Un método mejorado para el aislamiento de ARN a partir de pino taeda ( P. taeda L.) y otras especies de coníferas

Lo siguiente fue producido por investigadores de la Universidad de Georgia y de la Escuela Warnell de Silvicultura y Recursos Naturales. Este video demostrativo describe la cosecha de tejido xilemático y floemático y el aislamiento subsiguiente de ARN a partir de Pinus taeda, comúnmente conocido como pino de hoja larga, que es la especie de conífera más importante para la producción de productos forestales en Estados Unidos. Una vez que el árbol ha sido talado, en este caso un árbol de 40 años, el tronco principal se corta en trozas de aproximadamente 50 centímetros de longitud.

A continuación, el tronco se corta longitudinalmente en varios lugares con una motosierra para facilitar la eliminación de la corteza. Utilizando un martillo y un formón de madera, se levanta la corteza hasta que pueda pelarse en secciones. Luego, el tejido conductor se retira manualmente, se separa del interior de las secciones de corteza y se sumerge inmediatamente en nitrógeno líquido.

Una vez que se ha eliminado la corteza, se puede recolectar la delgada capa de xilema secundario raspando la superficie del tronco con una cuchilla de afeitar de un solo filo. El tejido xilemático acuoso se coloca inmediatamente en nitrógeno líquido. En esta recolección, también se tomaron muestras de madera de reacción, comúnmente denominada madera de compresión y madera opuesta, antes de cortar las ramas del tallo principal.

La orientación del ramo se marca primero con pintura en aerosol para determinar las áreas que contienen los dos tipos de tejido: madera opuesta en la parte superior del ramo y madera de compresión en la parte inferior. Durante la eliminación de la corteza, los ramas se cortan inicialmente con una motosierra a lo largo de líneas que delimitan la madera de compresión y la madera opuesta, y se realiza la eliminación de la corteza como en los trozos del tronco principal, excepto que solo se elimina la corteza en la región correspondiente al tipo de reacción.

La madera cosechada se retira en cualquier momento dado. Por lo general, es más difícil eliminar secciones grandes de corteza de estas ramas más pequeñas. Las muestras de madera de reacción del xilema secundario se recolectan de la misma manera que el xilema secundario normal, raspando con la hoja de afeitar e inmersión inmediata en nitrógeno líquido.

Observe el color pardo rojizo característico de la madera de compresión. Es importante mencionar que recolectar y procesar múltiples muestras de un árbol grande requiere muchas personas, cada una realizando una tarea designada, de modo que todos los tipos de tejido se recojan simultáneamente para ayudar a reducir la degradación del ARN; las muestras congeladas y el nitrógeno líquido se transfieren posteriormente a bolsas de almacenamiento etiquetadas y se colocan sobre hielo seco para su transporte de regreso al laboratorio. Nuestro primer paso consiste en pulverizar el tejido utilizando un molino congelador modelo 6850 de Specs; en comparación con la molienda con mortero y pistilo, este paso aumenta significativamente los rendimientos de extracción de ARN en muestras de tejido leñoso, manteniendo las muestras frías con nitrógeno líquido.

El tejido se rompe primero en trozos más pequeños manualmente y se coloca en la cámara de muestra. La cámara se inserta en el portador y se fija en su lugar, y la muestra se muele durante dos minutos. El producto final tiene la consistencia de un polvo grueso.

El protocolo de extracción de ARN es un proceso de dos días. En el primer día, se agregan 2,5 gramos de tejido congelado al tampón de extracción de ARN que se ha calentado a 65 grados Celsius. La muestra se agita vigorosamente para mezclarla, y se añade un volumen igual de cloroformo y se mezcla nuevamente con inversión suave.

A continuación, la muestra se coloca en una rueda giratoria durante cinco minutos. Luego, la muestra se transfiere a tubos Oakridge de teflón de alta velocidad y se centrifuga en un rotor SS 34 a 12.000 RPM durante cinco minutos. La fracción acuosa superior se extrae en un tubo nuevo y se añade un volumen igual a la mitad de cloroformo.

La muestra se agita en vórtex durante un minuto y luego se coloca nuevamente en la rueda rotatoria durante cinco minutos. Tras una segunda centrifugación, la fracción acuosa se extrae nuevamente en un tubo de polipropileno de alta velocidad de 50 ml y se centrifuga a 10.000 RPM durante 20 minutos. Para eliminar cualquier partícula residual, la muestra se decanta en un tubo Falcon de 50 ml y se añade un cuarto del volumen de cloruro de litio 10 molar a la muestra.

La muestra se mezcla agitándola y se coloca a cuatro grados Celsius durante la noche. En el segundo día, la muestra precipitada con cloruro de litio se centrifuga primero a 11.000 RPM durante 30 minutos a cuatro grados Celsius.

Se vierte y descarta el sobrenadante, y los tubos se invierten sobre toallitas químicas durante un minuto. Para eliminar cualquier líquido residual, el pellet de ARN, que debe ser visible, se resuspende en 800 microlitros de tampón SSTE caliente previamente calentado a 65 grados Celsius. Asegúrese de pipetear hacia arriba y hacia abajo varias veces y alrededor de todos los márgenes del pellet para garantizar que todo quede en solución.

A continuación, transfiera el ARN reconstituido a un tubo microfuge libre de ARN de dos mil y superior. Incube la muestra durante uno o dos minutos en un baño de agua a 65 grados Celsius, seguido de vortexado para asegurar que la muestra se haya reconstituido completamente. Este paso puede repetirse si es necesario.

Ahora, agregue un volumen igual de fenol cloroformado tamponado. Vortexee la muestra durante 15 a 20 segundos y centrifugue a 14.000 RPM durante tres minutos. La fracción acuosa se extrae en un nuevo tubo microfuge y se añade un volumen igual de isopropanol.

La muestra se vortexea y microfusiona como en la extracción anterior. Para la fase final de extracción orgánica, los tubos con gel de bloqueo se microfunden primero a 11.000 RPM durante dos minutos.

A continuación, la muestra de ARN de la extracción anterior se añade al gel de bloqueo de fase, seguido de un volumen igual a la mitad de cloroformo, y ambos se mezclan pipeteando suavemente. La muestra se microcentrifuga luego a 11.000 RPM durante cinco minutos, y la fase acuosa que contiene el ARN se transfiere a un nuevo tubo microfuga Ambion libre de ARN. El siguiente paso consiste en una sencilla precipitación del ARN, añadiendo al tubo un volumen igual a un décimo de acetato de sodio 3 M, pH 4,8, y dos volúmenes de etanol al 100%.

La muestra se mezcla en vórtex, se coloca brevemente en un congelador a menos 80 grados Celsius durante 30 minutos y luego se centrifuga en microcentrífuga durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Se aspira cuidadosamente el sobrenadante y el pequeño precipitado blanco se lava con un mililitro de etanol al 70 % frío con hielo, se aspira y se repite el lavado con etanol tras la aspiración final. Se permite que el etanol residual se evapore dejando los tubos abiertos sobre la bancada durante cinco minutos.

Los pellet de ARN se resuspenden en 100 microlitros de agua con DEPC y se resuspenden mediante vortex y calentamiento a 65 grados. Este paso puede repetirse si es necesario. Se determina la concentración de la muestra.

Se calculan espectrofotométricamente las relaciones 2 62 80 y 2 62 30 para estimar el grado de contaminación por proteínas e hidratos de carbono en la muestra. Se utiliza electroforesis en gel de AGROS al 1 % para estimar cualitativamente la calidad de la muestra, la contaminación por ADN genómico y la degradación del ARN. La integridad de muestras críticas se evalúa adicionalmente mediante un bioanalizador Agilent 2100 para determinar las relaciones ribosomales 28 18 s y un número de integridad del ARN. Gracias por ver nuestro video sobre la recolección de muestras de tejido y el aislamiento de ARN total del pino lóbulo (LOB lolly pine).

Las siguientes personas son responsables de la filmación y producción de este video de entrenamiento.