR cuantitativa, o para la síntesis de materiales de destino de microarrays deben ser de la más alta calidad si los investigadores esperan que para obtener resultados óptimos. Técnicas de aislamiento de ARN comúnmente empleados para muchas especies de plantas son a menudo insuficientes en su capacidad para eliminar estos contaminantes a partir de muestras de coníferas y por lo tanto no dan muestras de ARN total adecuado para manipulaciones posteriores. En este video se demuestra métodos para la recogida de campo de los tejidos de coníferas, a partir de la tala de un cuarenta años de edad del árbol, para la recolección de floema, xilema secundario y xilema madera de reacción. También demuestran un protocolo de aislamiento de ARN que siempre ha dado de alta calidad del ARN para su posterior manipulación enzimática.

Muchos tejidos de plantas, incluyendo el floema y el xilema de pino taeda (<em&gt; Pinus taeda</em&gt; L.), contienen altos niveles de compuestos fenólicos y polisacáridos que interfieren con la purificación de ARN. Esta presentación se analizan las técnicas para la cosecha de tejidos cultivadas en el campo y el aislamiento de ARN de calidad suficiente para microarrays y otros análisis genómico.

Un método mejorado para el aislamiento de ARN a partir de pino taeda ( P. taeda L.) y otras especies de coníferas

Los tejidos aislados de especies de coníferas, particularmente aquellas pertenecientes a la familia Pinaceae, como el pino teeda (Pinus taeda L.), contienen altas...

Lo siguiente fue producido por investigadores de la Universidad de Georgia y de la Escuela Warnell de Silvicultura y Recursos Naturales. Este video demostrativo describe la cosecha de tejido xilemático y floemático y el aislamiento subsiguiente de ARN a partir de Pinus taeda, comúnmente conocido como pino de hoja larga, que es la especie de conífera más importante para la producción de productos forestales en Estados Unidos. Una vez que el árbol ha sido talado, en este caso un árbol de 40 años, el tronco principal se corta en trozas de aproximadamente 50 centímetros de longitud.A continuación, el tronco se corta longitudinalmente en varios lugares con una motosierra para facilitar la eliminación de la corteza. Utilizando un martillo y un formón de madera, se levanta la corteza hasta que pueda pelarse en secciones. Luego, el tejido conductor se retira manualmente, se separa del interior de las secciones de corteza y se sumerge inmediatamente en nitrógeno líquido.Una vez que se ha eliminado la corteza, se puede recolectar la delgada capa de xilema secundario raspando la superficie del tronco con una cuchilla de afeitar de un solo filo. El tejido xilemático acuoso se coloca inmediatamente en nitrógeno líquido. En esta recolección, también se tomaron muestras de madera de reacción, comúnmente denominada madera de compresión y madera opuesta, antes de cortar las ramas del tallo principal.La orientación del ramo se marca primero con pintura en aerosol para determinar las áreas que contienen los dos tipos de tejido: madera opuesta en la parte superior del ramo y madera de compresión en la parte inferior. Durante la eliminación de la corteza, los ramas se cortan inicialmente con una motosierra a lo largo de líneas que delimitan la madera de compresión y la madera opuesta, y se realiza la eliminación de la corteza como en los trozos del tronco principal, excepto que solo se elimina la corteza en la región correspondiente al tipo de reacción.La madera cosechada se retira en cualquier momento dado. Por lo general, es más difícil eliminar secciones grandes de corteza de estas ramas más pequeñas. Las muestras de madera de reacción del xilema secundario se recolectan de la misma manera que el xilema secundario normal, raspando con la hoja de afeitar e inmersión inmediata en nitrógeno líquido.Observe el color pardo rojizo característico de la madera de compresión. Es importante mencionar que recolectar y procesar múltiples muestras de un árbol grande requiere muchas personas, cada una realizando una tarea designada, de modo que todos los tipos de tejido se recojan simultáneamente para ayudar a reducir la degradación del ARN; las muestras congeladas y el nitrógeno líquido se transfieren posteriormente a bolsas de almacenamiento etiquetadas y se colocan sobre hielo seco para su transporte de regreso al laboratorio. Nuestro primer paso consiste en pulverizar el tejido utilizando un molino congelador modelo 6850 de Specs; en comparación con la molienda con mortero y pistilo, este paso aumenta significativamente los rendimientos de extracción de ARN en muestras de tejido leñoso, manteniendo las muestras frías con nitrógeno líquido.El tejido se rompe primero en trozos más pequeños manualmente y se coloca en la cámara de muestra. La cámara se inserta en el portador y se fija en su lugar, y la muestra se muele durante dos minutos. El producto final tiene la consistencia de un polvo grueso.El protocolo de extracción de ARN es un proceso de dos días. En el primer día, se agregan 2,5 gramos de tejido congelado al tampón de extracción de ARN que se ha calentado a 65 grados Celsius. La muestra se agita vigorosamente para mezclarla, y se añade un volumen igual de cloroformo y se mezcla nuevamente con inversión suave.A continuación, la muestra se coloca en una rueda giratoria durante cinco minutos. Luego, la muestra se transfiere a tubos Oakridge de teflón de alta velocidad y se centrifuga en un rotor SS 34 a 12.000 RPM durante cinco minutos. La fracción acuosa superior se extrae en un tubo nuevo y se añade un volumen igual a la mitad de cloroformo.La muestra se agita en vórtex durante un minuto y luego se coloca nuevamente en la rueda rotatoria durante cinco minutos. Tras una segunda centrifugación, la fracción acuosa se extrae nuevamente en un tubo de polipropileno de alta velocidad de 50 ml y se centrifuga a 10.000 RPM durante 20 minutos. Para eliminar cualquier partícula residual, la muestra se decanta en un tubo Falcon de 50 ml y se añade un cuarto del volumen de cloruro de litio 10 molar a la muestra.La muestra se mezcla agitándola y se coloca a cuatro grados Celsius durante la noche. En el segundo día, la muestra precipitada con cloruro de litio se centrifuga primero a 11.000 RPM durante 30 minutos a cuatro grados Celsius.Se vierte y descarta el sobrenadante, y los tubos se invierten sobre toallitas químicas durante un minuto. Para eliminar cualquier líquido residual, el pellet de ARN, que debe ser visible, se resuspende en 800 microlitros de tampón SSTE caliente previamente calentado a 65 grados Celsius. Asegúrese de pipetear hacia arriba y hacia abajo varias veces y alrededor de todos los márgenes del pellet para garantizar que todo quede en solución.A continuación, transfiera el ARN reconstituido a un tubo microfuge libre de ARN de dos mil y superior. Incube la muestra durante uno o dos minutos en un baño de agua a 65 grados Celsius, seguido de vortexado para asegurar que la muestra se haya reconstituido completamente. Este paso puede repetirse si es necesario.Ahora, agregue un volumen igual de fenol cloroformado tamponado. Vortexee la muestra durante 15 a 20 segundos y centrifugue a 14.000 RPM durante tres minutos. La fracción acuosa se extrae en un nuevo tubo microfuge y se añade un volumen igual de isopropanol.La muestra se vortexea y microfusiona como en la extracción anterior. Para la fase final de extracción orgánica, los tubos con gel de bloqueo se microfunden primero a 11.000 RPM durante dos minutos.A continuación, la muestra de ARN de la extracción anterior se añade al gel de bloqueo de fase, seguido de un volumen igual a la mitad de cloroformo, y ambos se mezclan pipeteando suavemente. La muestra se microcentrifuga luego a 11.000 RPM durante cinco minutos, y la fase acuosa que contiene el ARN se transfiere a un nuevo tubo microfuga Ambion libre de ARN. El siguiente paso consiste en una sencilla precipitación del ARN, añadiendo al tubo un volumen igual a un décimo de acetato de sodio 3 M, pH 4,8, y dos volúmenes de etanol al 100%.La muestra se mezcla en vórtex, se coloca brevemente en un congelador a menos 80 grados Celsius durante 30 minutos y luego se centrifuga en microcentrífuga durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Se aspira cuidadosamente el sobrenadante y el pequeño precipitado blanco se lava con un mililitro de etanol al 70 % frío con hielo, se aspira y se repite el lavado con etanol tras la aspiración final. Se permite que el etanol residual se evapore dejando los tubos abiertos sobre la bancada durante cinco minutos.Los pellet de ARN se resuspenden en 100 microlitros de agua con DEPC y se resuspenden mediante vortex y calentamiento a 65 grados. Este paso puede repetirse si es necesario. Se determina la concentración de la muestra.Se calculan espectrofotométricamente las relaciones 2 62 80 y 2 62 30 para estimar el grado de contaminación por proteínas e hidratos de carbono en la muestra. Se utiliza electroforesis en gel de AGROS al 1 % para estimar cualitativamente la calidad de la muestra, la contaminación por ADN genómico y la degradación del ARN. La integridad de muestras críticas se evalúa adicionalmente mediante un bioanalizador Agilent 2100 para determinar las relaciones ribosomales 28 18 s y un número de integridad del ARN. Gracias por ver nuestro video sobre la recolección de muestras de tejido y el aislamiento de ARN total del pino lóbulo (LOB lolly pine).Las siguientes personas son responsables de la filmación y producción de este video de entrenamiento.

an-improved-method-rna-isolation-from-loblolly-pine-p-taeda-l-other

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

El cDNA microarrays PtGen2 fue desarrollado para estudios de expresión génica en el pino de...

Procesamiento de los Pinus taeda PtGen2 cDNA microarray

No radiactivo In situ La hibridación aplicable para el abeto rojo protocolo y una serie de especies de plantas

La expresión de genes de un subconjunto de células en un tejido específico representa un reto importante. En este artículo se describe cómo aislar el ARN total de alta calidad a partir de una población de células específicas mediante la combinación de un método immunolabeling rápida con láser captura microdissection.

Aislamiento de ARN a partir de células subpoblaciones específicas utilizando láser captura Microdissection Combinado con Rapid Immunolabeling

Las interacciones ARN-proteína se encuentran en el corazón de muchos procesos celulares. Aquí, describimos un método in vivo para aislar ARN específico e identificar nuevas proteínas que están asociadas con él. Esto podría arrojar nueva luz sobre cómo se regulan los ARN en la célula.

Nuevas proteínas de unión a ARN aislamiento por la Metodología RaPID

Hemos logrado establecer un método para el aislamiento de ARN a partir de semillas de plantas que contienen grandes cantidades de aceites, proteínas y polifenoles, que tienen efectos inhibidores sobre el aislamiento de ARN de alta pureza. Nuestro método es adecuado para monitorear la expresión de genes con transcripciones de bajo nivel en semillas.

Un método eficiente para el aislamiento de ARN altamente purificada a partir de semillas para uso en el Análisis Cuantitativo de transcriptoma

Aquí, presentamos un protocolo de rastreo genómica contaminación del ADN (gDNA) en las muestras de RNA. El método presentado utiliza cebadores específicos para la región del espaciador transcrito interno (ITS) de genes ribosómicos (rDNA) del ADN. El método es adecuado para la detección fiable y sensible de la contaminación del ADN en la mayoría de eucariotas y procariotas.

Evaluación de la contaminación del ADN en las muestras de RNA basadas en ADN Ribosomal

Este protocolo proporciona un resumen de los procedimientos para el aislamiento de ARN para los perfiles transcriptómicos de nodo de linfa tejidos de animales grandes, incluyendo pasos en la identificación y extirpación de los ganglios linfáticos de ganado y la fauna, métodos de muestreo para proporcionar consistencia en varios animales y consideraciones más resultados representativos para la conservación de la colección y procesamiento de análisis de ARN.

Recogida y tratamiento de los ganglios linfáticos de animales grandes para el análisis de ARN: preparación para estudios de nodo de linfa transcriptómicos de grandes especies animales

Aquí presentamos un enfoque y análisis bioinformáticos para identificar la expresión LINE-1 en el nivel específico del locus.

Secuenciación de próxima generación de ARN y una tubería bioinformática para identificar los LINE-1s expresados en el nivel específico de locus

Presentamos un protocolo detallado de reparación de la biblioteca de ARN pequeño con menos sesgo que los métodos estándar y una mayor sensibilidad para los ARN de 2'-O-metil. Este protocolo se puede seguir utilizando reactivos caseros para ahorrar costos o usar kits para mayor comodidad.

Mejora de ARN pequeño-seq: Menos sesgo y mejor detección de 2'-O-Metil RNAs

Este protocolo tiene como objetivo aislar los ARNm ribosómicos de traducción específicos del tipo celular utilizando el modelo de ratón NuTRAP.

Aislar ARN específicos del tipo de célula de muestras de tejido heterogéneo congeladas a presión sin clasificación celular

Describimos un método simple pero altamente reproducible para aislar el ARN extracelular de la superficie de la hoja y el apoplasto de las plantas de Arabidopsis.

Una guía paso a paso para el aislamiento y análisis de la superficie foliar y el ARN apoplásico utilizando rosetas de Arabidopsis

Aprende un método mejorado para aislar ARN de alta calidad a partir de tejidos de xilema y floema de Pinus taeda. Esta técnica supera los desafíos de fenólicos y polisacáridos para análisis genómicos.

Un método mejorado para el aislamiento de ARN a partir de pino taeda ( P. taeda L.) y otras especies de coníferas

Explorar más videos